养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的分离、毒力分析及ERIC-PCR分型

第３３卷第４期大连海洋大学学报Ｖｏｌ.３３Ｎｏ.４２０１８年８月ＪＯＵＲＮＡＬＯＦＤＡＬＩＡＮＯＣＥＡＮＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＡｕｇ.２０１８
ＤＯＩ:１０.１６５３５/ｊ.ｃｎｋｉ.ｄｌｈｙｘｂ.２０１８.０４.００３文章编号:２０９５－１３８８(２０１８)０４－０４３０－０５养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的分离㊁毒力
分析及ＥＲＩＣ－ＰＣＲ分型
徐阳１㊁２ꎬ姚洪１ꎬ乔帼２ꎬ李华１ꎬ叶仕根１ꎬ黎睿君１ꎬ李强２(１ 大连海洋大学农业部北方海水增养殖重点实验室ꎬ辽宁大连１１６０２３ꎻ２ 盐城工学院海洋与生物工程学院ꎬ江苏盐城２２４０５１)
摘要:为对辽宁省葫芦岛市养殖患病大菱鲆Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｍａｘｉｍｕｓ(Ｌ )全年感染嗜水气单胞菌Ａｅｒｏｍｏｎａｓ
ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ情况进行调查ꎬ通过细菌１６ＳｒＲＮＡ基因序列分析ꎬ以及嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因
的双重ＰＣＲ扩增对分离株进行鉴定ꎮ结果表明:调查中共分离到７株嗜水气单胞菌(ＡＰ４０３０１㊁ＡＰ４０４０１㊁
ＡＰ４０４０２㊁ＡＰ４０４０３㊁ＡＰ４０５０１㊁ＡＰ４０５０２和ＡＰ４０５０３)ꎬ且均含有气溶素基因(ａｅｒＡ)ꎻＥＲＩＣ－ＰＣＲ结果进
一步显示ꎬ７株嗜水气单胞菌存在独立基因型ꎬ分别标记为Ⅰ和Ⅱ型ꎬ其中Ⅰ型分离株中有３株来自绥中ꎬ
１株来自兴城ꎬⅡ型分离株３株均来自兴城ꎻ人工感染试验显示ꎬ７株嗜水气单胞菌均具有强致病性ꎬ致病
率为１００％ꎮ本研究结果可为养殖大菱鲆的临床诊断以及疾病防控提供理论依据ꎮ
关键词:大菱鲆ꎻ嗜水气单胞菌ꎻ毒力分析ꎻＥＲＩＣ－ＰＣＲ
中图分类号:Ｓ９４３㊀㊀㊀㊀文献标志码:Ａ
㊀㊀嗜水气单胞菌Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ为革兰氏阴性短杆菌ꎬ隶属于弧菌科㊁气单胞菌属[１]ꎮ该菌在水产养殖过程中可导致鱼㊁虾等多种水生生物感染ꎬ是一类发病率高㊁危害极其严重的水生生物病原菌ꎮ感染该菌后可引发水生动物的败血症ꎬ患病鱼的临床症状为胸鳍㊁尾鳍㊁腹鳍充血ꎬ体表溃烂ꎬ内脏充血ꎬ体色发黑ꎬ出现腹水等[２－５]ꎮ大菱鲆Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｍａｘｉｍｕｓ(Ｌ )隶属于鲽形目Ｐｌｅｕｒｏｎｅｃｔｉｆｏｒｍｅｓ㊁鲆科Ｂｏｔｈｉｄａｅ㊁菱鲆属Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓ[６]ꎬ是中国北方工厂化养殖的主要鱼类ꎬ近年来ꎬ随着养殖规模和密度的不断扩大ꎬ以及缺乏对疾病的有效控制等ꎬ使得一些病原细菌广为散播ꎬ导致鱼类大量发病和死亡[７]ꎮ感染嗜水气单胞菌的患病大菱鲆主要表现为摄食下降㊁活力减弱㊁体色变黑㊁腹部膨胀ꎬ各鳍基部㊁口部均有出血ꎬ病鱼在水体中行动迟缓[８]ꎮ笔者经过一年多的时间ꎬ对辽宁省葫芦岛市养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的情况进行了调查ꎬ本研究中对分离菌株毒力进行了分析ꎬ并结合ＥＲＩＣ－ＰＣＲ指纹图谱ꎬ以期确定该病原菌的基因型及其与致病性的关系ꎬ为临床病情防控提供理论依据ꎮ
１㊀材料与方法
１ １㊀材料
患病大菱鲆体长为１０~２０ｃｍꎬ取自葫芦岛兴城市４个养殖场和绥中县５个养殖场ꎬ取样时间为
２０１４年１月 ２０１５年４月ꎬ每月定期采样ꎬ共获得１３５尾病鱼ꎬ其中从兴城共获得７８尾病鱼ꎬ从绥中共获得５７尾病鱼ꎮ患病大菱鲆主要症状为红嘴及溃疡ꎬ鱼体腹部㊁鳍基部和体侧部存在不同程度的充血ꎮ
１ ２㊀方法
１ ２ １㊀细菌分离㊀从患病大菱鲆心脏㊁肝脏㊁嘴㊁鳃㊁尾鳍处分离细菌ꎬ无菌条件下采用平板菌落划线法接种在胰蛋白胨大豆琼脂(ＴＳＡ)培养基上ꎬ于２８ħ下培养４８ｈꎬ挑选优势菌进一步纯化㊁保种ꎮ
１ ２ ２㊀细菌鉴定㊀采用水煮法提取细菌ＤＮＡ[９]ꎬ
㊀收稿日期:２０１７－１１－２０
㊀基金项目:国家海洋公益性行业科研专项(２０１４０５００３)ꎻ辽宁省海洋渔业厅重点攻关项目(２０１４０２)㊀作者简介:徐阳(１９９４ )ꎬ女ꎬ硕士研究生ꎮＥ－ｍａｉｌ:３４６９０５６８５＠ｑｑ ｃｏｍ
㊀通信作者:李强(１９７９ )ꎬ男ꎬ博士ꎬ教授ꎮＥ－ｍａｉｌ:ｆｉｓｈ７９０６０８＠１６３ ｃｏｍ
所用引物为细菌１６ＳｒＤＮＡ通用引物ꎬ引物序列如表１所示ꎮＰＣＲ产物送往北京华大基因研究中心进行测序ꎬ测序结果通过Ｂｌａｓｔ软件进行比对ꎮ参照王友娟等[１０]的方法ꎬ采用嗜水气单胞菌的特异性引物和气溶素基因(ａｅｒＡ毒素)引物进行双重ＰＣＲ检测ꎬ引物序列如表１所示ꎮ反应体系(共２５μＬ):１０ˑＰＣＲｂｕｆｆｅｒ(含Ｍｇ２＋)２ ５μＬꎬｄＮＴＰＭｉｘ２μＬꎬ正㊁反向引物(１０ｐｍｏｌ/μＬ)各０ ５μＬꎬ模板(４０~８０ｎｇ)１μＬꎬＴａｑＤＮＡＰｏｌｙ￣ｍｅｒａｓｅ(ＢＢＩ)０ １２５μＬꎬ用ｄｄＨ２Ｏ补足至２５μＬꎮ
双重ＰＣＲ反应条件:９４ħ下预变性５ｍｉｎꎻ９４ħ下变性３０ｓꎬ５０ħ下退火３０ｓꎬ７２ħ下延伸１ｍｉｎꎬ共进行３０个循环ꎻ最后在７２ħ下再延伸１０ｍｉｎꎬ取出后置４ħ下保存备用ꎮ
表１㊀所用引物序列
Ｔａｂ １㊀Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｕｓｅｄｉｎｔｈｅｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ
引物ｐｒｉｍｅｒ
序列(５ᶄ~３ᶄ)
ｓｅｑｕｅｎｃｅ(５ᶄ－３ᶄ)
扩增产
物/ｂｐ
ｓｉｚｅｏｆ
ｐｒｏｄｕｃｔｓ
１６ＳｒＲＮＡＦ:ＡＧＡＧＴＴＴＧＡＴＣＣＴＧＧ
Ｒ:ＧＧＴＴＡＣＣＴＴＧＴＴＡＣＧＡＣＴＴ１４６５
