犬猫铜绿假单胞菌耐药性研究
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82 中国兽医杂志2021年(第57卷)第2期
Chinese Journal of Vete/nam Medicine
犬猫铜绿假单胞菌耐药性研究
高一丁1,张伟伟2,邓晓昆2,王 权2,于咏兰1
(1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193 ； 2.北京联宠国际检测中心，北京海淀100089)
摘要:为了解北京地区犬、猫感染的铜绿假单胞菌的耐药情况和该菌对氟唾诺酮类的耐药机制，本试验选取从就诊犬、
基因和oqxAB基因，共有19株菌株检测出aac (6 ' )-Ib
基因,经
列 对 ,19
列为
能的氨基糖L酰基转移酶，无介导氟座诺酮耐药功
能&经PCR特异性扩增后,52株菌株均扩增出了
gy+、gy+、pa+、pa+基因序列，见表2&经与标准
列对
,共9
生了 GyeA 基酸的
替代;3株发生了 ParC氨基酸的替代;5株发生了
铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa, P.
aeruginosa),又名绿
，感染犬、猫时最常见的是
引起耳道炎
部的
， 见、呼
吸道和血液感染等［1］。
治 P- aeruginosa感染
大，因对多种
生素，如氨7
收稿日期：2020—01—15 作者简介:高一丁 (1994 -),男，硕士,研究方向为临床兽医 学,从事小动物临床工作,E-mail：gadmmg/412@ 163- com 通信作者：于咏兰，E-mail: gaodiCihao@ cau. edu. cn
2结果
2.1菌株药敏试验 药物琼脂平板上的P- ae+gi-
noa以单菌落的形式生长，在低浓度药物琼脂平板
上可见黄绿色或绿色色素扩散，质控菌对所有药物
的MIC均在规定范围内，试验菌株对各抗生素的敏
感 见 2&
2.2菌株氟座诺酮类药物耐药机制分析52株
P. aeruginosa 中，均未检测出 qnrA、qn+、qn+、qepA
猫中分 的52 铜绿 胞菌，应
法检测 对各药物的最
，
聚合酶链式反应特异性扩增
□型拓扑异构酶基因与质 导的
基因。
试验结果 ，分
对头 睫敏感率为96.2% (50/52),
对头抱PQ、美罗培南敏感率均为98. 1% (51/52)，对恩诺沙星、马波沙星、左氧氟沙星的敏感率为70% -80%，对基糖L
类药物和亚胺培南敏感率为50%。未检测出质粒介导耐药基因的菌株(0/52 );检测出□型拓扑异构酶基因中gyrA ( r =
GAO Yi-ding1, ZHANG Wei-wei2, DENG Xico-kun2, WANG Quan2, YU Yong-lcn1
(1. Colleyo of Veterinam Medicine , China Ag/cu/urai University , Beijing 100193 , China ； 2. Beijing Lpot Veterinam Diagnostic Center , Beijing 100089 , China)
Key words ： Pseudomonas aeruginose ； antimiembial resistance ； type " topoisomerase ； p/smiC meditated quinolones resist ance
Corresponding author: YU Yong-/n , E-mail : gaodifeihao@ cau. edu. cn
生素，避免犬、猫铜绿 胞
性增强&
关键词:铜绿 胞菌；
性；"拓扑异构酶；质 导耐药
中图分类号：S858.292
文献标志码:A
文章编号：0529—6005(2021 )02—0082—05
Researck of Antibiotic Resistance of Pseudomonas aeruginosa in Doge and Catr
基因发生 ，导 基酸序列
wk.baidu.com
，药
Chinese Journal of Veterina/ Medicine
物与作用靶点结合的紧密性被破坏导致药物失 效来源于质粒可介导氟座诺酮耐药的基因包 括qnr基因家族,aac ( 6 ' ) -Ib-cr基因、oqEB基因和 qepA基因，其介导氟座诺酮耐药的机制包括保护药 物作用位点、水解药物和主动将药物排出细菌 体等⑷&
ParE氨基酸的替代;无菌株发生GyrB氨基酸的替
代，见表3 &采用SPSS 20- 0软件对数据进行统计分
析，使用偏相关分析对GyrE、ParC、ParE氨基酸替换
与氟座诺酮类药物耐药结果进行差异显著性检验,
结果发现本试验中，GyrB氨基酸替换(a =0- 392,
P =0.004)、ParC 氨基酸替换(r = 0. 326, P =
1材料与方法
