脂质体介导hHCN2基因转染HEK293细胞的效率研究
HEK-293T ACE2 细胞稳转株使用说明书
派真生物HEK-293T/ACE2 细胞稳转株使用说明书HEK-293T/ACE2 细胞稳转株HEK-293T/ACE2 细胞稳转株ACE2即血管紧张素转化酶II（Angiotensin-converting enzyme2）是一种Ⅰ型膜蛋白,其包括一个N端肽酶结构域( peptidasedomain,PD)和一个C端 Collectrin样结构域（Collectrin-ikedomain,CLD）。
ACE2的PD为冠状病毒的S蛋白提供了直接结合位点。
冠状病毒因其病毒脂质层外由棘突蛋白） spike protein,S蛋白）构成的冠状突起而得名。
冠状病毒通过S蛋白与靶细胞表面特定受体结合,然后进入细胞复制并引起宿主感染。
冠状病毒的S蛋白包含S1及S2两个亚单位,其中S1包含受体结合域（RBD）,RBD直接与血管紧张素转换酶2（ACE2）结合,S2负责与宿主细胞膜融合。
当S1与宿主受体ACE2结合时,S2上的裂解位点暴露并被宿主蛋白酶切断,此过程对于病毒感染十分重要。
本细胞系是将ACE2过表达慢病毒感染293T细胞并筛选得到的稳定株。
HEK-293T/ACE2 细胞稳转株产品描述产品名称：中文名称：包装规格：特性蛋白：HEK-293T/ACE2过表达人源 ACE2 的人肾上皮细胞2管（细胞数1E+7个/管）过表达人的血管紧张素转化酶 2 蛋白（ACE2）建议第一次 1:2 传代。
2 天换液10%DMSO +90%完全培养基Puro 嘌呤抗性传代方法: 传代情况：冻存条件：备 注：检测报告：提供感染滴度数据、293T /hACE2感染图片或荧光素酶表达量结果派真生物复苏细胞：将含有2mL 细胞悬液的冻存管在 37℃水浴中迅速摇晃解冻，加入 5mL 培养基混合均匀。
在 1000rpm 条件下离心 5 分钟，弃去上清液，补加 4-6mL 完全培养基后吹匀。
然后将所有细胞悬液加入 10cm 皿中培养过夜，培养过夜。
herk293指标
herk293指标
Hek293是一种常用的细胞系，被广泛应用于生物医学和药物研究中，用于生产外源性蛋白质、疫苗、抗癌试剂及重组腺病毒包被等。
Hek293细胞具有较高的生长效率，直径通常在11-15μm左右，属于亚3倍体人细胞系，携带64条染色体。
Hek293细胞既可以贴壁培养也可以悬浮培养，但多数
情况下，这类细胞采用贴壁的方式进行单层培养。
正常情况下，应在大约
2-3天内更换。
Hek293细胞需要设置在37°C的加湿培养箱才能生长。
此外，Hek293细胞具有以下特点：
1. 转染效率高，可悬浮培养用于大规模表达。
2. 表达蛋白结构最接近其在人体内构象。
3. Hek293细胞在培养体系中能够快速增长，高密度培养。
4. Hek293细胞与神经元细胞一样，对外界微环境较为敏感，利用这一特点，可用于药物发现及细胞毒性测试。
以上信息仅供参考，如果需要了解更多信息，建议查阅相关文献或咨询专业人士。
脂质体介导法转染肿瘤细胞效率的优化
脂质体介导法转染肿瘤细胞效率的优化潘宁;章蔼然;侯颖春【期刊名称】《生物技术》【年(卷),期】2008(18)6【摘要】目的：研究优化影响脂质体转染效率的因素，以提高脂质体转染效率，为相关研究和应用提供参考。
方法：以绿色荧光蛋白（GFP）作为报告基因，采用脂质体Lipofectamine2000包裹pU6H1-GFP-FAK重组质粒转染Caco-2细胞，研究了细胞接种密度、DNA用量、脂质体与DNA的比例、脂质体-DNA复合物的形成时间、细胞与脂质体复合物的孵育时间、血清的有元及细胞的传代次数等因素对脂质体转染效率的影响。
结果：2—5次细胞传代，2×10^5接种密度、4μgDNA用量、2．5：1的脂质体与DNA比例、30min脂质体-DNA复合物形成时间以及6h细胞与复合物孵育时间，转染效率最高。
血清在本实验室条件下并不影响转染效率。
结论：实验获得的优化条件可以明显提高脂质体对肿瘤细胞的转染效率，可作为有关研究或应用的参考。
