实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定

八、注意事项：
1、离心前一定要平衡，并对称放入，盖好盖子。 2、层析柱跟水平面要垂直。胶面要平，装柱时注意
操作压； 3、装柱用的树脂不能太浓也不能太稀；柱内不能有
气泡,，不能干胶，不能有断层。流速不能过快。 4、整个操作过程防止液面低于凝胶；清除管道内气
泡。 5、记录仪上zero勿动否则是一条直线。
慢加，滴加乙醇时滴与滴之间不能连成线！！！） 放置30min，然后10000rpm离心10min，弃去上清
液，试管中沉淀放置冰箱保存或将酒精处理后的 沉淀溶于7ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3 buff(Ⅲ样 品，留1.0 ml样液测活)，上样前用7ml离心管 5000rpm离心10min，待上样。
洗脱液通过检测器，用部分收集器自动收集洗脱液，每6 min收集一管(约3~4ml)。洗脱至混合器中液体流完为止， 比较各管的酶活力的大小，将最高活力的若干管酶液集中， 均分在几个小管中，低温保存，用于性质测定。留液(Ⅳ) 测定酶活和蛋白量。(洗脱时，流速为0.5ml/分钟-1ml／分 钟、4ml接收一管)
加样，洗脱：
将平衡好的DEAE—Sepharose FF上端的水小心吸干，留 下一薄层液面，用长滴管将样品液5 ml，沿管壁环形慢慢 加进柱内，待样品液全部进入DEAE—Sepharose FF内， 只剩下一薄层液面时，用buff环形缓慢填满层析柱，
立即连上梯度洗脱杯（梯度洗脱杯中靠出口处的杯中装 20mmol/L Tris-HCl pH7.3 buff 50ml，另一杯中装50ml buff含0.5mol/LNaCl），打开洗脱杯控制开关，开动磁力 搅拌器，用蠕动泵控制流速为3 ml/ 15min。
理一步外，尽可能低温）
第一部分 样品的制备：
1.称取10.0克干酵母粉于研钵内，加3.0克石英砂， 10ml buff（先量取总体积buff30 ml），在研钵内研 磨成糊状，约30分钟，再分次加buff 10ml并研磨 10分钟，, 研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管， 12000r/min离心10分钟，取上清液，并量取体积， 留1.0ml 上清液(定为第一步骤的样品Ⅰ)，用于测 定酶活力和蛋白浓度。
九、实验结果与分析
附：仪器调节指标
恒流泵
流速：3ml/10min
核酸蛋白自动检测仪 A: 0.2
纪录仪
V: 20mv 走纸速度：0.5mm/min
自动收集器Βιβλιοθήκη Baidu
6min/tube 共25tube
上样量
5ml
装填平衡后的凝胶柱用肉眼观察应均匀，无纹路，无气泡。
蔗糖酶活力及蛋白浓度的测定
一、实验目的和要求
2.热处理 将上步所得上清液转入50 ml离心管，迅 速放入50℃恒温水浴中，保持30分钟，并用玻璃 棒温和搅动抽提液，迅速用冰浴冷却，10000rpm 离心10分钟，弃去沉淀，测量上清液体积，留 1.0ml (Ⅱ样品)测定此酶活力和蛋白浓度。
3.酒精沉淀 将热处理后的上清液，加入相同体积 的-20℃95％乙醇，冰浴中温和搅动，（注意边搅
DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。
装柱(层析柱规格1×20cm)： 装柱前先将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体 积） 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理 好的DEAE—Sepharose FF轻轻搅匀（注意不能太稀，也 不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续 加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约1-2cm后松 开层析柱出口，控制流速0.5ml/min；待柱内DEAE— Sepharose FF自然沉降至所需高度并分出水层后，吸去水 层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的DEAE— Sephadex至距层析柱上端4cm处为止（这时须保持 DEAE—Sepharose FF柱面平整）。用 50ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进 行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。
酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
五、实验的主要仪器
1．冷冻离心机 2．研钵 3．恒温水浴箱 4．-20℃冰箱 5．梯度混合器 6．层析柱 (1×20cm)
六、实验操作流程
干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒 精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF柱→层析→活力检测
七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处
掌握酶活力测定的方法； 学会用Folin-酚法测定蛋白质的浓度； 熟悉酶活力蛋白浓度的计算方法。
第二部分 DEAE-Sepharose FF柱层析
DEAE—Sepharose FF处理:（ 按说明书处理）
取适量DEAE- Sepharose Fast Flow，加入0.5mol/L NaOH溶液（约50ml），轻轻搅拌，浸泡0.5小时， 用玻璃砂漏斗抽滤，并用去离子水洗至近中性， 抽干后，放入小烧杯中，加50ml 0.5 mol/L HCl, 搅 匀，浸泡0.5小时，同上，用去离子水洗至近中性， （DEAE- Sepharose Fast Flow，用后务必回收）。 浸入0.02 mol/L pH 7.3 Tris-HCl 缓冲液中。