1. 1 试验菌株 本试验检测P- aeruginosa共52 株,采集于2017年12月一2019年1月，其中20株 为北京联宠国际检测中心分离保存,32株为本实验 室保存样品&其中皮肤源菌株17株，耳道源菌株 18株，呼吸道菌株17株& 52株菌株中，33株来源 于犬,19株来源于猫& 1- 2试剂和仪器 抗生素标准品，购自北京索莱宝 科技有限公司、上海陶素生化科技有限公司和中国 食品药品检定研究院;MH( A)琼脂干粉，购自北京 陆桥生物技术有限责任公司；质粒提取试剂盒，购 自天根生化科技(北京)有限公司；碳酸氢钠、氢氧 化钠、二水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠，均购自 国药集团化学试剂有限公司；PCR Mix、PCR Marke/核酸染料及TAE缓冲液等试剂，均购自北京康 润诚业生物科技有限公司&试验中使用的引物由 上海美吉生物医药科技有限公司合成&主要试验 仪器包括：海尔青岛股份有限公司HR40氨E2生 物安全柜,MCOK8AC三洋二氧化碳培养箱,北京 六一生物科技有限公司DYY-6D型电泳仪和Vetk 96梯度基因扩增仪& 1-3方法 1.3.1菌株药敏试验 将保存好的菌株接种于血 琼脂平板上，在37 1条件下过夜复苏获得纯化菌 落&参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and LaboeatoeyStandaedsInstitute, CLSI) -VET08 记录的琼脂稀释法测定菌株对左氧氟沙星、马波沙 星、恩诺沙星、多西环素、庆大霉素、阿米卡星、头抱
关于P. aeruginosa^药性的研究，目前国内大 多集中于经济动物和实验动物，少有关于犬、猫源 P- aeruginosa的相关研究。氟座诺酮类药物抗药谱 广、吸收好、副作用低,被作为治疗细菌感染的常用 药，并存在滥用现象&本试验收集52株来源于犬、 猫的P- aeruginosa,通过琼脂稀释试验检测其耐药 谱，通过PCR特异性扩增探索其对氟座诺酮类药物 的耐药基因，为犬、猫P- aeruginosa感染后的科学 防治提供依据&
林、阿莫西林、头抱*Q、头抱曲松有天然耐药
性［2］&
对
物 的机制主要为2
种： 靶的
质 导 (Plasmid medc
tated quino/na resistance, PMQR)。作用靶点的突变
认为
对
的主要机制，而质
导 目前被认为
科 中。
物
的2种"型拓扑异构
酶,分别由gyrA%gyrA基因和parC、parE基因调控。
毗Q、头抱他O、亚胺培南、美罗培南的最小抑菌浓
中国兽医杂志2021年(第57卷)第2期 83
度(Minimum inhibito/ concentration, MIC ) & 试验中 各药物所需溶剂与助溶剂参考CLSEAET08与2018 版CLSI标准所述& 1.3.2菌株氟座诺酮耐药机制分析 使用细菌基 因组DNA提取试剂盒提取所有菌株的基因组DNA 作为n型拓扑异构酶基因模板，并扩增目标序列& 扩增程序：94 1预变性3 min；94 1变性30 \,55 1 退火30 \ ,72 1延伸50 \,共35个循环；72 1再延 伸8 mid。PCR扩增体系：模板4 $L, Taq Mia 25 $L,ddH2O17 $L，上下游引物各2 $L&各目标序列 所用引物参照参考文献［3］进行设计，见表1&使用 质粒提取试剂盒提取所有菌株的质粒DNA作为 PMQR基因模板，并扩增目标序列&扩增条件: 94 1 预变性 3 min；94 1 变性 30 \,55 1 退火 30 \, 72 1 延伸 50 s, 共 35 个循环； 72 1 延伸 8 min& PCR 体系：模板 4 $L、Taq Mia 25 $L、ddH2O 17 $L、 上下游引物各2 $L&各目标序列所用引物参考文 献［5)，见表1 &配制2%琼脂糖凝胶，将PCR扩增 产物进行电泳鉴定，并将阳性产物送至测序公司 测序，将所得序列与标准序列比对鉴定&
Abstract: To mvestigaW the antibiotic resistance pattern of Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) infected canine and feline in Beijing and the resistance mechanisms of P. aeruginosa to auoroquinolonos, 52 P. ceruginose were isolated from doxs and cats and minimai inhibitom concentration of isolates were tested to some antibiotic by aaar dilution. Type " topoisomerase genes and plasmin meditated quinolone resistance genes were amplified specifically by PCR. Antibiotic susceptibility testing showed that the susceptible rate of isolates to ceftazidice was 96. 