酵母蔗糖酶的提取及其性质研究精品PPT课件
酵母蔗糖酶的分离、纯化及酶动力学分析 -1
安徽农业大学 生命科学学院 2017年11月
自溶
蔗 糖 酶 分 离 纯 化
抽提 1.监测蔗糖酶活性变化 --DNS试剂法 乙醇分级 2.监测蛋白浓度变化 --考马斯亮蓝G250染色法 透析 脱盐
纯度和产量 计算
蔗糖酶 动力学 分析
米氏常数Km的测定 pH对酶活性的影响
9.7
7.37
3.53
3.操作步骤
自行设计实验方案！！！！
以反应pH为横坐标，绘制pH～酶活性曲线，并分析本实 验条件下该酶的最适pH范围。
实验报告的要求
一、实验报告组成 1.实验目的 2.实验原理 3.实验步骤 4.注意事项 5.实验结果、分析与讨论
（1）交代清楚所有数据来源，所有数据的计算过程，注意图 表的绘制，等。 （2）针对图表针对性的进行分析。
加水mL数
9
8
7
6
3.操作步骤
管号 蔗糖终浓度 [S]mmol/L 1/[S] V 1/V [S]/V
1
2
3
4
用二种方法作图： （1）倒数作图法：1/V为纵坐标，1/[S]为横坐标，由直线在横轴上的交点为 －1/Km，计算得Km； （2）[S]/V对[S]作图，以[S]/V为纵坐标，以[S]为横坐标，由直线在横轴上的 交点为-Km。
分离、纯化操作步骤
4.纯度和产量
提纯的目的，不仅在于得到一定量的酶,而且要求得到不会或尽量少含其他 杂蛋白的酶制品。在纯化过程中，除了要测定一定体积或一定重量的酶制剂中 含有多少活力单位外，还需要测定酶制剂的纯度。酶的纯度用比活力表示。
酵母蔗糖酶分离纯化效果计算
留样 体积 /mL 蛋白质浓度 （mg/mL） 总蛋白 活力 总活力 比活力 （mg） （U/mL） （U） （U/mg） 纯化 倍数 产量 （回收率）
酵母蔗糖酶的提取分离纯化及其蛋白质浓和酶活力测定
蛋白总量 = 蛋白浓度×总体积 总酶活 = 酶活×校正体积 比活力（Unit/mg）＝总酶活力/总蛋白 纯化倍数 = 比活力之比 回收率 = 总酶活之比
分实验四：离子交换柱层析纯化蔗糖酶
一、实验目的 学习掌握离子交换柱层析的原理与操作
二 、实验原理
离子交换是指液相中的离子与固相交换 基团中的离子可逆反应。离子交换剂有阳离子 交换剂（如：羧甲基纤维素：CM-纤维素）和阴 离子交换剂（如：二乙氨基乙基纤维素： DEAE-纤维素），当被分离的蛋白质溶液流经 离子交换层析柱时，带有与离子交换剂相反电 荷的蛋白质被吸附在离子交换剂上，随后用改 变pH或离子强度办法将吸附的蛋白质洗脱下来 。
➢在酸性条件下，蔗糖酶催化蔗糖水解，生成葡萄糖和果糖。 ➢葡萄糖、果糖和碱性铜试剂混合加热后被其氧化，二价铜
被还原成棕红色氧化亚铜沉淀。 ➢氧化亚铜与磷钼酸作用生成蓝色溶液，其蓝色深度与还原
糖的量成正比，于650nm测定光吸收值。
三、试剂
碱性铜试剂 磷钼酸试剂 葡萄糖标准溶液 0.2mol/L蔗糖溶液 0.2mol/L乙酸缓冲液，pH4.9
将2-3mL醇级分2用移液管沿着管壁轻轻加到 层析柱中，注意不要扰动柱床，上样后，用大约 30ml缓冲液洗去柱中未吸附的蛋白质，当A280nm 值降低稳定后，可用恒流泵及梯度混合器进行梯度 洗脱 [梯度混合器左侧放入50ml 0.02 mol/L pH值 为7.3的Tris-HCl缓冲液（含1 mol/L NaCl）， 右侧放入等量0.02 mol/LpH值为7.3的Tris-HCl 缓冲液]。
10 ──反应10min
B ──每管加入酶液mL数 原始酶液的酶活力 E = (E′/2)×稀释倍数
分实验三：蔗糖酶各级分的蛋白含量测定 （G-250法）
实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定课件
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮 于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力
测定
15
酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力
测定
13
装柱(层析柱规格1×20cm)： 装柱前先将柱下端的出水口关闭，加进5ml（约1/3柱床体 积） 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液，然后将处理 好的DEAE—Sepharose FF轻轻搅匀（注意不能太稀，也 不能太稠，刚好呈流质状态）沿玻棒靠近柱管壁慢慢连续 加进柱内。注意不能带进气泡，待凝胶沉积约1-2cm后松 开层析柱出口，控制流速0.5ml/min；待柱内DEAE— Sepharose FF自然沉降至所需高度并分出水层后，吸去水 层，用玻棒将沉降界面搅匀，再加进处理好的DEAE— Sephadex至距层析柱上端4cm处为止（这时须保持 DEAE—Sepharose FF柱面平整）。用 50ml 20 mmol/L Tris-HCl、pH7.3的缓冲液装进洗脱杯，连通层析柱，进 行柱平衡，直到流出液与缓冲液的pH一致。
实验十四酵母蔗糖酶的提取纯化及活力
生化实验讲义：实验九--酵母蔗糖酶(最后)
实验九酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究本实验为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
自1860年Bertholet从酒酵母Sacchacomyces Cerevisiae中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。
蔗糖酶（invertase）（β—D—呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。
该酶以两种形式存在于酵母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶（external yeast invertase）, 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。
在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶（internal yeast invertase），含有少量的糖。
两种酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内酶约为13.5万。
尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要是外酶。