【总页数】4页(P47-50)【关键词】脂质体;细胞转染;转染效率;肿瘤细胞【作者】潘宁;章蔼然;侯颖春【作者单位】陕西师范大学生命科学学院肿瘤细胞分子生物学实验室【正文语种】中文【中图分类】Q782;R735.35【相关文献】1.优化阳离子脂质体介导的组织因子小干扰RNA转染HEK-293的转染条件 [J], 张园;李志樑;邱健;易绍东;董凤英2.电穿孔转染法与脂质体转染法对K562和HepG2细胞转染效率的影响 [J], 隋娟;张高丽;李平法;于海川3.阳离子脂质体介导小干扰RNA转染EOMA细胞时转染条件的优化 [J], 周晓彤;沈振亚;于曙东;余云生;叶文学;黄浩岳;焦鹏;滕小梅4.脂质体介导法转染体细胞效率的优化 [J], 侯颖;李文蓉;谭立新;牛志刚5.阳离子脂质体介导的转染：血清对于表达及转染效率的影响 [J], 李克深因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
HEK293细胞瞬时转染操作步骤
HEK293细胞瞬时转染操作步骤1.前期准备1.1做好STB（随附缓冲液）的配制和预冷。
STB是一种用于转染的缓冲液，用于稀释DNA和转染试剂。
一般来说，将STB预冷至室温下即可。
1.2对HEK293细胞进行预培养和分装。
将HEK293细胞进行培养，保持在良好的生长状态，并按照实验需要将细胞分装到培养皿或板中。
2.转染操作2.1 将转染试剂预冷至室温。
一般来说，转染试剂包括聚乙烯亚胺（PEI）或脂质体（如Lipofectamine 2000）等。
根据实验需要，选择适当的转染试剂，并将其预冷至室温。
2.2在转染试剂中稀释DNA。
按照实验设计将所需的DNA溶液加入到转染试剂中，并轻轻混合。
注意需要避免剧烈振荡或搅拌，以免损坏DNA。
2.3倒掉细胞培养液，并加入转染试剂/DNA混合液。
将HEK293细胞培养液完全倒掉，并将预冷的转染试剂/DNA混合液加入到培养皿或板中。
2.4轻轻摇晃或旋转培养皿/板。
确保转染试剂/DNA均匀覆盖在细胞上。
注意需要避免过度晃动，以免对细胞造成机械伤害。
2.5将培养皿/板放回培养箱。
将转染后的培养皿/板放置在预先调整好的培养箱中。
注意需要确保培养箱内维持适宜的环境温度和湿度。
2.6定时观察细胞转染情况。
根据实验需要，设定适当的转染时间，并定时观察细胞转染的情况。
3.后期处理3.1更换培养液。
根据实验设计和转染试剂的推荐，将转染后的细胞培养液更换为适宜的培养液，并继续培养细胞。
3.2观察细胞的表型和转染效果。
根据实验设计，观察转染后细胞的表型，并评估转染效果。
3.3收集细胞上清。
如果需要收集细胞上清中的目标蛋白或其他分子，可以使用适当的方法将细胞上清收集起来。
常用转染试剂：1.PEI（聚乙烯亚胺）：PEI是一种广泛应用于转染的阳离子聚合物，可以与DNA结合并帮助其进入细胞内。
2. Lipofectamine 2000：Lipofectamine 2000是一种基于脂质体的转染试剂，能够使DNA与细胞膜融合，从而将DNA传递到细胞内。
脂质体转染_实验报告
一、实验目的本实验旨在通过脂质体转染技术将目的基因导入细胞内，研究脂质体转染方法对基因表达的影响，为后续基因功能研究提供技术支持。
二、实验材料1. 细胞：人胚肾细胞HEK2932. 载体：pGL3-Basic（含有报告基因）3. 脂质体：Lipofectamine 30004. 细胞培养试剂：DMEM培养基、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液5. 实验仪器：超净工作台、CO2培养箱、酶标仪、显微镜、PCR仪等三、实验方法1. 细胞培养：将HEK293细胞接种于6孔板，待细胞汇合至80%时进行实验。
2. 脂质体-DNA复合物制备：将pGL3-Basic质粒DNA和Lipofectamine 3000试剂按照说明书比例混合，室温孵育20分钟。
3. 细胞转染：将脂质体-DNA复合物加入细胞培养孔中，轻轻混匀，37℃、5%CO2培养箱中孵育6小时。
4. 洗涤：弃去转染液，用PBS缓冲液洗涤细胞两次。