2% (50/52) , and to cefepimo and meropenem was 98. 1 % (51/52 ). The susceptible rate to enroWoxacin and marboSoxacin,levoWoxacin was 70% to 80% , and the susceptible rate to aminox/coside and imipenem was 50%. There were no p/smiC-meditated quinolones genes detected in any strains. The type " topoisomerases genes,gpA,parA and par were mutated and had significant low correlation with auoroquinolonos resistance. 17.3% (9/52) of the strains had auoroquinolonos resistance but without type " topoisomerases genes. The results showed that ceftazidime, cefepimo and fluoroquinolones arc the fict choico for P. aeruginose infection Weatwen-, and the antibiotic should bo used properly to avid enhancement of drug resistance of P. aeruginose.
0.392,P=0.004)、pat ( r =0.326, P = 0. 018 )、pat ( r = 0. 294, P = 0. 034 "发生突变，且与氟唾诺酮耐药性低度相关,
17.3% (9/52)的
口型拓扑异构酶基因
。本试验结果 ，头 O、头 PQ和 诺
酮类药物
铜绿假单胞菌感染的首选 ；应 合
Chinese Journal of Vete/nam Medicine
犬猫铜绿假单胞菌耐药性研究
高一丁1,张伟伟2,邓晓昆2,王 权2,于咏兰1
(1.中国农业大学动物医学院，北京海淀100193 ； 2.北京联宠国际检测中心，北京海淀100089)
摘要:为了解北京地区犬、猫感染的铜绿假单胞菌的耐药情况和该菌对氟唾诺酮类的耐药机制，本试验选取从就诊犬、
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基因,经
列 对 ,19
列为
能的氨基糖L酰基转移酶，无介导氟座诺酮耐药功
能&经PCR特异性扩增后,52株菌株均扩增出了
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,共9
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替代;3株发生了 ParC氨基酸的替代;5株发生了
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，感染犬、猫时最常见的是
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吸道和血液感染等［1］。
治 P- aeruginosa感染
大，因对多种
生素，如氨7
收稿日期：2020—01—15 作者简介:高一丁 (1994 -),男，硕士,研究方向为临床兽医 学,从事小动物临床工作,E-mail：gadmmg/412@ 163- com 通信作者：于咏兰，E-mail: gaodiCihao@ cau. edu. cn
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2.1菌株药敏试验 药物琼脂平板上的P- ae+gi-
noa以单菌落的形式生长，在低浓度药物琼脂平板
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的MIC均在规定范围内，试验菌株对各抗生素的敏
感 见 2&
2.2菌株氟座诺酮类药物耐药机制分析52株
P. aeruginosa 中，均未检测出 qnrA、qn+、qn+、qepA
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，
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□型拓扑异构酶基因与质 导的