两种酶的性质对照表如下：实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量定为蔗糖酶的活力单位。
比活力为每毫克蛋白质的活力单位数。
本实验共有九个分实验：一、蔗糖酶的提取与部分纯化二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定四、反应时间对产物形成的影响五、pH对酶活性的影响和最适pH的测定六、温度对酶活性的影响和反应活化能的测定七、底物浓度对催化反应速度的影响及米氏常数K m和最大反应速度V max的测定八、尿素（脲）抑制蔗糖酶的实验九、棉子糖和果糖抑制蔗糖酶的实验（一）蔗糖酶的提取与部分纯化一、实验目的：学习酶的纯化方法，并为动力学实验提供一定量的蔗糖酶。
浙江大学生物化学实验甲 酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析
酵母蔗糖酶的制备及其动力学性质分析一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于植物和微生物体内，专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶分子量约270000D，pI约5．0，最适pH4．6，耐酸和热，50℃保温30min 仍具有相当的活力，最适温度37℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提。
加热纯化。
乙醇分级沉淀。
纤维素柱层析分离纯化。
㈠、前三步分离纯化的原理如下：甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等取中层50水浴中使热不稳定蛋白变性上清：蔗糖酶、可溶性糖等（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等㈡、纤维素柱层析分离纯化的原理1、离子交换柱层析分离混合物的基本原理离子交换层析（Ion Exchange Chromatography）是一种根据待分离物质的阳或阴离子和相对应的离子交换剂间的静电结合，即根据物质酸碱性、极性等差异，通过离子间的吸附和脱吸附而将溶液中各组分分开的一种技术。
离子交换层析是一种液-固相层析技术。
其中，液相称洗脱液，固相的惰性支持介质称离子交换剂。
在离子交换剂上具有带电基团，不同的交换剂所具有的带电基团的电荷性质不同，如交换剂上的带电基团带正电荷，则可结合溶液（液相）中的阴离子，这样的交换剂称为阴离子交换剂，如DEAE纤维素、强碱型的离子交换树脂等。
反之，如交换剂上的带电基团带负电荷，则可结合溶液中的阳离子，这样的交换剂称为阳离子交换剂，如CM-纤维素、强酸性的离子交换树脂等。
离子与交换剂的静电结合作用具如下特点：选择性：离子所带的电荷越多，离子半径越小，越易结合。
遵循质量作用定理：对某一特定离子，随离子浓度的增大，则遵循质量作用定理向与交换剂结合方向进行可逆性：在一定条件下，结合在交换剂上的离子可被其它）离子取代而离开交换剂并随洗脱液流出层析柱。
生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。
再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。
之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。
用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。
（取出3ml于冰箱中保存）2、热处理（1）盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。
（3）上清液即为热级分Ⅱ。
（取出3ml于冰箱中保存）3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。
然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。
然后4℃，1000r/min离心10min。
倾去上清，并滴干。
将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。
及洗脱峰图如下：三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定（一）还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍）取20μl稀释至2ml（100倍）释100倍。
在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml）Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。
（二）蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。
比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。
纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。
以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。
结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。
可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。
作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。
通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。
1材料与方法1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。
1．2主要化学试剂和仪器十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。
UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。
实验二酵母蔗糖酶
实验原理
蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法； 蛋白质等生物活性大分子的提取方法。 （自学）
提取工艺和酶活测定
1.
