酵母蔗糖酶的提取及其性质研究精品PPT课件

本实验共有三个分实验：
一、蔗糖酶的提取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
（一）蔗糖酶的提取与部分纯化
细胞破壁的几种方法
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖， 将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上 下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用 于量少和动物脏器组织。 3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞 内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破 裂，此法多适用于微生物材料。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠 （SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理 效果更好。 6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低 溶质的溶解度使其沉淀被析出。
离子交换层析
利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷 不同，因而与离子交换树脂有不同之吸附力
而分离之
改变溶液的pH值和盐离子浓度，结合力最小 的蛋白质先洗脱下来。
离子交换层析(sephorase DEAE fast flow)
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚 糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白 质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。
（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的 离心管中，4℃，4700rpm，离心15min。
（7）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力 及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1M乙酸将pH调至5.0， 称为“粗级分I”。
两种酶的性质对照表如下：
名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度
外酶 27万 50% 双 26mM
150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60℃
内酶13.5万 ＜3% 双 25mM
150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60℃
实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗 糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量 定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单位 数。
2. 热处理
（1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥 地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离 心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，4700rpm， 离心15min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力 及蛋白质含量（称为“热级分II”）。
酵母蔗糖酶的提取及其性质研究
1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。
2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层 析技术。
本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学 习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质， 尤其是动力学性质作初步的研究。
实验原理
自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗 糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶） （EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解， 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催 化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。
操作步骤
（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及适量（约4g） 二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 （3）量取预冷的甲苯12ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊 状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细 胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加2ml左右，边 加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机 离心，4℃，4700rpm，15min。如果中间白色的脂肪层厚，说
3. 乙醇沉淀 将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入
少量食盐），逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时 轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。 于4℃，4700rpm，离心15min，量出体积，留出1.5ml （下次实验测定酶活力）后倾去上清，沉淀用2ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖 子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵 母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶， 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。 在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种 酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组 成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Me来自百度文库，它们的 分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内 酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物 专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外 酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要 是外酶。
亲和层析
利用分子与其配 体间特殊的、可逆性 的亲和结合作用而进 行分离的一种层析技 术。可以选用生物化 学、免疫化学或其他 结构上吻合等亲和作 用而设计的各种层析 分离方法。
凝胶过滤层析
利用一定大小孔隙的具有 网状结构的凝胶作层析介 质（如葡聚糖凝胶、琼脂 糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 等），根据被分离物质的 分子大小、形状不同扩散 到凝胶孔隙内的速度不同， 因而通过层析柱的快慢不 同而分离的一种层析法。