5. 优化培养条件：将细胞分为实验组和对照组，实验组加入脂质体-DNA复合物，对照组加入等量无DNA的脂质体。
6. 重组蛋白表达检测：收集细胞，提取总蛋白，进行Western blot检测目的蛋白表达水平。
7. 报告基因表达检测：收集细胞，提取总RNA，进行实时荧光定量PCR检测报告基因表达水平。
四、实验结果1. Western blot结果：实验组细胞中目的蛋白表达水平明显高于对照组（P<0.05），表明脂质体转染成功。
2. 实时荧光定量PCR结果：实验组细胞中报告基因表达水平明显高于对照组（P<0.05），表明脂质体转染对基因表达有显著促进作用。
五、实验讨论1. 脂质体转染技术在基因研究中的应用：脂质体转染技术具有操作简便、转染效率高、安全性好等优点，是基因研究中最常用的转染方法之一。
2. 本实验中，脂质体转染成功地将目的基因导入细胞内，并显著提高了报告基因的表达水平。
这表明脂质体转染技术在本实验中具有良好的效果。
大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征解读
大鼠心室肌HCN4质粒在HEK293细胞的表达及电流特征[ 08-07-04 16:12:00 ] 作者：刘丹妮，高小方，姚成编辑：studa0714【摘要】目的研究大鼠心室肌细胞超极化环核苷酸门控阳离子通道(HCN4)基因瞬时转染人胚胎肾细胞(HEK293)表达和通道电流特征。
方法利用脂质体介导大鼠HCN4基因pTracer-CMV-GFP穿梭载体，转染HEK293细胞进行扩增，用逆转录-聚合酶链反应(RT- PCR)检测HCN4 mRNA表达，采用全细胞膜片钳技术记录HEK293细胞上HCN4电流。
结果大鼠起搏通道基因瞬时转染HEK293细胞，记录到一系列超极化内向离子流，该电流呈电压、时间依赖性，没有明显的失活，在-150 mV时电流幅值为(540±24.1)pA，电流密度为(9.6±0.7)pA/pF(n＝12)，半激活电压(V1/2)为(-105.7±12.0)mV，稳态激活曲线斜率(k)为-15.7mV，HCN4电流翻转电位为(-84.0±7.9)mV。
结论应用脂质体转染方法成功进行了起搏通道HCN4基因的异源性表达。
【关键词】超极化激活环核苷酸门控阳离子通道；异源性表达；膜片钳；大鼠Abstract: Objective To explore the current characteristics and expression of HCN4 myocytes in rat ventricular myocytes into HEK293. Methods The HCN4 gene fragment was cloned into the shuttle plasmid pTracer-CMV-GFP to form the transfer vector.The mRNA expression was detected by reverse transcriptase-PCR method after being transfected into the HEK293 cell using Lipofactamine2000 reagent for amplification，then to use whole cell patch clamp recording the current.Results An inward current was recorded in response to hyperpolarization activaton in transfected HEK293 cell The mHCN4 channel began to activate in voltage and time dependent manner without deactivation threshold voltage and potential of half-maximal activation（V1/2）was -70mV,（-105.7±12.0）mV ,respectively. Conclusion HCN4 gene is successfly heterologously expressed by the method of Lipofactamine transfected.Key words: hyperpolarization activated cyclic nucleotide gated cation channel；heterologously expressed；patch clamp recordings；rat心脏节律的形成和维持依赖于起搏细胞动作电位4相自动除极化。