蔗糖酶
蔗糖酶的耐热温度为50度，45度以下可保持酶活不变；在 pH3.0~8.0范围内均可保持较高的酶活； 蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化， 或者加入还原剂（如Vc）保持酶活力； 酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞 质内，前者活力较高，分子量较大（约270KDa），后者活 力较低，分子量约为135KDa，两种酶的底物专一性和动力 学性质十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶。
2.
3.
提取工艺 1. 破碎酵母细胞的方法： 蔗糖酶分子量较大，一般采用研磨法彻底破碎 细胞使其释放出来，但应注意研磨过程中保持 低温防止酶失活； 或者采用自溶法（适当的酸度和温度下利用酵 母菌自身的酶系破坏细胞壁），此方法较为温 和，但是时间较长，需加入少量防腐剂，防止 过程中外界细菌污染； 化学渗透法等较温和的非机械法。 原则：低温，处理时间短，防止酶失活。
2、DNS法测定还原糖量
试剂 粗酶液组 测定组1 水解液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS液 （mL） 1 对照组1 1 纯酶液组 测定组2 1 对照组2 1
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
1.0
沸水浴5min，自来水冷却，稀释至10mL，以对照组调零，记 录测定组OD540nm。
实验结果
计算酶活力
将吸光值代入实验一葡萄糖标准曲线，得到水解液中还原 糖的毫克数 酶活力（U/mL）＝还原糖毫克数×3.5（水解液体积） 蔗糖酶活力定义：在一定实验条件下，在规定时间内释放 1mg还原糖的酶量为一活力单位。
酵母蔗糖酶的提取及性质测定
酵母蔗糖酶的提取及性质测定引论及原理酶的分离制备在酶学以及生物大分子的结构功能研究中有重要意义。
本实验属综合性实验，接近研究性实验，包括八个连续的实验内容，通过对蔗糖酶的提纯和性质测定，了解酶的基本研究过程；同时掌握各种生化技术的实验原理、基本操作方法。
本实验技术多样化，并且多个知识点互相联系，实验内容逐步加深，构成了一个综合性整体，为学生提供一个较全面的实践机会，学习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质，尤其是动力学性质作初步的研究。
蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。
一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）＋ H 2O 蔗糖酶O HH O2.石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）3.95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）4.Tris-HCl（pH7.3）缓冲液（四）操作步骤1. 提取（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。
实验十四---酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
甲液：溶解6.9g 结晶酚于15.2ml 10％NaOH溶液中，并用水稀释至 69ml,在此溶液中加6.9g亚硫酸氢钠。
乙液：称取255克酒石酸钾钠加到300ml 10%NaOH溶液中，再加 入800ml 1%3,5-二硝基水杨酸溶液.甲,乙二溶液相混合即得黄色试剂,贮 于棕色瓶中备用,在室温放置7-10天以后使用。
2021/4/9
12
DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。
9
七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处
理一步外，尽可能低温）
第一部分 样品的制备：
1.称取10.0克干酵母粉于研钵内，加3.0克石英砂， 10ml buff（先量取总体积buff30 ml），在研钵内研 磨成糊状，约30分钟，再分次加buff 10ml并研磨 10分钟，, 研磨时间大约60分钟。转入50mL离心管， 12000r/min离心10分钟，取上清液，并量取体积， 留1.0ml 上清液(定为第一步骤的样品Ⅰ)，用于测 定酶活力和蛋白浓度。
实验二酵母蔗糖酶
35度水浴10min，2自、来水溶冷却液的蛋白质浓度要适宜，防止蔗糖酶与杂蛋白共沉淀。
蔗糖酶可作用于β－1，2糖苷键，将蔗糖水解为D－葡萄糖和D－果糖；
有机溶3剂.沉淀有法机： 溶剂沉淀法：
——有机溶剂沉淀法获得蔗糖酶
根据蔗糖酶的根耐据热性蔗质，糖将酶热不的稳定分性子杂蛋量白变和性亲除去水， 性，在溶液中参加一定量的无水乙醇溶
——选择性热变性除去杂蛋白
3、离心后应迅速将上清倒出，沉淀物用缓冲液溶解，防止酶与有 机溶剂长时间接触，防止其变性。
测定酶活的原理 蔗糖酶可作用于β－1，2糖苷键，将蔗糖
水解为D－葡萄糖和D－果糖； Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活剂，Mn2+ 是其抑 制剂。
葡萄糖和果糖具有复原性，在偏碱性条件 下，可与3，5－二硝基水杨酸共热后生成 棕红色物质，在一定浓度范围内，复原糖 的量和反响液的颜色强度成正比例关系。
通过酶活测定物，沉调节淀提取的条条件。件。
