莜麦麸中β_葡聚糖的提取与纯化 - 副本

莜麦麸中β-葡聚糖的提取与纯化宋雪梅,韩舜愈,祝　霞,何文兵(甘肃农业大学食品科学与工程学院,甘肃兰州　730070) 摘要:通过研究料液比、温度、p H值和提取时间等单因素对莜麦麸中β-葡聚糖提取率的影响,设计多因素试验,利用正交试验优化工艺,筛选出了提取β-葡聚糖的最佳组合:温度75℃、p H10、料液比1∶17、提取时间2h.同时,分别讨论了不同方法脱除蛋白质、不同溶剂沉淀β-葡聚糖以及不同酒精度下醇析β-葡聚糖等关键工艺. 关键词:莜麦麸皮;β-葡聚糖;提取;纯化 中图分类号:TS201.1 文献标识码:A 文章编号:100324315(2006)022*******Extraction and purification ofβ-glucan in oat branSON G Xue2mei,HAN Shun2yu,ZHU Xia,H E Wen2bing(College of Food Science and Engineering,G ansu Agricultural University,Lanzhou730070,China) Abstract:On t he base of test of single factor by ort hogonal table,t he optimal technology parameters were cho sen as75℃,10of p H,ratio of liquid to solid1∶17,and ext racting time for2h.Furt hermore, some important techniques were also discussed on p rotein removed met hods,β-glucan precipitated sol2 vent s and separation wit h different amount of alcohol respectively. K ey w ords:oat bran;β-glucan;ext raction;p urificatin 莜麦是我国高寒山区特有的优质杂粮之一,主要分布在内蒙古、山西、河北、甘肃等地.与其他谷物相比,莜麦除富含蛋白质、不饱和脂肪酸之外,还含有丰富的β-葡聚糖.β-葡聚糖是葡萄糖由β-(1→3)和β-(1→4)糖苷键连接而成的线性非淀粉多糖,主要分布在糊粉层和亚糊粉层.β-葡聚糖的水溶液具有粘性,可以作为增稠剂,此外,由于它还具有降血胆固醇,降血糖,改善肠道功能以及提高免疫力和抗肿瘤等作用[1,2],因此可以作为营养添加剂.由于莜麦的品种和生长环境的不同,莜麦中β-葡聚糖的含量也不同[3,4].本文选用甘肃省优质莜麦作为试验材料,进行β-葡聚糖提取的单因素和多作者简介:宋雪梅(1980-),女,甘肃天水人,在读硕士研究生,主要从事农产品加工及功能成分的研究.资助基金:甘肃省科技攻关(HS025-A41).通讯作者:韩舜愈,男,主要从事农产品加工工艺、果品蔬菜功能成分及分味物质研究.E-mail:lzhansy@收稿日期:2005-10-13因素试验,同时对β-葡聚糖的纯化进行了研究.1　材料和方法1.1　试剂和设备1.1.1　试剂　β-葡聚糖酶(NOVO公司)、β-葡聚糖苷酶(Wort hington公司)、葡萄糖氧化酶(AM RESCO公司)、过氧化物酶(BB I公司)、950mL/L 的食品级酒精、异丙醇、硫酸铵、葡萄糖、正丁醇、氯仿均为分析纯;胰蛋白酶(上海惠世生化试剂有限公司)、α-淀粉酶(北京奥博星生物技术有限责任公司)、牛血清白蛋白(国药集团化学试剂有限公司)均为生化试剂.1.1.2　设备　721型分光光度计(上海第三分析仪器厂);H H-W420数显三用恒温水箱(江苏省金坛市荣华仪器制造有限公司);LD4-2A低速离心机(北京医用离心机厂);FZ102微型植物试样粉碎机(北京市永光明医疗仪器厂);P HS-3型数字酸度计(金坛市自动化仪器厂);RE-5298旋转蒸发器2006年4月第2期83～87甘　肃　农　业　大　学　学　报J OU RNAL OF GANSU A GRICUL TURAL UNIV ERSIT Y第41卷双月刊(上海亚荣生化仪器厂);U-2800分光光度计(Hi2 tachi High-Technologies Corporation Tokyo J a2 pan).1.2　提取工艺 莜麦→清理筛选→粉碎→过筛→干燥→燕麦麸→去脂肪→灭酶→脱溶→粉碎→过筛(60目)→去淀粉→碱提取→离心(4000r/min)→上清液(粗提液)→去淀粉→去蛋白质→醇析→离心→沉淀→干燥→β-葡聚糖粗品.1.3　试验方法与设计1.3.1　β-葡聚糖含量的测定　参照AOAC995. 