摘要北野豌豆隶属于豆科野豌豆族野...

摘要
北野豌豆（ＶｉｃｉａｒａｍｕｌｉｆｌｏｒａＯｈｗｉ）隶属于豆科（Ｆａｂａｅｅａｅ）野豌豆族（Ｔｒｉｂ．ＶｉｃｅｉａｅＢｒｏｎｎ．）野豌豆属（ＶｉｃｉａＬｉｒｍ．）ｓＲｂｇｅｎＶｉｃｉａ亚属、歪头菜组（ＳｅｃｔＯｒｏｂｏｉｄｅａ），是经济价值较高的植物。

关于野豌豆属的分类系统，２００多年来，其属级地位一直保留着，而属下分类等级变动很多。

不同学者对北野豌豆的分类处理意见也有所不同，因此，有必要进行全面而深入的分类学研究。

前人从分类学、细胞地理学、种子蛋白等不同角度对北野豌豆及其近缘种进，亍了较为深入的研究，但在分子进化及分子细胞遗传学水平上的工作较少。

本文运用荧光原位杂交（ＦＩＳＨ）和基目组原位杂交（ＧＩＳＨ）方法，分析了四倍体北野豌豆及其近缘种的染色体分子分化，建立和比较它们的分子核型，初步揭示了四倍体基因组构成和可能的二倍体亲本，这是传统细胞学和杂交实验方法所无法解决的问题。

同时，ＦＩＳＨ和ＧＩＳＨ结果也为正确处理北野豌豆及其近缘种的分类地位提供了有利依据。

主要结果如下：
一．对分布在东北的北野豌豆３个二倍体种群１８ＳｒＤＮＡ、５ＳｒＤＮＡ杂交位点进行比较，发现带岭与横道河子种群ｒＤＮＡ信号数目及在染色体上所处的位置完全相同，支持其同属一个亚种的分类地位。

千山种群与二者不同之处在于Ｉ号同源染色体之一多了一个５ＳｒＤＮＡ位点，结合其它资料报道，支持前人把它另立一个亚种的分类处理。

二．北野豌豆长白山北坡与西南坡两个居群ｒＤＮＡ位点无差别．且发现低海拔地区也存在生长良好的四倍体细胞型，同前二者无差异。

与低海拔二倍体比较，四倍体ｒＤＮＡ位点数目是二倍体的两倍，信号在染色体上所处位置与二倍体相对应。

加之背景资料记载野豌豆属植物种间杂交异常困难，初步判定高海拔分布的四倍体为同源四倍体，带岭或横道河子种群可能是其亲本。

二．同组近缘种歪头菜二倍体与北野豌豆二倍体相比，Ｉ号染色体上多了一列５ＳｒＤＮＡ位点，北野豌豆四倍体在染色体相应位置上也未出现此信号，推断二倍体歪头菜不是北野豌豆四倍体的直接亲本。

而歪头菜四倍体与二倍体的ｒＤＮＡ信
号位点完全吻合，很可能为同源四倍体。

四．异地分布的无萼齿野豌豆比北野豌豆长白山四倍体在ＩＩ号染色体上多了一对５ＳｒＤＮＡ信号，与千山种群和歪头菜二倍体相应位置的５ＳｒＤＮＡ相联系，推测千山种群在进化过程中可能贡献了这条染色体；或者天目山四倍体本身是个异源多倍体，它存在歪头菜二倍体的基因组，并且与另一亲本杂交形成四倍体。

一系列推断还有待确证。

牯岭野豌豆ＩＩ号染色体之一存在一个５ＳｒＤＮＡ位点，其余位点分布情况与天目山种群同。

此位点不能排除实验误差所致，若其确实存在，则牯岭野豌豆至少在这一位点对两亲本来源的基因进行了重组，从ｒＤＮＡ位点上看，千山种群可能参与了进化，
五．黑龙江野豌豆ｒＤＮＡ位点分布与北野豌豆各种群有很大差异，尤其Ｖ号染色体长臂末端存在一对１８ＳｒＤＮＡ位点，说明二者在亲缘关系上较远。