嗜水气单胞菌特异性引物Ｆ:ＧＡＡＡＧＧＴＴＧＡＴＧＣＣＴＡＡＴＡＣＧＴＡＲ:ＣＧＴＧＣＴＧＧＣＡＡＣＡＡＡＧＧＡＣＡＧ６８５
嗜水气单胞菌气溶素基因引物Ｆ:ＧＣＡＧＡＡＣＣＣＡＴＣＴＡＴＣＣＡＧ
Ｒ:ＴＴＴＣＴＣＣＧＧＴＡＡＣＡＧＧＡＴＴＧ２５２
嗜水气单胞菌ＥＲＩＣ－ＰＣＲ引物Ｆ:ＡＴＧＴＡＡＧＣＴＣＣＴＧＧＧＧＡＴＴＣＡＣＲ:ＡＡＧＴＡＡＧＴＧＡＣＴＧＧＧＧＴＧＡＧＣＧ
１ ２ ３㊀嗜水气单胞菌人工感染试验㊀选取健康的大菱鲆(体长为１０ｃｍꎬ体质量为３０ｇ)ꎬ在规格为６０ｃｍˑ４０ｃｍˑ３０ｃｍ的水槽中暂养７ｄꎬ养殖用水为大连市黑石礁海域沙滤海水ꎬ养殖期间盐度为３０ꎬ水温为１５~１６ħꎬ２４ｈ不间断充氧ꎮ试验前将大菱鲆随机分为８组ꎬ每组１５尾鱼ꎮ取嗜水气单胞菌分离株ꎬ活化培养后制成浓度为１ ０ˑ１０８ｃｅｌｌｓ/ｍＬ的菌悬液ꎬ腹腔注射ꎬ每尾注射０ ２ｍＬ[５ꎬ１１－１２]ꎬ对照组注射等量生理盐水ꎮ连续观察１４ｄꎬ每天换水并记录死亡情况ꎮ
１ ２ ４㊀ＥＲＩＣ－ＰＣＲ分型㊀ＥＲＩＣ－ＰＣＲ引物参照Ｍａｉｔｉ等[１３]的方法ꎬ引物序列如表１所示ꎮ反应体系(共２５μＬ):１０ˑＰＣＲｂｕｆｆｅｒ(含Ｍｇ２＋)２ ５μＬꎬｄＮＴＰＭｉｘ２μＬꎬ正㊁反向引物(１０ｐｍｏｌ/μＬ)各１μＬꎬ模板(４０~８０ｎｇ)２μＬꎬＴａｑＤＮＡＰｏｌｙｍｅｒａｓｅ(ＢＢＩ)０ １２５μＬꎬ用ｄｄＨ２Ｏ补足至２５μＬꎮＰＣＲ反应条件:９４ħ下预变性７ｍｉｎꎻ９４ħ下变性３０ｓꎬ５２ħ下退火１ｍｉｎꎬ６５ħ下延伸８ｍｉｎꎬ共进行４０个循环ꎻ最后在６５ħ下再延伸１６ｍｉｎꎮ
２㊀结果与分析
２ １㊀大菱鲆感染气单胞菌的症状及产地
２０１４年１月 ２０１５年４月ꎬ从患病大菱鲆心脏㊁肝脏㊁嘴㊁鳃㊁尾鳍处共分离到９８株优势菌ꎬ经１６ＳｒＲＮＡ基因鉴定ꎬ共有１３株优势菌与气单胞菌属一致性达１００％ꎬ编号为ＡＰ４０３０１㊁ＡＰ４０３０２㊁ＡＰ４０３０３㊁ＡＰ４０７１６㊁ＡＰ４０７１９㊁ＡＰ４０７２０㊁ＡＰ￣４０７２１㊁ＡＰ４０４０１㊁ＡＰ４０４０２㊁ＡＰ４０４０３㊁ＡＰ４０５０１㊁ＡＰ４０５０２和ＡＰ４０５０３ꎬ感染气单胞菌鱼的症状及产地如表２所示ꎮ
表２㊀感染气单胞菌鱼的症状及产地
Ｔａｂ ２㊀ＳｙｍｄｒｏｍｅｏｆｔｈｅｄｉｓｅａｓｅｄｆｉｓｈａｎｄｓｏｕｒｃｅｓｏｆＡｅｒｏ￣ｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ
编号
Ｎｏ
症状
ｓｙｍｐｔｏｍ
产地
ａｒｅａＡＰ４０３０１鳃盖出血㊁溃疡㊁尾鳍出血㊁腹水㊁白便兴城ＡＰ４０３０２鳃盖出血㊁溃疡㊁尾鳍出血㊁腹水㊁白便兴城ＡＰ４０３０３肿嘴㊁围心腔积液兴城ＡＰ４０４０１红嘴㊁红鳍㊁溃疡绥中ＡＰ４０４０２红鳍㊁分叉㊁红嘴㊁突眼㊁溃疡绥中ＡＰ４０４０３红嘴㊁溃疡㊁白便绥中ＡＰ４０５０１红嘴㊁红鳍㊁体表溃疡兴城ＡＰ４０５０２红嘴㊁红鳍㊁体表溃疡兴城ＡＰ４０５０３红嘴㊁红鳍㊁体表溃疡兴城ＡＰ４０７１６红嘴㊁尾鳍溃烂㊁白便兴城ＡＰ４０７１９红嘴㊁烂鳍㊁白便兴城ＡＰ４０７２０红嘴㊁烂鳍㊁肠积水㊁白便绥中ＡＰ４０７２１红鳍㊁体表溃烂绥中２ ２㊀嗜水气单胞菌的鉴定