原那么：低温，处理时间短，防止酶失活。
2、边加 原乙那醇边么搅拌：溶1液、，防注止意局部在乙醇低过温浓，下导致操酶作变性，失活故；无水乙醇要预冷；
蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法；
蔗糖酶的耐热温度2为、50度边，加45度乙以下醇可边保持搅酶活拌不溶变；液，防止局部乙醇过浓，导致酶变性失活；
实验二酵母蔗糖酶
实验目的
学习提取酵母蔗糖酶和测定酶活力的方法； 学习提取生物活性大分子的方法。
实验材料
材料：活性干酵母粉、石英砂；
试剂：95％冰乙醇、DNS液、PBS〔pH7.2〕、
5％蔗糖溶液、1N NaOH溶液；
《酵母蔗糖酶》PPT课件
12
精品医学
实验结果
计算酶活力
将吸光值代入还原糖标准曲线，得到水解液中还原糖的质量。 Y=0.67X+0.027（Y：吸光值；X：还原糖的质量（mg）） 蔗糖酶活力定义：在一定实验条件下，在规定时间内释放1mg还原糖的酶量 为一个活力单位。 酶活力（U/mL）＝还原糖毫克数×3.5（水解液体积）÷1.0（酶液体积）
0.5
－
0.5
0.5 2.0
－
精品医学
2、DNS法测定还原糖量
试剂
水解液 （mL）
粗酶液组
测定组1 对照组1
1.0
1.0
纯酶液组
测定组2 对照组2
1.0
1.0
蒸馏水
1.0
1.0
1.0
1.0
（mL）
DNS液
1.0
1.0
1.0
1.0
（mL）
沸水浴5min，自来水冷却，稀释至10mL，以对照组调零，记 录测定组OD540nm。
实验二、酵母蔗糖酶的提取和 酶活测定
1
精品医学
实验目的
学习提取酵母蔗糖酶的方法； 测定蔗糖酶活力的方法。
2
精品医学
实验材料
材料：活性干酵母粉、石英砂； 试剂：95％冰乙醇、DNS液、PBS（pH7.2）、
5％蔗糖溶液、1N NaOH溶液； 仪器：水浴锅、离心机、722型分光光度计。
3
精品医学
10
精品医学
酶活测定 1. 蔗糖酶将蔗糖水解为还原糖
试剂
（均35度预 热）
粗酶液组 测定组1 对照组1
酶液（mL）
1.0
1.0
纯酶液组 测定组2 对照组2
1.0
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
五、实验的主要仪器
1．冷冻离心机 2．研钵 3．恒温水浴箱 4．-20℃冰箱 5．梯度混合器 6．层析柱 (1×20cm)
六、实验操作流程
干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒 精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF 柱→层析→活力检测
七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处
Hale Waihona Puke 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子 交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离 子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以 离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团 对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质 所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就 有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提 高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂 的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来，达到分离的目的。
DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。
酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
酵母蔗糖酶的提取及其性质研究57页PPT
1、最灵繁的人也看不见自己的背脊。——非洲 2、最困难的事情就是认识自己。——希腊 3、有勇气承担命运这才是英雄好汉。——黑塞 4、与肝胆人共事，无字句处读书。——周恩来 5、阅读使人充实，会谈使人敏捷提取及其性质研究
11、获得的成功越大，就越令人高兴 。野心 是使人 勤奋的 原因， 节制使 人枯萎 。 12、不问收获，只问耕耘。如同种树 ，先有 根茎， 再有枝 叶，尔 后花实 ，好好 劳动， 不要想 太多， 那样只 会使人 胆孝懒 惰，因 为不实 践，甚 至不接 触社会 ，难道 你是野 人。(名 言网) 13、不怕，不悔(虽然只有四个字，但 常看常 新。 14、我在心里默默地为每一个人祝福 。我爱 自己， 我用清 洁与节 制来珍 惜我的 身体， 我用智 慧和知 识充实 我的头 脑。 15、这世上的一切都借希望而完成。 农夫不 会播下 一粒玉 米，如 果他不 曾希望 它长成 种籽； 单身汉 不会娶 妻，如 果他不 曾希望 有小孩 ；商人 或手艺 人不会 工作， 如果他 不曾希 望因此 而有收 益。-- 马钉路 德。
实验二酵母蔗糖酶
实验原理
蔗糖酶的提取过程和酶活的测定方法； 蛋白质等生物活性大分子的提取方法。 （自学）
提取工艺和酶活测定
1.