六．两种ｒＤＮＡ的连锁模式为，１８ＳｒＤＮＡ和５ＳｒＤＮＡ连锁于同一染色体的同一臂上，１８ＳｒＤＮＡ大多接近于外侧。

七．以带岭总ＤＮＡ为探针，对其自身、长白山种群、无萼齿野豌豆、歪头菜二倍体进行基因组原位杂交（ＧＩＳＨ），结果表明杂交对象基因组可完全被探针标记，说明它们的基因组组成十分相似，亲缘关系非常近。

在今后的工作中可以尝试加大封阻以提高基因组间的差异。

关键词：北野豌豆，近缘种，基因组构成，１８ＳｒＤＮＡ基因，５ＳｒＤＮＡ基因．荧光原位杂交（ＦＩＳＨ），基因组原位杂交（ＧＩＳＨ）
Ａｂｓｔｒａｃｔ
矿ｒａｍｕｌｉｆｌｏｒａ，ａｓｐｅｃｉｅｏｆＶｉｃｉａＬ．，ｈａｓｈｉｇｈｅｒｅｃｏｎｏｍｉｃｖａｌｕｅ．Ｆｏｒ２００ｙｅａｒｓ．ｉｔｓｓｔａｔｕｓｏｆｇｅｎｕｓｈａｓｂｅｅｎｒｅｓｅｒｖｅｄ，ｂｕｔａｌｔｅｒａｔｅｄｂｅｌｏｗｔｈｉｓｒａｎｋ．Ｓｏｉｔｉｓｎｅｃｅｓｓａｒｙｔｏｓｔｕｄｙｔｈｏｒｏｕｇｈｌｙｏｎｔａｘｏｎｏｍｙｂｅｃａｕｓｅｏｆｍａｎｙｔａｘｏｎｏｍｉｓｔｓ’ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｏｐｉｎｉｏｎｓ．Ｂａｓｅｏｎｔａｘｏｎｏｍｙ，ｃｙｔｏｇｅｏｇｒａｐｈｙａｎｄｏｔｈｅｒｅｖｉｄｅｎｃｅｓ，ｐｒｅｖｉｏｕｓｓｔｕｄｉｅｓｈａｖｅｐｒｏｖｉｄｅｄｕｓｍｕｃｈｖａｌｕａｂｌｅｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ．Ｈｏｗｅｖｅｒ，ｔｈｅｒｅｓｅａｒｃｈｅｓｏｎｍｏｌｅｃｕｌａｒｃｙｔｏｇｅｎｅｔｉｃｓａｒｅｌｉｍｉｔｅｄ．Ｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙ，ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ）ａｎｄｇｅｎｏｍｉｃｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＧｔＳＨ）ｗｅｒｅｕｓｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｅｖｏｌｕｔｉｏｎｏｆｔｅｔｒａｐｌｏｉｄｃｙｔｏｔｙｐｅｏｆＥｒａｍｕｌｉｆｌｏｒａａｎｄｉｔｓａｌｌｉｅｄｓｐｅｃｉｅｓ，ｉｎｏｒｄｅｒｔｏｒｅｖｅａｌｔｈｅｇｅｎｏｍｉｃｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｎｄｉｔｓｐａｒｅｎｔｓ．Ｉｔｗｏｕｌｄ，ｔｈｅｒｅｆｏｒｅ，ｂｅｂｅｔｔｅｒｔｏｐｒｏｖｉｄｅｆａｖｏｒａｂｌｅｅｖｉｄｅｎｃｅｏｎｃｌａｓｓｉｆｉｃａｔｉｏｎ．Ｔｈｅｍａｉｎｒｅｓｕｌｔｓａｒｅｈｅｒｅｉｎｂｒｉｅｆｌｙａｓｆｏｌｌｏｗｓ：
１Ｃｏｍｐａｉｒｉｎｇｗｉｔｈ１８Ｓａｎｄ５ＳｒＤＮＡｓｉｔｅｓａｍｏｎｇｔｈｒｅｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｏｆＥｒａｍｕｌｉｆｌｏｒａｉｎｎｏｒｔｈｅａｓｔＣｈｉｎａ，ｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｒＤＮＡｓｉｔｅｓａｎｄｔｈｅｉｒｌｏｃａｔｉｏｎｏｎｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｓａｒｅｓａｒｒｌｅｂｅｔｗｅｅｎＤａｉｌｉｎｇａｎｄＨｅｎｇｄａｏｈｅｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓ．Ｓｏｉｔｉｓ