经嗜水气单胞菌特异性引物和气溶素基因双重ＰＣＲ检测ꎬ发现１３株优势菌中有７株在２５２ｂｐ和６８５ｂｐ处均出现清晰条带(图１)ꎬ这表明ꎬ此７株分离株(ＡＰ４０３０１㊁ＡＰ４０４０１㊁ＡＰ４０４０２㊁ＡＰ４０４０３㊁ＡＰ４０５０１㊁ＡＰ４０５０２和ＡＰ４０５０３)为嗜水气单胞菌Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａꎬ并有潜在致病性ꎮ
２ ３㊀嗜水气单胞菌人工感染试验
７株嗜水气单胞菌人工感染试验组ꎬ第３天便开始出现死亡ꎬ第４天出现死亡高峰期ꎬ６天内致
１３４
第４期徐阳ꎬ等:养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的分离㊁毒力分析及ＥＲＩＣ－ＰＣＲ分型
死率为１００％ꎬ表明这７个菌株毒力较强(图２)ꎻ而对照组无死亡ꎮ人工感染试验组大菱鲆临床症状主要以躯干部肌肉充血发红为主ꎬ鱼鳍基部有血丝ꎻ剖检结果显示ꎬ肝脏呈土黄色ꎬ胆囊呈紫黑色ꎬ肠道出血发红ꎬ肠壁出现不同程度充血并伴随少量淡红色或浅黄色黏液ꎮ人工感染后的症状与大菱鲆自然发病症状相似(图
３)ꎮ
注:Ｍ为ＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１为阴性对照组(迟缓爱德华菌ＡＴＣＣ１５９４７)ꎻ２~８分别为ＡＰ４０３０１㊁ＡＰ４０４０１㊁ＡＰ４０４０２㊁ＡＰ４０４０３㊁ＡＰ４０５０１㊁ＡＰ４０５０２和ＡＰ４０５０３菌株
Ｎｏｔｅ:ＭꎬＤＬ５０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１ꎬｎｅｇａｔｉｖｅｃｏｎｔｒｏｌ(Ｅｄｗａｒｄｓ￣ｉｅｌｌａｔａｒｄａＡＴＣＣ１５９４７)ꎻ２－８ꎬＡＰ４０３０１ꎬＡＰ４０４０１ꎬＡＰ４０４０２ꎬ
ＡＰ４０４０３ꎬＡＰ４０５０１ꎬＡＰ４０５０２ａｎｄＡＰ４０５０３ｉｓｏｌａｔｅｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅ￣ｌｙ
图１㊀嗜水气单胞菌分离菌株特异性基因的琼脂糖电泳
结果
Ｆｉｇ １㊀Ａｇａｒｏｓｅｅｌｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇｓｐｅｃｉｆｉｃｉ￣
ｔｙｇｅｎｅｓｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｉｓｏｌａｔｅｄ
ｓｔｒａｉｎｓ
图２㊀大菱鲆人工感染７株细菌的试验结果Ｆｉｇ ２㊀Ｒｅｓｕｌｔｓｏｆａｒｔｉｆｉｃｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎｔｅｓｔｓｏｆｔｕｒｂｏｔｃｈａｌ￣
ｌｅｎｇｅｄｂｙＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｉｓｏｌａｔｅｓ
２ ４㊀嗜水气单胞菌ＥＲＩＣ－ＰＣＲ分型
７株嗜水气单胞菌经ＥＲＩＣ－ＰＣＲ扩增表明ꎬ
ＰＣＲ产物包含２~７条带ꎬ有主带２~４条ꎬ大小为
１８０~１５００ｂｐ(图４)ꎮ聚类分析显示ꎬ７株嗜水气单胞菌分为２种基因型ꎬ分别标记为Ⅰ和Ⅱ型(图