HEK293T细胞培养
03
hek293t细胞培养的过程
细胞培养前的准备
细胞培养环境的准备
确保细胞培养实验室的清洁和消毒，准备好所需的培养基、细胞 培养瓶、酶等试剂。
细胞复苏和传代
从液氮或-80℃冰箱中取出细胞，进行复苏和传代，以获得足够的 细胞数量。
05
hek293t细胞培养的挑战与解决方案
细胞培养中的污染问题
污染来源
细胞培养中的污染可能来自培养环境、培养基、细胞本身和操作 过程等。
污染类型
常见的污染类型包括细菌、霉菌、支原体和病毒等。
解决方案
定期检查培养环境、培养基和细胞，使用一次性耗材，严格遵守 无菌操作规程，定期进行支原体检测等。
细胞培养中的生长问题
细胞培养过程中的注意事项
防止污染
维持适宜的pH值
严格控制细胞培养环境，定期对培养基和 细胞进行无菌检测，以防止细菌、霉菌等 污染。
监测培养基的pH值，并适时调整，以确保 细胞的正常生长。
避免细胞交叉污染
注意安全操作
在操作过程中，确保不同种类的细胞分开 存放，避免交叉污染。
操作过程中要穿戴实验室防护服、手套等 防护措施，避免直接接触细胞和培养基， 以防止潜在的生物危害。
选、基因治疗和疫苗研发等。
02
hek293t细胞培养的原理
细胞培养的基本原理
细胞是生命的基本单位，具有自我复 制和分化的能力。在适宜的环境下， 细胞可以生长、繁殖并维持其生物学 特性。
细胞培养技术广泛应用于生物学、医 学、药学等领域，是研究细胞生理、 病理和药理等方面的重要手段。
hek293瞬时转染表达原理
hek293瞬时转染表达原理
HEK293瞬时转染表达的原理主要涉及质粒的导入和基因的表达。
首先，构建好的质粒通过某种方式导入到哺乳动物细胞内，主要是HEK293细胞。
导入的方式通常使用阳离子聚合物，这种聚合物能够和带负电的质粒形成复合物。
复合物随后穿膜（或是膜融合或是内吞）被细胞“吃掉”，从而将目的质粒带入细胞内。
其次，导入的质粒上的外源基因并不会整合到细胞自身的基因组上，而是暂时存在于细胞内。
随着细胞的生长分裂，外源基因会逐渐丢失。
质粒在细胞内能够存在3-4天，在此期间，质粒上的外源基因在细胞内发生转录和翻译，得到极为少量的蛋白。
这就是瞬时转染表达的过程。
在转染完成后的48小时内，可以对细胞的转染效率和蛋白表达进行检测。
转染效率的计算公式是：检测阳性细胞数/检测时总细胞数*100%。
通常使用流式细胞术进行检测。
以上原理仅供参考，建议查阅专业文献或书籍获取更准确的信息。
脂质体作为转染试剂将核酸等细胞外物质转入细胞内的原理和方法
脂质体作为转染试剂将核酸等细胞外物质转入细胞内的原
理和方法
脂质体是一种生物学上的膜状结构，由磷脂和胆固醇等生物分子组成。
由于其疏水和亲水性的特点，脂质体可以将核酸等细胞外物质转入细胞内。
脂质体作为转染试剂的方法包括脂质体直接与DNA或RNA结合，以及脂质体和DNA或RNA混合后再转染至细胞中。
这些方法需要注意的是，脂质体和核酸的比例、浓度、混合时间等因素都会影响转染效率。
脂质体作为转染试剂的优点包括制备简单、转染效率高、适用于不同类型的细胞等。
但也有一些缺点，例如脂质体自身的毒性、容易被清除等。
总之，脂质体作为转染试剂在基因工程、药物研发等领域有着广泛的应用前景。
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UL27基因 shRNA 表达载体对293细胞转染效率的优化