16[5]. 以葡萄糖为标准样品制作标准曲线,标准曲线为y=2.257x+0.003(y为吸光度值,x为葡糖的浓度mg/mL),R2=0.9998.1.3.2　多糖含量的测定　采用苯酚-硫酸法[6]. 以葡萄糖为标准样品制作标准曲线,标准曲线为y=0.0101x-0.0053(y为吸光度值,x为葡萄糖的浓度μg/mL),R2=0.9975.1.3.3　蛋白质的测定　采用考马斯亮蓝法[7,8]. 以牛血清白蛋白为标准样品制作标准曲线,标准曲线为y=2.47x+0.0197(y为吸光度值,x为蛋白质的浓度mg/mL),R2=0.9611.1.3.4　去淀粉　用中温α-淀粉酶,在50～70℃, p H5.5～7.5条件下,去淀粉2次,直到浸提液遇碘液不变蓝色为止.1.3.5　去蛋白质　Sevag法:取15mL浓缩液,加入0.2倍的氯仿和0.05倍的正丁醇,手摇25min,离心,除去有机相和蛋白质,反复进行,直到界面上没有蛋白质出现为止,重复5次.等电点法:取15 mL浓缩液,将p H值调至4.5,在4℃下静置1夜,离心除去蛋白质.酶法:取15mL浓缩液,在47℃、p H8条件下加入30g/L的胰蛋白酶酶解2.5h 后,灭酶,冷却,醇析,离心弃去上清液.Sevag法结合酶法:按照酶法酶解之后,加入0.2倍的氯仿和0.05倍的正丁醇,手摇25min,在4℃下,静置1夜,离心除去蛋白质.等电点法结合酶法:按照酶法酶解之后,再按照等电点法的方法除去蛋白质.1.3.6　不同溶剂沉淀β-葡聚糖的比较　硫酸铵:向提取液加入硫酸铵使其浓度达到300g/L,4℃下静置48h,离心,弃去上清液,定容,测定β-葡聚糖含量.异丙醇:向提取液加入异丙醇至600mL/L,4℃下静置1夜,离心,弃去上清液,定容,测定β-葡聚糖含量.酒精:向提取液加入950mL/L的酒精至700mL/L,4℃下静置1夜,离心,弃去上清液,定容,测定β-葡聚糖含量.1.4　提取单因素和多因素试验 精确称取10g原料,去淀粉,以碱液为溶剂,水浴控温,浸提.提取液离心30min(3000r/min),倾出上清液,去淀粉,去蛋白,醇析,离心,收集沉淀,定容,测定β-葡聚糖含量(β-葡聚糖的提取率=醇析后β-葡聚糖的质量/原料质量). 通过改变料液比、提取温度、p H值和提取时间进行单因素试验,研究各因素对β-葡聚糖提取率的影响.结合单因素试验结果和文献报道设计多因素试验,选取L9(34)的正交表,水平因素见表1.表1　正交试验的因素水平Tab.1　Factors and levels of orthogonal experimentp H值料液比温度/℃81ζ124591ζ1760101ζ22752　结果与分析2.1　原料的预处理 原料越细,表面积越大,传质越快,但是不利于后续处理.因此,先将原料粉碎后过60目筛,然后用无水乙醚脱脂.由于麸皮中存在β-葡聚糖酶,应在75%的乙醇中进行回流灭酶,这样可在一定程度上脱去部分色素并除去游离的小分子物质.2.2　单因素对β-葡聚糖提取率的影响2.2.1　料液比对β-葡聚糖提取率的影响　精确称取10g原料,在温度50℃,提取时间2h,H10的条件下进行试验,结果如图1所示.当料液比在1ζ10到1ζ13之间,β-葡聚糖提取率急剧增加,随后缓慢增加.根据液固萃取基本理论,提取液的增多,有利于溶质的析出.但当料液比到1ζ19之后,提取率有下降趋势.这可能是由于在溶剂比例的增加,后续处理难度增大,从而引起溶质的损失.2.2.2　p H值对β-葡聚糖提取率的影响　在温度50℃、时间2h,料液比为1ζ13的提取条件下进行48 甘肃农业大学学报 2006年试验,结果如图2所示.随着p H 值的升高,β-葡聚糖提取率增大.但随着p H 值的增大,溶液颜色也随之加深.当p H 值为11时,溶液的颜色呈现深褐色.