５)ꎮ
注:Ａ为红鳍ꎻＢ为内脏出血
Ｎｏｔｅ:ＡꎬｒｅｄｆｉｎꎻＢꎬｖｉｓｃｅｒａｌｈｅｍｏｒｒｈａｇｅ
图３㊀人工感染大菱鲆的主要临床症状
Ｆｉｇ ３㊀Ｐｒｉｍａｒｙｃｌｉｎｉｃａｌｓｙｍｐｔｏｍｓｏｆｔｕｒｂｏｔｉｎｔｈｅａｒｔｉ￣
ｆｉｃｉａｌｉｎｆｅｃｔｉｏｎ
ｇｒｏｕｐ
注:Ｍ为ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１~７分别为ＡＰ４０３０１㊁ＡＰ４０４０１㊁ＡＰ４０４０２㊁ＡＰ４０４０３㊁ＡＰ４０５０１㊁ＡＰ４０５０２㊁ＡＰ４０５０３菌株
Ｎｏｔｅ:ＭꎬＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒꎻ１－７ꎬＡＰ４０３０１ꎬＡＰ４０４０１ꎬ
ＡＰ４０４０２ꎬＡＰ４０４０３ꎬＡＰ４０５０１ꎬＡＰ４０５０２ａｎｄＡＰ４０５０３ｉｓｏｌａｔｅｓꎬｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ
图４㊀嗜水气单胞菌分离株ＥＲＩＣ－ＰＣＲ指纹图
Ｆｉｇ ４㊀ＦｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔｃｌｕｓｔｅｒｉｎｇａｎａｌｙｓｉｓｄｉａｇｒａｍｏｆＡｅｒｏ￣
ｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｉｓｏｌａｔｅｓｂｙＥＲＩＣ－ＰＣＲ
其中ꎬⅠ型菌株为４株ꎬⅡ型菌株３株ꎮ此外ꎬ不同地区分布的嗜水气单胞菌的聚类特征差异明显ꎬⅠ型分离株中有３株来自绥中ꎬ１株来自兴城ꎻⅡ型分离株３株均来自兴城ꎮ根据Ｈｕｎｔｅｒ等[１４]的计算方法ꎬ该分型方法的辨别指数值为８７％ꎮ
２３４大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３３卷
图５㊀嗜水气单胞菌分离株的系统进化树
Ｆｉｇ ５㊀ＰｈｙｌｏｇｅｎｅｔｉｃｔｒｅｅｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｉｓｏ￣ｌａｔｅｓ
３㊀讨论
嗜水气单胞菌是水产养殖过程中的常见病菌ꎬ其主要感染对象包括淡水鱼㊁虾及其他水生动物ꎮ本研究中ꎬ对辽宁省葫芦岛市养殖大菱鲆全年感染嗜水气单胞菌的情况进行了调查ꎬ通过细菌分离共获得９８株优势菌ꎬ其中ꎬ有７株属嗜水气单胞菌ꎬ占比约７％ꎬ说明嗜水气单胞菌已成为辽宁地区养殖大菱鲆病害中不可忽视的一种病原菌ꎮ
３ １㊀养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的毒力分析
嗜水气单胞菌的主要毒力因子包括外毒素㊁蛋白酶㊁Ｓ蛋白㊁菌毛㊁外膜蛋白等[１]ꎬ其中外毒素ꎬ即气溶素(ａｅｒＡ毒素)ꎬ是目前公认的主要致病因子ꎬ在细胞内以气溶素前体的形式合成ꎬＮ末端具有一个典型的２３个氨基酸残基的信号序列ꎬ可引导无活性的气溶素前体透过细胞膜而分泌到胞外ꎬＣ末端切去２５个氨基酸残基后被激活ꎬ其作用机制是结合到真核细胞的专一受体后ꎬ该毒素即聚集成六聚体ꎬ并插入细胞的类脂双分子层ꎬ形成３ｎｍ的通道[１５]ꎮ
