提取酵母细胞壁中_D_葡聚糖的新方法

表 2
试验号 温度 / 1 2 3 4 5 6 7 8 9 k1 k2 k3 R 115 115 115 120 120 120 125 125 125 35 9 37 98 33 3 4 68 3 4 5 3 4 5 3 4 5 37 32 37 08 32 78 4 54
正交试验结果
得率 /% 70 48 62 18 60 6 61 05 59 68 64 33 56 69 63 49 60 56 1 10 1 15 1 20 1 15 1 20 1 10 1 20 1 10 1 15 35 17 34 24 37 77 3 53 34 08 35 21 38 41 41 51 38 52 33 92 36 39 37 53 26
D 葡聚糖的新方 法 , 包括高 温抽提 、 脱脂和酶解 3 部分 。 在 高温条 D 葡聚糖 得率和纯度 的影响 。 结果 表明 , 高 温提取的 最佳工 艺条 D 葡聚糖得率为 61 05% , 纯度达到 41 51 % ; 为了进一步提
件下分别考察了 Biblioteka H、 料液比 、 温 度及时间对 高
件 为 : 料液比为 1 15、 pH = 8 、 温度 120 , 时间 3 h , 78 31% 。 关键词 D 葡聚糖 , 酵母细胞 壁 , 提取
2011年第 37 卷第 1期 ( 总第 277期 )
1 材料与方法
1 1 仪器 W a ters 600 高效液相色谱仪 ( 配置 W aters 600 四 元输液泵 , 2410 示差折 光检测 器, 7725 i进 样阀, Em pow er色谱工作站 ) ; 高压灭菌锅 ( 上海 第一医疗 器械厂 ); QT 1 漩涡混合器 ( 上海琪特分析仪器有限 公司 ) ; 德国 Christ ALPHA 1 4L SC 冷冻干燥机 (北京 鑫盛鸿阳科技有限公司 ); Avanti J 26XP 系列高效离 心机 ( 贝克曼库尔特商贸 ( 中国 )有限公司 )。 1 2 试剂 酵母细胞壁 (安琪酵 母有限公司提供 ) , 蛋白酶
D 葡聚糖的纯度 , 采用了脱 脂和 酶解 的方 法去 除粗 多 糖中 的蛋 白质 、 脂 质 等杂 质 , 最 终产 品的 纯 度达 到
D 葡聚糖是一种极富生物活性的多糖 , 具有较 强的免疫及抗肿瘤活性。在酵母细胞壁中含有大量 的 D 葡聚糖。目前该资源主要是作为饲料廉价销 售, 造成资源浪费, 利用现代科技手段从酵母细胞壁 中提取 D 葡聚糖是实现其综合利 用的有效措施。 传统的提取方法有酸法、 碱法、 酸碱结合方法 , 但提取 条件都较为剧烈, 且酸碱试剂易腐蚀设备 , 环境污染 严重 , 尤其是在提取过程中部分 D 葡聚糖会降解, 造成产品得率与生物活性的降低。本文采用了一种 较为温和的提取 D 葡聚糖方法 , 包括高温抽提、 脱 脂和酶解 3 部分 , 操作过程简便、 快速, 易于大规模生 产, 更为重要的是避免了酸碱条件对产品带来的降解 作用 , 同时副产物甘露聚糖是动物营养与免疫研究和 应用中的主要功能性多糖 , 因而具有一举 两得的效 果。
T M
磷酸盐缓冲溶液配制 ) 的条件下 , 考察料液比对粗多 糖纯度和得率的影响 , 结果如图 1。粗多糖的纯度随 着缓冲液比例的增加而升高, 得率随着缓冲液比例的 增加而下降 , 这是由于缓冲液比例的增加使得酵母细 胞壁粉末与缓冲溶液之间的抽提作用更加充分, 甘露 聚糖蛋白溶出增多, 所以粗多糖纯度升高 , 随之得率 下降。
图 2 pH 值对粗多糖得率和纯度的影响
如图 2 所示 , 在弱酸性至碱性范围内 , 粗多糖纯 度的变化主 要在 pH 值 7 5~ 8 5 有 明显下降 的趋 势, 随着 p H 值进一步增大, 纯度逐渐升高; 得率出现 先下降再上升再下降的变化趋势。因为酵母细胞壁 中含有的甘露聚糖蛋白不易溶于弱酸性环境 , 但能以 整体形式溶于碱性条件, 所以随着 p H 值从弱酸性变 化到中性 ( 5~ 7), 甘露聚糖蛋白的溶解性逐渐增大, 得率逐渐下降 ; 随着 pH 值的进一步增大 , 得率反而 上升, 这可能是因为酵母细胞壁中含有的蛋白质在等
