免疫组化实验的详细步骤

免疫组化实验的详细步骤
1. 制备组织切片
- 将组织固定在适当的固定液中(如甲醛溶液)
- 通过脱水、清理和浸蜡等步骤制备石蜡包埋块
- 使用切片机将包埋块切成4-6微米厚的切片
- 将切片贴附到载玻片上
2. 脱蜡和水化
- 将载玻片浸入二甲苯或者相似的溶液中,去除石蜡
- 使用梯度浓度的乙醇溶液(100%,95%,70%)逐步水化切片
3. 抗原修复
- 抗原修复是一个关键步骤,可以暴露被固定过程掩盖的抗原表位 - 常用的方法包括加热诱导抗原修复和酶促抗原修复
4. 内源性过氧化物酶或者生物素的封闭
- 使用3%的过氧化氢溶液处理切片,以封闭内源性过氧化物酶活性 - 对于利用生物素-亲和素系统的实验,需要使用生物素封闭试剂进行封闭
5. 加入封闭液
- 使用含有蛋白质成分的封闭液(如牛血清白蛋白)处理切片
- 这一步可以阻止抗体的非特异性结合
6. 加入一抗
- 将特异性的一抗(如小鼠抗人蛋白单克隆抗体)稀释至适当浓度
- 滴加到切片上,在湿盒中于4℃过夜或37℃温育1-2小时
7. 加入二抗
- 洗去未结合的一抗
- 加入与一抗种属相匹配的二抗(如生物素标记的羊抗小鼠抗体)
8. 加入探针
- 对于酶促反应型免疫组化,加入酶标记的亲和素(如过氧化物酶-亲和素复合物)
- 对于荧光免疫组化,加入荧光标记的亲和素
9. 显色
- 酶促反应型:加入适当的染色底物(如),产生可见的棕黄色沉淀
- 荧光免疫组化:不需要此步骤
10. 染色和封片
- 用苏木素对细胞核进行复染
- 用封片剂和覆盖玻片封闭切片,制成永久装片
11. 观察结果
- 使用光学显微镜或荧光显微镜观察目的蛋白的分布和表达情况
以上是免疫组化实验的一般步骤,具体操作细节可能因实验目的和具体方法而有所调整。

准确无误的实验步骤需要参考相关文献和说明。