UL27基因 shRNA 表达载体对293细胞转染效率的优化潘晓瑜;吕延成【摘要】旨在优化Lipofectamine2000试剂介导UL27基因重组质粒pGPU6／GFP／Neo－UL27shRNA转染HEK293细胞的条件，为研究UL27基因重组质粒对HSV－2的干扰作用奠定基础。
用Lipofectamine2000试剂介导pGPU6／GFP／Neo－UL27shRNA重组质粒转染293细胞，采用流式细胞仪检测不同的转染时间下的转染效率，同时荧光显微镜和流式细胞仪检测不同比例条件下的转染效率， MTT法检测细胞的存活率。
在质粒与转染试剂复合物的配比为0.8μg砄2μL，转染48 h，转染效率最高并且对细胞毒性最小。
优化pGPU6／GFP／Neo －UL27 shRNA转染293细胞的条件，提高了转染效率。
%Abstact:In order to obtain highly transfection efficiency , the recombinant plasmid pGPU6/GFP/Neo-UL27 shRNA was transfected into 293 cells by Lipofectamine2000 as mediation.The recombinant plasmidpGPU6/GFP/Neo-UL27 shRNA was transfected into 293 cells mediated by Lipofectamine 2000.After 48 h observing expression of the recombinant plasmid in the cells by fluorescence microscope , the transfection efficiency was calculated by using flow cytometry.293 cells were transfected with the recombinant plasmid pGPU 6/GFP/Neo-UL27 shRNA carrying green fluorescent protein ( GFP) gene in mediation of Lipofectamine2000 , based on which transfection time , ratio of plasmid mass to lipofectamine 2000 volume of medium were optimized.The expression of GFP was observed by fluorescent microscopy , and the transfection efficacy was calculated by using flow cytometry.The cell survival rate was detected with MTTmethod.When the ratio of plasmid mass to Lipofectamine 2000 volume was 0.8 μg:2μL, the positive rate of GFP reached a peak value 48 h after transfection ( P<0.05 ) , and the cell apoptosis rate was low.The condition for transfection of 293 cells in mediation of Lipofectamine 2000 was optimized , and the transfection efficacy increased.【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2015(000)012【总页数】4页(P58-60,122)【关键词】Lipofectamine2000;293细胞;转染效率【作者】潘晓瑜;吕延成【作者单位】广东食品药品职业学院，广东广州 510000;遵义医学院珠海校区，广东珠海 519041【正文语种】中文【中图分类】Q936RNA 干扰(RNA interference，RNAi)是一种使mRNA 发生降解，导致基因表达沉默的新型基因阻断技术。