P rota m ex 、 Savinase 、 N eutrase 、 A lca lase 2 4L ( 丹麦 No vozym es公司提供 ) , P rotex 40L ( Genencor公司提供 ), 胰蛋白酶和 CP酶 (复合蛋白酶 ) ( 无锡杰仁生物科技 公司提供 ) , 所有化学试剂均为分析纯。 1 3 D 葡聚糖的提取 高温提取: 用缓冲液配成一定质量浓度的酵母细 胞壁悬浮液于 250 mL 三角瓶中 ( 加入直径 0 5c m玻 璃珠 ) , 分别在不同 pH、 时间、 温度、 料液比下进行高 温抽提 , 离心, 沉淀用水洗涤 3 次 , 冷冻干燥, 得到水 不溶性粗多糖, 备用。 脱脂: 取 得 到的 水 不 溶 性 粗 多 糖, 按 照 1 20 ( g mL )的比例分别与不同的有机溶剂配成悬浮液, 不同有机溶剂为: V ( 正己烷 ) V ( 甲醇 ) = 4 1 、 异丙 醇、 石油醚、 无水乙醇、 正己烷等, 加热回流 5 h , 进行 脱脂处理, 反应结束后得到脱脂粗多糖, 40 真空干 燥, 备用。 酶解 : 脱脂得到的粗多糖经酶解 脱去残余蛋白 质, 采用的蛋白酶有 : 中性蛋白酶 N eutrase 、 碱性蛋白 酶 Sav in ase , A lca lase 2 4T 及 P ro tex 40L、 复合蛋白酶 P rota m ex 、 胰蛋白酶和 CP 酶等, 反应结束后 , 得到的 残渣用水洗涤 3 次 , 离心, 再加水复溶后于 100 加 热 5 m in 灭酶 , 离心, 真空干燥 , 得到淡黄色粉末即为 D 葡聚糖产品。 1 4 粉末 ( D 葡聚糖含量的测定 H 2 SO 4 水解 : 准确称取 100 m g 左 右酵母细胞壁 D 葡 聚糖产品或其 中间产物粗 多糖 ) 于 25 m L具塞试管中 , 加入 1 5 mL 72 % H 2 SO4, 漩涡混匀, 室温静置 3 h , 然后加入一定浓度阿拉伯糖溶液作为 内标物 , 再加入去 离子水使 H 2 SO 4 的最终 浓度为 1
在单因素 试验考察 的基础上 , 选择 在 pH 值 为 8 0 的条件下 , 从温度、 时间、 料液比 3 个影响因素设 计正交实验 , 考察其对得率和纯度的影响。
表 1 正交试验因素水平表
水平 1 2 3 因素 温度 / 115 120 125 提取时间 / h 3 4 5 料液比 ( g mL ) 1 10 1 15 1 20
分离与提取
提取酵母细胞壁中
1 , 2 1 1
D 葡聚糖的新方法
2 1 1 , 2
王静 , 戴军 , 陈尚卫 , 洪雁 , 朱松 , 顾正彪
2( 江南 大学食品学院 , 江苏 无锡 , 214122) 摘 要 研究了 一种从酵母细胞壁 中提取
1( 江南大学食品科 学与技术国家重点实验室 , 江苏 无锡 , 214122)
2 结果与讨论
2 1 料液比对粗多糖纯度和得率的影响 在反应 温度 120 , 时间 4h , p H 8 0 ( 0 1 m o l/L 190
2011 Vo l 37 No 1 ( To ta l 277)
分离与提取
电点时溶解度降低 , 易沉淀析出, 导致粗多糖得率上 升的原因 ; 在 pH 值 8 5~ 10 , 甘露聚糖蛋白能以整体 溶于碱性条件 , 所以得率会下降。综合考虑到粗多糖 纯度、 得率以及过碱会造成粗多糖降解等影响因素, 最终选择 p H 7 5~ 8的范围优化提取的最佳组合。 2 3 温度对粗多糖得率和纯度的影响 按照料液比 1 10( g mL ), p H 值 8( 0 1 m o l/L 磷 酸盐缓冲液配制 ), 反应 4 h 条件下, 考察温度对粗多 糖得率和纯度的影响。如图 3 所示 , 随着温度的升高 粗多糖得率在 100~ 110 下降明显 , 随后温度升高 得率变化趋于平缓 ; 纯度随着温度的升高而增大, 考 虑到高温有可能导致多糖结构降解 , 故选择反应温度 为 115~ 125 。