研究表明ꎬ含有气溶素的嗜水气单胞菌均有强致病性ꎮ朱建萍等[１６]分离自感染症状严重的三角帆蚌Ｈｙｒｉｏｐｓｉｓｃｕｍｉｎｇｉｉ体内的５株嗜水气单胞菌携带气溶素基因ꎮ王友娟等[１０]在对辽宁省不同地区㊁不同鱼类㊁不同症状病鱼的嗜水气单胞菌感染情况的研究中ꎬ分离得到２６株嗜水气单胞菌ꎬ其中ꎬ有１７株同时扩增出２５２ｂｐ大小的气溶素基因ꎮ本研究结果证实ꎬ所获得的７株嗜水气单胞菌均含有气溶素基因ꎬ而且人工感染试验也证明其具有强致病性ꎬ这与前人的研究结果一致ꎮ本研究表明ꎬ辽宁地区患病大菱鲆分离的嗜水气单胞菌均含有气溶素基因ꎬ并具有高致病性ꎬ生产中须引起足够重视ꎮ３ ２㊀养殖大菱鲆感染嗜水气单胞菌的ＥＲＩＣ－ＰＣＲ分型
由于嗜水气单胞菌存在多种基因型ꎬ导致其致病性普遍存在一些差异ꎬ因此ꎬ开展气单胞菌基因分型的研究势在必行[１７]ꎮ传统细菌分型方法主要基于表型特征ꎬ但细菌表型特征受外界环境波动影
响较大ꎬ致使分型结果不是非常可信[１８]ꎮ目前ꎬ细菌基因分型方法较多ꎬ其中ꎬ脉冲场凝胶电泳法(ＰＦＧＥ)精确度最高[１９]ꎬ但可操作性差ꎬ而ＥＲＩＣ－ＰＣＲ法因操作简单且区分能力和重复性与ＰＦＧＥ法相近ꎬ更易于被普通实验室接受[２０]ꎮ本研究中ＥＲＩＣ－ＰＣＲ结果显示ꎬ葫芦岛地区７株嗜水气单胞菌能扩增出２~７条带ꎬ条带大小为１８０~１５００ｂｐꎬ可分为２个基因型ꎬ同时ꎬ７株嗜水气单胞菌分别在约２００ｂｐ和６００ｂｐ处出现相同条带ꎮ而罗志飞等[２１]对南方多省的嗜水气单胞菌进行分型时发现ꎬ菌株条带大小为５００~３０００ｂｐꎬ与本研究结果有差异ꎬ说明不同地区㊁不同养殖水域同种细菌的ＥＲＩＣ－ＰＣＲ结果存在一定差异ꎮ此外ꎬＡｇｕｉｌｅｒａ－Ａｒｒｅｏｌａ等[２２]通过ＥＲＩＣ－ＰＣＲ证实ꎬ宿主和环境相似的嗜水气单胞菌菌株有聚类趋势ꎮ然而ꎬ本试验结果显示ꎬ背景来源相似的嗜水气单胞菌却呈现两种基因型ꎬ这与其他研究结果有差异ꎮ通过与肖丹等[２３]报道的嗜水气单胞菌ＥＲＩＣ－ＰＣＲ指纹图谱进行对比ꎬ发现Ⅱ型嗜水气单胞菌是常见嗜水气单胞菌基因型ꎬ无明显的地域差异性ꎬ而Ⅰ型嗜水气单胞菌可能为辽宁葫芦岛地区独立的基因型ꎮ推测可能的原因是绥中㊁兴城两地的地理环境和水域环境存在着一定的差异ꎮ因此ꎬ在防控嗜水气单胞菌引起的流行性疾病时ꎬ有必要对地方性某些独立基因型按照其不同的流行规律制定相应的治病方案ꎮ
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ｃｉｌｅｉｎａｎｅｏｎａｔａｌｉｎｔｅｎｓｉｖｅｃａｒｅｕｎｉｔ[Ｊ].ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｌｉｎｉｃａｌＭｉ￣
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ｕｒａｌＡｅｒｏｍｏｎａｓｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａｓｕｂｓｐ.ｓａｌｍｏｎｉｃｉｄａｉｎｆｅｃｔｉｏｎ[Ｊ].Ａｑ￣
ｕａｃｕｌｔｕｒｅꎬ２０１４ꎬ４２８－４２９:１１１－１１６.