HEK293细胞培养心得
HEK293细胞培养心得HEK293细胞是一种来自人类胚胎肾细胞的细胞系，广泛应用于生物医学研究，药物筛选和疫苗生产等领域。
在培养HEK293细胞的过程中，需要注意一些关键因素，如培养基的选择、细胞传代和细胞冻存等。
在我个人的实验室研究中，我积累了一些关于HEK293细胞培养的心得体会，以下是我对HEK293细胞培养的常用操作和一些建议。
首先，关于培养基的选择。
HEK293细胞通常使用DMEM培养基，配合10%胎牛血清（FBS）和1%的抗生素/抗真菌溶液。
在选择FBS时，建议选择FBS批次稳定，比较适合细胞生长的产品，并进行细胞生长曲线的监测。
此外，培养基中的抗生素/抗真菌溶液可以有效地预防细胞培养中的细菌和真菌污染。
其次，细胞传代是保持HEK293细胞健康生长的关键环节之一、一般来说，当细胞达到80%~90%的密度时，可以进行细胞传代。
细胞传代前，应该先用1X磷酸缓冲盐水（PBS）洗涤细胞，然后使用胰酶或胰酶-EDTA溶解细胞。
胰酶处理时间不宜过长，一般5-10分钟即可。
通过观察细胞的形态变化，判断细胞是否已经完全分离，然后将新的培养基添加到细胞生长板中。
注意，传代时的细胞密度不宜过高，否则容易引起细胞凋亡和细胞质重叠。
此外，为了减少细胞传代带来的细胞突变风险，建议每隔一定的时间重新从冻存的细胞中获得新的细胞，而不是一直使用原始细胞系。
另外，一个常见的问题是细胞冻存和解冻。
细胞冻存是保存和传递细胞的重要方法，在培养HEK293细胞时也是常见的操作。
为了成功地冻存和解冻HEK293细胞，我们使用含10%DMSO的冻存液将细胞冷冻在液氮中。
在解冻细胞时，我们将冻存管迅速放入37°C水浴中，轻轻摇晃管子，直到细胞完全解冻。
然后，将细胞转移至预先装有适量培养基的离心管中，并离心以去除残留的DMSO。
最后，将细胞转移至培养皿中，进行正常的培养。
此外，尽管HEK293细胞生长迅速且易于培养，但仍然需要定期检查细胞的健康状态和污染。
293细胞瞬转表达收细胞转速
293细胞瞬转表达收细胞转速
293细胞（也称为HEK293细胞）是一种人胎娩出的肝细胞癌细胞系。
瞬转表达是指通过转染技术将外源基因导入细胞内，使其能够表达并产生相应的蛋白质。
转速指的是转染后细胞开始表达外源基因的时间。
293细胞的瞬转表达和转速通常较高，这是由于该细胞系的转染效率较好，能够较快地表达外源基因。
通常情况下，将质粒DNA或病毒载体导入293细胞后，细胞会在数小时到数天内开始表达外源基因。
需要注意的是，瞬转表达只是暂时性的表达，通常持续时间较短，大约在几天到数周之间。
如果需要进行长期稳定表达，需要进行稳定转染或建立稳定细胞株。
总之，293细胞的瞬转表达和转速较高，适合进行短期的外源基因表达实验。
HEK293细胞系
文档
HEK293
HEK293细胞比较容易转染，是一个很常用的表达研究外源基因的细胞株。
293细胞的一个衍生株：293T/17的转染效率更高，成为广大研究者研究基因功能的一个强大工具。
293细胞的缺陷是生长过程中贴壁强度比较小。
所以在实验过程中容易流失，从而影响实验结果。
如果一个实验室新得到的293细胞是邮寄得到的并且细胞在培养瓶中，就需要让细胞沉降几天时间，因为大量细胞会漂浮在培养液里。
来源：人体肾脏形态：上皮细胞生长特性：贴壁注释：该细胞含腺病毒5 D NA 。
培养液：MEM（含 2 mM L-谷氨酰胺和Earle's BSS，1.5 g/L NaHCO3, 0.1 mM 非必需氨基酸, 1.0 mM 丙酮酸钠），10% 马血清（热灭活）。
传代：吸去培养液。
用0.25% (w/v) Trypsin- 0.53 mM EDTA洗一次，以去除血清（血清会抑制胰酶的活性）。
加2-3毫升Trypsin-EDTA，放在37℃培养箱内约5分钟，直到细胞全部脱落。
加6-8毫升培养液，用移液器把细胞吹散。
加适量的细胞到新的培养器皿中。