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类药物和亚胺培南敏感率为50%。未检测出质粒介导耐药基因的菌株(0/52 );检测出□型拓扑异构酶基因中gyrA ( r =
GAO Yi-ding1, ZHANG Wei-wei2, DENG Xico-kun2, WANG Quan2, YU Yong-lcn1
(1. Colleyo of Veterinam Medicine , China Ag/cu/urai University , Beijing 100193 , China ； 2. Beijing Lpot Veterinam Diagnostic Center , Beijing 100089 , China)
Key words ： Pseudomonas aeruginose ； antimiembial resistance ； type " topoisomerase ； p/smiC meditated quinolones resist ance
Corresponding author: YU Yong-/n , E-mail : gaodifeihao@ cau. edu. cn
生素，避免犬、猫铜绿 胞
性增强&
关键词:铜绿 胞菌；
性；"拓扑异构酶；质 导耐药
中图分类号：S858.292
文献标志码:A
文章编号：0529—6005(2021 )02—0082—05
Researck of Antibiotic Resistance of Pseudomonas aeruginosa in Doge and Catr
基因发生 ，导 基酸序列
wk.baidu.com
，药
Chinese Journal of Veterina/ Medicine
物与作用靶点结合的紧密性被破坏导致药物失 效来源于质粒可介导氟座诺酮耐药的基因包 括qnr基因家族,aac ( 6 ' ) -Ib-cr基因、oqEB基因和 qepA基因，其介导氟座诺酮耐药的机制包括保护药 物作用位点、水解药物和主动将药物排出细菌 体等⑷&
ParE氨基酸的替代;无菌株发生GyrB氨基酸的替
代，见表3 &采用SPSS 20- 0软件对数据进行统计分
析，使用偏相关分析对GyrE、ParC、ParE氨基酸替换
与氟座诺酮类药物耐药结果进行差异显著性检验,
结果发现本试验中，GyrB氨基酸替换(a =0- 392,
P =0.004)、ParC 氨基酸替换(r = 0. 326, P =
1材料与方法
1. 1 试验菌株 本试验检测P- aeruginosa共52 株,采集于2017年12月一2019年1月，其中20株 为北京联宠国际检测中心分离保存,32株为本实验 室保存样品&其中皮肤源菌株17株，耳道源菌株 18株，呼吸道菌株17株& 52株菌株中，33株来源 于犬,19株来源于猫& 1- 2试剂和仪器 抗生素标准品，购自北京索莱宝 科技有限公司、上海陶素生化科技有限公司和中国 食品药品检定研究院;MH( A)琼脂干粉，购自北京 陆桥生物技术有限责任公司；质粒提取试剂盒，购 自天根生化科技(北京)有限公司；碳酸氢钠、氢氧 化钠、二水磷酸二氢钠、十二水磷酸氢二钠，均购自 国药集团化学试剂有限公司；PCR Mix、PCR Marke/核酸染料及TAE缓冲液等试剂，均购自北京康 润诚业生物科技有限公司&试验中使用的引物由 上海美吉生物医药科技有限公司合成&主要试验 仪器包括：海尔青岛股份有限公司HR40氨E2生 物安全柜,MCOK8AC三洋二氧化碳培养箱,北京 六一生物科技有限公司DYY-6D型电泳仪和Vetk 96梯度基因扩增仪& 1-3方法 1.3.1菌株药敏试验 将保存好的菌株接种于血 琼脂平板上，在37 1条件下过夜复苏获得纯化菌 落&参考美国临床和实验室标准协会(Clinical and LaboeatoeyStandaedsInstitute, CLSI) -VET08 记录的琼脂稀释法测定菌株对左氧氟沙星、马波沙 星、恩诺沙星、多西环素、庆大霉素、阿米卡星、头抱
关于P. aeruginosa^药性的研究，目前国内大 多集中于经济动物和实验动物，少有关于犬、猫源 P- aeruginosa的相关研究。氟座诺酮类药物抗药谱 广、吸收好、副作用低,被作为治疗细菌感染的常用 药，并存在滥用现象&本试验收集52株来源于犬、 猫的P- aeruginosa,通过琼脂稀释试验检测其耐药 谱，通过PCR特异性扩增探索其对氟座诺酮类药物 的耐药基因，为犬、猫P- aeruginosa感染后的科学 防治提供依据&
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物 的机制主要为2
种： 靶的
质 导 (Plasmid medc
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科 中。