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Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｃｌｉｎｉｃａｌａｎｄｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌｅｃｏｔｙｐｅｓａｓｒｅ￣
ｖｅａｌｅｄｂｙｇｅｎｅｔｉｃｄｉｖｅｒｓｉｔｙａｎｄｖｉｒｕｌｅｎｃｅｇｅｎｅｓ[Ｊ].ＦＥＭＳＭｉｃｒｏ￣
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ＩｓｏｌａｔｉｏｎꎬｖｉｒｕｌｅｎｃｅａｎｄＥＲＩＣ－ＰＣＲｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｏｆＡｅｒｏｍｏｎａｓ
ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｉｎｆａｒｍｅｄｔｕｒｂｏｔＳｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｍａｘｉｍｕｓ(Ｌ.)
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Ａｂｓｔｒａｃｔ:ＴｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｆｒｏｍｎａｔｕｒａｌｌｙｄｉｓｅａｓｅｄｔｕｒｂｏｔＳｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｍａｘｉｍｕｓ(Ｌ.)ｉｎＨｕｌｕｄａｏＣｉｔｙꎬＬｉａｏｎｉｎｇＰｒｏｖ￣ｉｎｃｅｆｒｏｍ２０１４ｔｏ２０１５ｗｅｒｅｉｎｄｅｎｔｉｆｉｅｄａｎｄｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚｅｄｂｙ１６ＳｒＲＮＡｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｄｏｕｂｌｅＰＣＲｕ￣ｓｉｎｇＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ－ｓｐｅｃｉｆｉｃａｎｄａｅｒｏｓｏｌｇｅｎｅｐｒｉｍｅｒｓ.ＴｈｅｓｅｖｅｎｉｓｏｌａｔｅｓｗｅｒｅｓｈｏｗｎｔｏｂｅＡ.ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａꎬｗｉｔｈａｅｒｏｓｏｌｇｅｎｅｓ.ＴｈｅｉｓｏｌａｔｅｓｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇｂｙＥＲＩＣ－ＰＣＲｄｅｍｏｎｓｔｒａｔｅｄｔｈａｔｓｅｖｅｎＡ.ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｓｔｒａｉｎｓｂｅｌｏｎｇｅｄｔｏｇｅｎｏｔｙｐｅＩａｎｄｇｅｎｏｔｙｐｅＩＩꎬｉｎｗｈｉｃｈｔｈｒｅｅｓｔｒａｉｎｓｏｆｔｙｐｅＩｗｅｒｅｉｓｏｌａｔｅｄｆｒｏｍＳｕｉｚｈｏｎｇｆａｒｍｓꎬｏｎｅｓｔｒａｉｎｏｆｔｙｐｅＩｆｒｏｍＸｉｎｇｃｈｅｎｇｆａｒｍｓａｎｄａｎｏｔｈｅｒｔｈｒｅｅｓｔｒａｉｎｓｏｆｔｙｐｅＩＩｗｅｒｅｆｒｏｍＸｉｎｇｃｈｅｎｇｆａｒｍ.ＭｏｒｅｏｖｅｒꎬｔｈｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｔｅｓｔｓｂｙｔｈｅｓｅｓｅｖｅｎＡ.ｈｙｄｒｏｐｈｉｌａｓｔｒａｉｎｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔａｌｌｔｈｅｓｔｒａｉｎｓｗｅｒｅｈｉｇｈｌｙｐａｔｈｏｇｅｎｉｃｔｏｔｕｒｂｏｔꎬｗｉｔｈｔｈｅ７－ｄａｙｓｃｕ￣ｍｕｌａｔｉｖｅｍｏｒｔａｌｉｔｙ(１.０ˑ１０８ｃｅｌｌｓ/ｍＬ)ｏｆ１００％.Ｔｈｅｆｉｎｄｉｎｇｐｒｏｖｉｄｅｓａｔｈｅｏｒｅｔｉｃａｌｂａｓｉｓｆｏｒｆｕｔｕｒｅｃｌｉｎｉｃａｌｄｉａｇｎｏｓｉｓａｎｄｄｉｓｅａｓｅｐｒｅｖｅｎｔｉｏｎａｎｄｃｏｎｔｒｏｌｏｆｃｕｌｔｕｒｅｄｔｕｒｂｏｔ.
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ:Ｓｃｏｐｈｔｈａｌｍｕｓｍａｘｉｍｕｓ(Ｌ.)ꎻＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａꎻｖｉｒｕｌｅｎｃｅａｎａｌｙｓｉｓꎻＥＲＩＣ－ＰＣＲ
４３４大连海洋大学学报㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀㊀第３３卷。