（以1：2到1：4为宜，传代期间培养液2-3天更换1次）
冻存：95%培养液+5%DMSO冻存于液氮。
维持培养液用含2%血清的MEM即可
10%用于加速生长
.。
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成 功构 建 了 重 组 质 粒 ｐＲ Ｓ 一 ＧＦ — Ｎ 并 用 脂 质 体 转 染 的方 法 导入 ＨＥ ２ ３细 胞 ， 生 物 起 搏 的研 究 奠定 实 验 基 础 。 Ｉ Ｅ ２ Ｅ Ｐ ＨＣ ， Ｋ９ 为
泸 州 医 学 院 学报
２８ ４
２１ ０ ２年
第 ３ ５卷
第 ３期
Ｊ ｕ ａ ｆＬ ｚ ｏ ｄｃｌＣ ｌ ｇ Ｖ １ ５ ｏ ｒ ｌ ｏ ｕ ｈ ｕＭｅ ｉａ ｏｌ ｅ ｎ ｅ ｏ． Ｎｏ３ ２ １ ３ ． ０ ２
脂质体 介导 ｈ Ｃ ２ 因转染 ＨＥ ２ ３细胞 Ｈ Ｎ基 Ｋ９ 的效 率研 究 ： ｌ ：
的 可 行 性 。 方 法 ：对 含 ｈ Ｎ： ＤＮＡ 的 Ｐ Ｒ 载 体 进 行 转 化 和 扩 增 ，将 所 得 ｈ Ｎ 因 定 向克 隆 到真 核 表 达 载 体 ｐＲＥ ２ ＨＣ ｃ Ｔ ＨＣ 基 Ｉ Ｓ一
Ｅ Ｆ Ｇ Ｐ中 ． 酶 切 来 鉴 定 克 隆 的 正确 性 。将 重 组 质 粒 用 脂 质体 转 染 ＨＥ ２ ３ 荧 光 显 微镜 观察 Ｅ Ｆ 双 Ｋ ９， Ｇ Ｐ的表 达 并 计 算 转 染效 率 。 结
第 ３期 贾 建 博 等 ， 质 体 介 导 ｈ 脂 ＨＣＮ 基 因转 染 Ｈ Ｋ ９ 细 胞 的效 率 研 究 Ｅ ２３
２９ ４
依据 。
１ 材 料 与 仪 器
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关键词 脂 质 体 ； ＨＣＮ ｈ ；ＨＥＫ２ ３； 因转 染 ９ 基
中 图分 类号 Ｒ ３ ３ ３—３
文献标识码 Ａ
文 章 编 号 １０ — ６ ９ ２ １ ）— ２ ８ ０ ０ ０ ２ ６ （０ ２ ３ ０４ — ３
Ｓ ｕ ｙ ｏ ａ ｓｅ ｔｏ ｆ ｃｅ ｃ ｆｈ ｔ ｄ ｆｔ ｎ ｆ ｃ ｉ ｎ ｅ ｒ ｉ ｉｎ ｙ ｏ ＨＣＮ２ ｎ ｏ ＨＥＫ２ ３ ｔ ｉ ９
研究表明 【 ］ ：在 ｃ ＭＰ反 应 性 方 面 ， Ｎ ＞ Ｎ ＞ Ａ ＨＣ ４ ＨＣ ２
ＨＣ 在激 活动 力学 方面 ， 活速度 为 ＨＣ ＨＣ Ｎ： 激 Ｎ＞ Ｎ＞ ＨＣ 分析其 特 点 ， Ｎ。 目前 认 为 ＨＣ Ｎ 以其 均衡 的 电生 理 学特 性最适 合 用于构 建 生物起 搏器 １ 。因此 ， 者 笔
４０ １ 释 于 Ｏ ｔ— ＭＥ 培养 基 １０ １ 轻 轻 混合 ．￣ 稀 ｐｉ Ｄ Ｍ ０￣， Ａ Ｂ液成脂 质体／ Ｎ 复合物 ， ＤＡ 室温 放置 ２ ｍｉ。③转 ０ ｎ
１１材 料 ．
染准 备 ： 无抗 生素 的培 养基 漂洗 ２次 。④ 转染 ： 用 将
脂 质体／ Ｎ Ｄ Ａ复合 物缓 缓 加入 ｌ Ｌ ２孑 培养 板 中 ， 轻轻 摇匀 ｆ ｘ轴 ， 延 Ｙ轴１３ ℃ 、％ Ｃ ２ ，７ ５ Ｏ 细胞 培养 箱 中放 置 ８， ｈ 换液 （ ｍ 无抗 生素 的培养 基 ） １ｌ 。继 续培 养 ２ — ４ ７ ｈ后 在荧 光 显 微镜 下观 察 结果 ，取 五 个不 同视野 ８ 分别 计数 表达绿 色 荧光 蛋 白的 细胞总 数 ，计算 转染 效率 。转 染 效率 （ ＝ ％） 荧光 显微 镜 下细 胞数／ 细胞 总
倒 置 相 差显 微 镜 （ ｌ ｕ ， Ｏ ｙ ｓ 日本 ） 荧 光 显 微 镜 ｍｐ ；
（ＥＣ Ｄ Ｍ Ｒ 德 国 ） Ｌ Ｉ Ａ Ｅ Ｉ Ｂ，
２ 方 法
３１真 核表达 重组 质粒 ｐＲ Ｓ 一 Ｇ Ｐ Ｈ Ｎ 的构建 ． ＩＥ２Ｅ Ｆ— Ｃ ２
以 Ｅｏ ｃ Ｒ Ｉ和 Ｂ ｍＨ Ｉ酶 切 重 组 质 粒 。 １ ａ 在 ％的
ｃ １ ｍｅ ｉ ｔｄ ｙ ｉ ｏ ｅ ｔ ｍｉ ｅ ０ ｅ１ ｄ ａ ｅ ｂ Ｌ ｐ ｆ ｃａ ｎ Ｔ ２ ００， ｉ ｈ Ｍ ｗｈ ｃ ｗｉ ｅ ａ ｌ Ｕ ｔ ｅ ｐ ｏ ｅ ｈｅ ｏ ｅ ｆ ＨＣＮｚ ｇ ｎ ｉ ｂ ｏ ｏ ｉ ａ ｌ ｎ ｂ ｅ Ｓ ｏ ｘ ｌ ｒ ｔ ｒ ｌ ｏ ｌ ｅ ｅ ｎ ｉｌ ｇ ｃ ｌ