蔗糖酶
蔗糖酶的耐热温度为50度，45度以下可保持酶活不变；在 pH3.0~8.0范围内均可保持较高的酶活； 蔗糖酶的活性中心有巯基，因此在提取时应防止其被氧化， 或者加入还原剂（如Vc）保持酶活力； 酵母细胞存在两种蔗糖酶，一种在细胞壁中，一种在细胞 质内，前者活力较高，分子量较大（约270KDa），后者活 力较低，分子量约为135KDa，两种酶的底物专一性和动力 学性质十分相似，因此，本实验未区分内酶与外酶。
2、DNS法测定还原糖量
试剂 粗酶液组 测定组1 水解液 （mL） 蒸馏水 （mL） DNS液 （mL） 1 对照组1 1 纯酶液组 测定组2 1 对照组2 1
0.5
0.5
0.5
0.5
1.0
1.0
1.0
1.0
沸水浴5min，自来水冷却，稀释至10mL，以对照组调零，记 录测定组OD540nm。
实验结果
2.
3.
1.
2.
3.
4.
5.
提取酶注意事项 了解目的物的分子量、酸碱稳定性、热稳定性， 选择合适的提取条件； 提取过程中采用缓冲液系统溶解酶，并可添加 一些保护剂（如还原剂、金属螯合剂等）； 提取过程一般保持低温、避免剧烈搅拌、强酸、 强碱等变性的因素； 一般先选择分辨率低处理量大的方法（如萃取、 沉淀、吸附）浓缩酶，再采用分辨率高的方法 （如离子交换层析、亲和层析、超滤）精制； 通过酶活测定，调节提取条件。
1.
测定酶活的原理
蔗糖酶可作用于 β － 1 ， 2 糖苷键，将蔗糖水解为 D －葡 萄糖和D－果糖； Cu2+ 、 Zn2+ 、 Fe2+ 是其激活剂，Mn2+ 是其抑制剂。 葡萄糖和果糖具有还原性，在偏碱性条件下，可与 3 ， 5 －二硝基水杨酸共热后生成棕红色物质，在一定浓度范 围内，还原糖的量和反应液的颜色强度成正比例关系。 蔗糖酶的活力通过其水解生成的还原糖量来反映。
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3. 乙醇沉淀 将热级分II转入小烧杯中，放入冰浴（没有水的碎冰撒入
少量食盐），逐滴加入等体积预冷至-20℃的95%乙醇，同时 轻轻搅拌，共需30分钟，再在冰浴中放置10分钟，以沉淀完全。 于4℃，4700rpm，离心15min，量出体积，留出1.5ml （下次实验测定酶活力）后倾去上清，沉淀用2ml 0.02M pH7.3的Tris-HCl缓冲液充分溶解，保存于离心管中，盖上盖 子，然后将其放入冰箱中冷冻保存（称为“醇级分Ⅲ”）。
本实验提取啤酒酵母中的蔗糖酶。该酶以两种形式存在于酵 母细胞膜的外侧和内侧，在细胞膜外细胞壁中的称之为外蔗糖酶， 其活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50% 糖成分的糖蛋白。 在细胞膜内侧细胞质中的称之为内蔗糖酶，含有少量的糖。两种 酶的蛋白质部分均为双亚基，二聚体，两种形式的酶的氨基酸组 成不同，外酶每个亚基比内酶多两个氨基酸，Ser和Met，它们的 分子量也不同，外酶约为27万(或22万，与酵母的来源有关)，内 酶约为13.5万。尽管这两种酶在组成上有较大的差别，但其底物 专一性和动力学性质仍十分相似，因此，本实验未区分内酶与外 酶，而且由于内酶含量很少，极难提取，本实验提取纯化的主要 是外酶。
离子交换层析
利用不同的蛋白质分子在溶液中所帶电荷 不同，因而与离子交换树脂有不同之吸附力
而分离之
改变溶液的pH值和盐离子浓度，结合力最小 的蛋白质先洗脱下来。
离子交换层析(sephorase DEAE fast flow)
离子交换层析技术是以离子交换纤维素或以离子交换葡聚 糖凝胶为固定相，以蛋白质等样品为移动相，分离和提纯蛋白 质、核酸、酶、激素和多糖等的一项技术。
两种酶的性质对照表如下：
名称 MW 糖含量 亚基 为蔗糖的Km 为棉子糖的Km pI 最适pH 稳定pH 最适温度
外酶 27万 50% 双 26mM
150 mM 5.0 4.9 3.0-7.5 60℃
内酶13.5万 ＜3% 双 25mM
150 mM 5.0 4.5 6.0-9.0 60℃
实验中，用测定生成还原糖（葡萄糖和果糖）的量来测定蔗 糖水解的速度，在给定的实验条件下，每分钟水解底物的量 定为蔗糖酶的活力单位。比活力为每毫克蛋白质的活力单取与部分纯化 二、离子交换柱层析纯化蔗糖酶 三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定