当p H 值大于10时,蛋白质的溶出率急剧提高[9],导致污染β-葡聚糖的机率增大,给β-葡聚糖的后续纯化带来困难.图1　料液比对β-葡聚糖提取率的影响Fig.1　Effects of ratio of liquid to solid on the extractionrate of β-glucan2.2.3　温度对β-葡聚糖提取率的影响　在提取时间1h ,p H 10,料液比1ζ13的条件下进行试验,结果如图3所示.随着温度的升高,β-葡聚糖提取率显著增加.因为温度的升高,加快了溶质的溶解,有利于β-葡聚糖的溶出.但是,β-葡聚糖是一种亲和胶,温度过高,易导致提取液粘度的增加,加快溶剂的蒸发,因此不利于溶质的溶解,故在多因优选试验中,最高温度定为75℃.图2　pH 值对β-葡聚糖提取率的影响Fig.2　Effects of p H value on the extractionrate of β-glucan2.2.4　时间对β-葡聚糖提取率的影响　在p H 10、温度50℃、料液比1ζ13的提取条件下进行试验,结果如图4所示.β-葡聚糖提取率随着时间的延长而增大,但增加幅度不是很明显.因此,在做多因素试验时,选取时间2h.图3　温度对β-葡聚糖提取率的影响Fig.3　Effects of temperature on the extractionrate of β-glucan图4　时间对β-葡聚糖提取率的影响Fig.4　Effects of time on the extraction rate of β-glucan2.3　提取β-葡聚糖的最佳工艺和最佳因素 根据单因素试验结果,确定出影响β-葡聚糖提取率的主要因素为p H 值、料液比和温度.故选取L 9(34)的正交表.正交试验结果见表2.表2　正交试验结果Tab.2　Results of orthogonal test编号p H 值料液比温度/℃β-葡聚糖提取率/%181ζ1245 2.05281ζ1760 2.17381ζ2275 3.10491ζ1260 2.02591ζ1775 4.10691ζ2245 1.897101ζ1275 3.708101ζ1745 2.349101ζ2260 2.10K —1 2.44% 2.59% 2.09%K —2 2.67% 2.87% 2.10%K —32.71%2.36%3.63%极差0.27%0.51%1.54% 从表2可知,影响β-葡聚糖提取率的因素为温度>>料液比>>p H 值,最佳组合是温度7558第2期 宋雪梅等:莜麦麸中β-葡聚糖的提取与纯化 ℃,料液比1ζ17,p H10,时间2h.从表3可以看出,温度对β-葡聚糖提取率影响显著(α<0.05).表3　方差分析Tab.3　Variance analysis差异源自由度均方F值显著性检验p H2 1.541E-060.6900.450料液比2 1.132E-05 5.0680.215温度2 6.355E-032843.9950.0223 注:3表示P<0.05.2.4　脱除蛋白质 莜麦麸皮中含有大量蛋白质,随着β-葡聚糖的溶出而溶出,从而影响β-葡聚糖的纯度.本试验选取了几种不同的方法,对比脱除蛋白质的效果.由于,在脱除蛋白质的过程中,会影响多糖的得率,所以在脱除蛋白质时,应考虑多糖的保留率. 蛋白质的脱除率=(原液中的蛋白质含量-脱蛋白质后溶液的蛋白质含量)/原液中蛋白质含量. 多糖的保留率=(原液中的多糖含量-脱蛋白质后溶液的多糖含量)/原液中的多糖含量. 由表4可以看出,等电点+酶法脱去蛋白质的效果最好,而单独的酶法脱去蛋白质的效果最差,多糖保留率最低.可能是由于酶把连在多糖上的蛋白质降解之后,在醇析时,有一部分多糖没有析出来,导致多糖的保留率降低.从蛋白质脱除率和多糖保留率2方面分析,等电点+酶法是去除蛋白质的最佳方法.但是,等电点和等电点+酶法在脱去蛋白质的效果上,几乎无差别,只是多糖保留率不同.因此,在实际的应用中,可根据实际情况选择适当的方法.表4　不同脱除蛋白质方法的比较Tab.4　Comparison of deprotein by different methods 方法蛋白质脱除率/%多糖保留率/%等电点95.583.0Sevag680.382.8Sevag1+酶法71.890.4等电点+酶法95.890.6酶法59.460.0Sevag152.088.32.5　溶剂沉淀β-葡聚糖 异丙醇、酒精和硫酸铵是常用的沉淀剂.