搏技 术成 为可 能 。心脏 的起 搏 主要 由超极 化 激活 的 环 状 核 苷 酸 门 控 通 道 （ ｐ ｒｏ ｒ ａｉ － ｃ ｖｔｄ ｈ ｅｐｌ ｉ ｔ ｎ ａｔ ａ ｙ ａｚ ｏ ｉ ｅ
亚 型。 中在 心脏 表达 的有 ３种 （ Ｃ Ｈ Ｎ ， Ｎ） 其 Ｈ Ｎ， Ｃ ２ＨＣ ４ ，
公 司 ；限制性 内切 酶 咖 Ｈ Ｉ， ｏ Ｓｇ 公 Ｒ Ｉ；ｉ ｍａ
司）质 粒抽 提试 剂盒 （ ＭＥ Ａ公 司）； Ｅ ２ ３ 泸 州 ， Ｏ Ｇ Ｈ Ｋ９（ 医 学 院 中心实 验 室 ） 脂 质体 转 染试 剂 采 用 Ｌｐ ｆｃ ； ｉｏ ． ｅ
ｔ ｎＴ ２ ０ （ ｖｔ ｇｎ公 司 ） ａ ｅ ０ ０ Ｉ ｉｏ ｅ ｍｉ Ｍ ｎ ｒ ；低 糖 Ｄ Ｍ 培 养 ＭＥ 基 、 牛血清 （Ｂ ） 国 Ｈ ｃ ｎ 公 司 。 胎 Ｆ Ｓ美 ｙｌ ｅ ｏ １２ 主要仪 器 ．
数ｘ ０ ％ １０
３ 结 果
含 ｈ Ｃ Ｄ Ａ真 核表 达质 粒 、含有 增强 型绿 Ｈ Ｎ ｃＮ 色 荧 光 蛋 白 （ｎ ａｃ ｄ ｇｅｎ ｆ ｏｅｃｎ ｐｏｅ ， ｅ ｈ ｎ ｅ ｒｅ ｕ ｒｓｅ ｔ ｒｔ ｎ ｌ ｉ
Ｅ Ｆ １质 粒 ｐＲ Ｓ 一 Ｇ Ｐ购 于 广 州 复能 基 因有 限 ＧＰ ＩＥ ２ Ｅ Ｆ
采用 脂 质 体 为介 导 成 功 地 将 ｈ Ｃ 因 导 人 人 胚 ＨＮ基
胎 肾 细胞 ｈ ｍａ ｍ ｒｏ ｉ ｋｄ ｅ ｐｔｅ ａ ｃ ｌ ｕ ｎｅ ｂ ｎｃ ｉｎ ｙ ｅ ｉ ｌ ｌ ｅ ， ｙ ｈ ｉ ｌ Ｈ Ｋ）９ 。从 而 为心脏 生 物起搏 器 的研 究提 供 实验 Ｅ ２３
ｔ ｅ ｅ ｃｅ ｃ ｆｔ ｎ ｆ ｃｉ ｎ ｗ ｓ ｃ ｌｕ ａｅ ．Ｒｅ ｕ ｔ ： ｈ ｅ ｏ ｉ ａ ｔｐ ａ ｍｉ ｓ ｃ ｎ ｔｕ ｔｄ Ｔ ａ ｓｅ ｔｄ ｃ ｌ ｈ ｍ ｉ ｎ ｖ ０ ｒ ｓｅ ｔ ａ ａ ｃ ｌｔ ｄ ａ ｏ ｓ ｌ Ｔ ｅ ｒ ｃ ｍｂ ｎ ｎ ｌ ｓ ｄ ｗａ ｏ ｓｒ ｃ ｅ ． ｒ ｎ ｆ ｃ ｅ ｅ ｌ ｓ ｓ ｓ ｏ ｄ ｒ ｅ ｆ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｎ ｅ ａ ｌ ｏ ｅ ｃ ｎ ｅ ｈ ｗｅ ｇ ｅ ｎ ｌ ｒ ｓ ｅ ｃ ｕ ｄ ｒ ｆ ｒ ｓ ｅ ｃ ｍｉ ｒ ｓ ｏ ｅ ｔ ｅ ｒ ｎ ｆｃ ｉ ｎ ｆ ｃ ｅ ｃ ｗ ｓ ｐ ｏ ０ ． ｕ ｕ ｃ ｏ ｃ ｐ ； ｈ ｔ ｓｅ ｔ ｅ ｉｎ ｙ ａ ｕ ｔ ９ ％ ａ ｏ ｉ Ｃｏ ｃ ｕ ｉ ｎ： ｃ ｍｂ ｎ ｎ ｌ ｓ ｄ ｐ ＲＥ ２ ＥＧＦ — ｎ ｌ ｓ ｏ Ｒｅ ｏ ｉ ａ ｔ ａ ｍｉ Ｉ Ｓ 一 ｐ Ｐ ＨＣＮ ｓｓ ｃ ｅ ｓ ｌ ｏ ｓｒ ｃｅ ｎ ｒ ｎ ｆ ｒｅ ｎ ｏ ＨＥ ９ ２ｉ ｕ ｃ ｓｆ ｌ ｃ ｎ ｔ ｔ ｄ ａ ｄ ｔａ ｓｅ ｒ ｄ ｉ ｔ Ｋ２ ３ ｕ ｙ ｕ
ｃｃｉ ｎ ｃ ｏ ｄ — ａｅ ａｉ ｈ ｎ ｅ． Ｃ ）介 导 的 ｙ ｌ ｕ ｌ ｔ ｅ ｇ ｔ ｃｔ ｎｃ ａ ｎ１Ｈ Ｎ ｃ ｅｉ ｄ ｏ
内 向超 极化 电流 （ 搏 电流 ，ｆ 调控 。ＨＣ 起 Ｉ来 ） Ｎ有 ４种
国家 自然 科 学 基 金 资 助项 目 （１４ ０ ８ ８ ０ １４ ） 作 者 简 介 ： 建博 （９ ４ ， ， 院医 师 ， 士 生 贾 １ ８一） 男 住 硕 通讯作者 ： 廖 斌 （９ ４ ， ， 授 １ ６一） 男 教
贾 建博 ， 易冰 ， 方 卞铁荣 陈 ， 枫 ， 于风旭 ， 斌 廖
（ ｌ 医学 院 附 属 医 院 ： 心 外 科 ； 泸Ｊ Ｊ 、 １ 胸 医学 实验 中心 ， 川 泸 州 四 １ Ｉ
摘 要 目的 ： 质 体 介 导 重 组 起 搏 基 因 ｐＲＥ ２ Ｅ Ｆ — Ｎ 染 Ｈ Ｋ ９ 脂 Ｉ Ｓ 一 Ｇ Ｐ ＨＣ 转 Ｅ ２ ３细 胞 ， 察 转染 效 率 ， 讨 其 构 建 生 物 起 搏 器 观 探