（一）蔗糖酶的提取与部分纯化
细胞破壁的几种方法
1、高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖， 将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。 2、玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上 下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用 于量少和动物脏器组织。 3、反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞 内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 4、超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破 裂，此法多适用于微生物材料。 5、化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠 （SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理 效果更好。 6、有机溶剂沉淀法：即向水溶液中加入一定量的亲水性的有机溶剂可降低 溶质的溶解度使其沉淀被析出。
操作步骤
（1）准备一个冰浴，将研钵稳妥放入冰浴中。 （2）称取2g干啤酒酵母，称10mg蜗牛酶及适量（约4g） 二氧化硅，放入研钵中。二氧化硅要预先研细。 （3）量取预冷的甲苯12ml缓慢加入酵母中，边加边研磨成糊 状，约需60分钟。研磨时用显微镜检查研磨的效果，至酵母细 胞大部分研碎。 （4）缓慢加入预冷的20ml去离子水，每次加2ml左右，边 加边研磨，至少用30分钟。以便将蔗糖酶充分转入水相。 （5）将混合物转入1个离心管中，平衡后，用高速冷冻离心机 离心，4℃，4700rpm，15min。如果中间白色的脂肪层厚，说
亲和层析
利用分子与其配 体间特殊的、可逆性 的亲和结合作用而进 行分离的一种层析技 术。可以选用生物化 学、免疫化学或其他 结构上吻合等亲和作 用而设计的各种层析 分离方法。
凝胶过滤层析
利用一定大小孔隙的具有 网状结构的凝胶作层析介 质（如葡聚糖凝胶、琼脂 糖凝胶、聚丙烯酰胺凝胶 等），根据被分离物质的 分子大小、形状不同扩散 到凝胶孔隙内的速度不同， 因而通过层析柱的快慢不 同而分离的一种层析法。
2. 热处理
（1）预先将恒温水浴调到50℃，将盛有粗级分I的离心管稳妥 地放入水浴中，50℃下保温30分钟，在保温过程中不断轻摇离 心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，4700rpm， 离心15min。
（3）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力 及蛋白质含量（称为“热级分II”）。
明研磨效果良好。用滴管吸出上层有机相。
（6）用滴管小心地取出脂肪层下面的水相，转入另一个清洁的 离心管中，4℃，4700rpm，离心15min。
（7）将上清液转入量筒，量出体积，留出1.5ml测定酶活力 及蛋白含量。剩余部分转入清洁离心管中。
（8）用广泛pH试纸检查清液pH，用1M乙酸将pH调至5.0， 称为“粗级分I”。
酵母蔗糖酶的提取及其性质研究
1、学习酶的纯化方法，酶蛋白分离提纯的原理。
2、学习掌握细胞破壁、有机溶剂分级和离子交换柱层 析技术。
本实验可以为大家提供一个较全面的实践机会，学 习如何提取纯化、分析鉴定一种酶，并对这种酶的性质， 尤其是动力学性质作初步的研究。
实验原理
自1860年Bertholet从啤酒酵母（Sacchacomyces Cerevisiae）中发现了蔗糖酶以来，它已被广泛地进行了研究。蔗 糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷果糖水解酶） （EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的β-呋喃果糖苷键水解， 具有相对专一性。不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催 化棉子糖水解，生成蜜二糖和果糖。