从图5可以看出,酒精醇析β-葡聚糖的效果最好,同时成本也较低.据报道,硫酸铵可以纯化β-葡聚糖,除去里面的戊聚糖.但本试验结果表明,硫酸铵单独沉淀β-葡聚糖的效果较差.图5　溶剂沉淀葡聚糖Fig.5　Effect of solvent on the extraction ofβ-glucan 2.6　酒精醇析β-葡聚糖 利用酒精计控制,向提取液中加入950mL/L 的酒精,使之分别达到300、500、700、900mL/L.从图6可以看出,β-葡聚糖的提取率随着酒精度的升高而增大,但当酒精度增至700mL/L时,β-葡聚糖提取率增加缓慢.所以,适宜选取700mL/L的酒精醇析β-葡聚糖.图6　酒精度对β-葡聚糖提取率的影响Fig.6　Effect of alcohol amount on the extraction ofβ-glucan 3　讨论与结论 1)　提取β-葡聚糖的最佳工艺参数为温度75℃、料液比1ζ17、p H10和时间2h.提取的β-葡聚糖胶呈灰色. 2)　多糖一般在碱性条件下稳定,在酸性条件下,水解.在大规模生产β-葡聚糖时,用等电点法(p H4.5)除去蛋白质的方法是可行的;而在精确分析β-葡聚糖时,等电点法除去蛋白质可能会使一部分β-葡聚糖分解. 3)　从几种不同溶剂沉淀β-葡聚糖的效果来68 甘肃农业大学学报 2006年看,酒精是沉淀β-葡聚糖的最佳溶剂,且当浓度为700mL/L时醇析效果最佳.参考文献[1]　Wood P J ,Beer M U ,Butler G.Evaluation of role ofconcentration and molecular weight of oat beta 2glucan in determining effect of viscosity on plasma glucose and insulin following and oral glucose load [J ].British Journal of Nutrition 2000,84(1):19～23[2]　Cheol 2Heui Yun ,Alberto Estrada ,Andrew Van Kes 2sel ,et al .β-glucan ,extracted f rom oat ,enhanced dis 2ease resistance against bacterial and parasitic infections [J ].FEMS immunology and medicial microbiology ,2003,35:67～75[3]　汪军妹,张国平,陈锦新,等.大麦β-葡聚糖含量的品种和环境效应[J ].作物学报,2000,26(6):969～972[4]　邓万方,王　强,吕耀昌,等.品种和环境效应对燕麦β-葡聚糖含量的影响[J ].中国粮油学报,2005,20(2):30～32[5]　McCleary B V ,Codd R.Measurement to of (1→3)(1→4)-β-D -glucan in barley and oats :a streamlined en 2zymatic procedure[J ].J Sci Food and Agri ,1991,55:303～312[6]　张惟杰.糖复合物生化研究技术(第二版)[M ].杭州:浙江大学出版社,1999:11～12[7]　余冰宾.物化学试验指导[M ].北京:清华大学出版社,2004:137～138[8]　韩雅珊.食品化学试验指导[M ].北京:中国农业大学出版社,1992:57～58[9]　汪海波,刘大川,谢笔钧.燕麦中β-葡聚糖的提取及分离纯化工艺研究[J ].食品科学,2004,25(5):143～147[10]　Bhatty R boratory and pilot plant extraction andpurification of β-glucans f rom hull 2less barley and oat brans[J ].Journal of Cereal Science ,1995,22(2):163～17078第2期 宋雪梅等:莜麦麸中β-葡聚糖的提取与纯化 。