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酶,分别由gyrA%gyrA基因和parC、parE基因调控。
毗Q、头抱他O、亚胺培南、美罗培南的最小抑菌浓
中国兽医杂志2021年(第57卷)第2期 83
度(Minimum inhibito/ concentration, MIC ) & 试验中 各药物所需溶剂与助溶剂参考CLSEAET08与2018 版CLSI标准所述& 1.3.2菌株氟座诺酮耐药机制分析 使用细菌基 因组DNA提取试剂盒提取所有菌株的基因组DNA 作为n型拓扑异构酶基因模板，并扩增目标序列& 扩增程序：94 1预变性3 min；94 1变性30 \,55 1 退火30 \ ,72 1延伸50 \,共35个循环；72 1再延 伸8 mid。PCR扩增体系：模板4 $L, Taq Mia 25 $L,ddH2O17 $L，上下游引物各2 $L&各目标序列 所用引物参照参考文献［3］进行设计，见表1&使用 质粒提取试剂盒提取所有菌株的质粒DNA作为 PMQR基因模板，并扩增目标序列&扩增条件: 94 1 预变性 3 min；94 1 变性 30 \,55 1 退火 30 \, 72 1 延伸 50 s, 共 35 个循环； 72 1 延伸 8 min& PCR 体系：模板 4 $L、Taq Mia 25 $L、ddH2O 17 $L、 上下游引物各2 $L&各目标序列所用引物参考文 献［5)，见表1 &配制2%琼脂糖凝胶，将PCR扩增 产物进行电泳鉴定，并将阳性产物送至测序公司 测序，将所得序列与标准序列比对鉴定&
Abstract: To mvestigaW the antibiotic resistance pattern of Pseudomonas aeruginosa ( P. aeruginosa) infected canine and feline in Beijing and the resistance mechanisms of P. aeruginosa to auoroquinolonos, 52 P. ceruginose were isolated from doxs and cats and minimai inhibitom concentration of isolates were tested to some antibiotic by aaar dilution. Type " topoisomerase genes and plasmin meditated quinolone resistance genes were amplified specifically by PCR. Antibiotic susceptibility testing showed that the susceptible rate of isolates to ceftazidice was 96. 2% (50/52) , and to cefepimo and meropenem was 98. 1 % (51/52 ). The susceptible rate to enroWoxacin and marboSoxacin,levoWoxacin was 70% to 80% , and the susceptible rate to aminox/coside and imipenem was 50%. There were no p/smiC-meditated quinolones genes detected in any strains. The type " topoisomerases genes,gpA,parA and par were mutated and had significant low correlation with auoroquinolonos resistance. 17.3% (9/52) of the strains had auoroquinolonos resistance but without type " topoisomerases genes. The results showed that ceftazidime, cefepimo and fluoroquinolones arc the fict choico for P. aeruginose infection Weatwen-, and the antibiotic should bo used properly to avid enhancement of drug resistance of P. aeruginose.
0.392,P=0.004)、pat ( r =0.326, P = 0. 018 )、pat ( r = 0. 294, P = 0. 034 "发生突变，且与氟唾诺酮耐药性低度相关,
17.3% (9/52)的
口型拓扑异构酶基因
。本试验结果 ，头 O、头 PQ和 诺
酮类药物
铜绿假单胞菌感染的首选 ；应 合