图 1 料液比对粗多糖纯度和得率的影响
2 2
pH 值对粗多糖纯度和得率的影响 准确称取 5 g 左右 酵母细胞壁粉 末, 按照 1 10
( g mL )料液比 , 温度 120 , 时间 4 h , p H 值分别为 5 0 、 6 0( 用 0 1 m ol /L 柠檬 酸 柠檬 酸钠 缓冲液 配 制 )、 7 0 、 7 5 、 8 0 ( 用 0 1 m ol /L 磷 酸盐 缓 冲液 配 制 ); 8 5 、 9 0 、 9 5 、 10( 0 1 m ol /L 硼酸氯化钾 氢氧化 钠缓冲液配制 ) 的条件下 , 考察 pH 值对粗多糖纯度 和得率的影响。
第一作者 : 硕士研究生 ( 戴军 , 顾正彪为通讯作者 ) 。 收稿日期 : 2010 - 08- 29 , 改回日期 : 2010- 10- 23
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食品与发酵工业
FOOD AND FERMENTAT ION I N DU STR IE S
m ol /L, 充氮气 , 真空封管 , 100 水解 5 h , 取出冷却至 室温 , 用 Ba( OH ) 2 中和 , 离心 , 得上清液 A, 用水洗涤 3 次, 合并 A 和所得洗涤液, 最后定容 至 100 mL, 过 滤后用 H PLC 进样检测。 色谱条件 : 色谱柱 : Sugar Pak 1 6 5 mm i d 300 mm; 流动相 : 超纯水 ; 流速: 0 4 mL /m in ; 柱温: 85 ; 检测: 示差折光检测器。 D 葡聚糖含量的计算: 称取一定量的内标物, 加入到葡萄糖中组成标准品溶液, 然后将相同量的内 标物加入到同体积的样品溶液中组成样品溶液 , 将 2 种溶液分别进样, 根据下述公式计算得到样品中葡萄 糖的含量再乘以葡聚糖的转换系数 0 9 , 得到样品中 葡聚糖的含量。 ( A i /A s ) 样品 ( C i% ) 样品 = ( A i /A s ) 标准 ( C i% ) 标准 式中 , i为葡萄糖 , s为阿拉伯糖。 1 5 总蛋白含量的测定 采用凯氏定氮方法。 1 6 脂质含量的测定 准确称取 5 g 左右干燥样品 , 按照 1 20( g mL ) 的比例与 V (正己烷 ) V (甲醇 ) = 4 1配成悬浮液 , 加 热回流 5 h , 然后将所得抽提物冷却至 40 , 蒸发得 A 1; 经抽提后所得残留物依次经正己烷、 甲醇、 丙酮溶 液洗涤, 合并 A 1 和所得洗涤液, 旋转蒸干至恒重, 准 确称重并计算脂质含量。 1 7 分子质量分布分析 高效体积排阻色谱法 ( HPSEC ) 。 仪器 : W aters 600 高效液相色谱仪 ( 配 2410示差 折光检测器和 M 32工作站 ) 。 色谱条件 : 色谱柱: U ltrahydrogel L in ear 300 mm 7 8 mm id 2 ; 流动相 : 0 1 m o l/L NaNO3; 流 速: 0 9 mL /m in ; 柱温: 45 ; 进样体积 : 10 L。 样品制备 : 样 品用二 甲亚砜 溶解、 配制 成 3 ~ 5 mg /mL 溶液, 50 超声处理 2~ 3 m in。 相对分 子 量校 正曲 线 所用 标 准 品: Dex tran T 2000 ( M W 2000 000) , Dex tranT 580 ( M W 580 000 ), Dex tran T 190 ( M w 188 000 ) , Dextran T 70 ( M W 70 000), Dex tran T 10 (M W 10 000) , Dex tran T 5 (M W 4 600) , M altopentaose (M W 828)。