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４．Ｉｎｇａｍｕｒｅｎｓｉｓ，ｏｎｅｐａｉｒｏｆ１８ＳｒＤＮＡｓｉｔｅｓａｒｅｌｏｃａｔｅｄｏｎｔｅｌｏｍｅｒｅｗｈｉｃｈｉｓｑｕｉｔｅｄｉｆｆｅｒｅｎｔｗｉｔｈｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ
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６ＧｉｓｈｕｓｉｎｇｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆＤａｉｌｉｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎａｓｐｒｏｂｅｒｅｖｅａｌｅｄｆｕｌｌｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｐａｉｎｔｉｎｇｏｎｅａｃｈｏｔｈｅｒｌＳｇｅｎｏｍｅ、Ｔｈｉｓｉｎｄｉｃａｔｅｔｈａｔｈｏｍｏｌｏｇｏｕｓｒｅｐｅｔｉｔｉｖｅｓｅｑｕｅｎｃｅｓａｒｅａｍａｊｏｒｃｏｍｐｏｓｉｔｏｎｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｍ．Ｔｈｕｓ．ｔｈｅａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆＧＩＳＨｆｏｒｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｎｇｇｅｎｏｍｅｉｓｌｉｍｉｔｅｄｕｎｌｅｓｓｉｍｐｒｏｖｉｎｇｔｈｅｔｅｃｈｉｎｉｑｕｅ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｋｒａｒｎｕｌｉｆｌｏｒａ．ａｌｌｉｅｄｓｐｅｃｉｅｓ，ｇｅｎｏｍｅｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎ·１８ＳｒＤＮＡｇｅｎｅ、５ＳｒＤＮＡｇｅｎｅ．ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＦＩＳＨ），ｇｅｎｏｍｅｉｎｓｉｔｕ
ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ（ＧＩＳＨ）
第一章前言
１．研究简史
１．１分类学研究
野豌豆属Ｉ｛ｃｉａＬ是豆科之中经济价值比较大的属，主要分布于北温带和南温带，全世界２００余种，中国４０余种（夏振岱１９９８）。

１７５３年林奈以救荒野豌豆ⅣｓａｔｉｖａＬ建立了该属，当时仅包括１７种植物。

Ｓｅｆｉｎｇｅ（１８５２年）将野豌豆属扩展到１０１种。

Ｌｅｄｅｂｏｕｒ（１８４２）依据荚果、种子、种脐等特征．在属下建立了ｓｅｃｔ．Ｆａｂａ和ＳｅＣｔＩｄｃｉａ两个组。

Ｔｕｒｃｚａｎｉｎｏｗ（１９４２）根据花柱及花柱毛又建立了ｓｅｃＬＥｒｖｉｌｉａ和ｓｅｃｔＣｒａｃｃａ两个组。

Ｆｅｄｔｓｃｈｅｎｋｏ（１９４８）根据荚果和种子的特征在属下设立了ＳｂｔｂｇｅｎＥｒｖｕｍｓ，ｓｕｂｇｅｎＣｒａｃｃａ和ｓｕｂｇｅｎＥａｒｉｃｉａ三个死属。

俄国学者Ｒａｄｚｈｉ（１９７１）在属下又建立了ｓｅｃｔ．Ｃａｓ口“ｂｉｃａ８和ｊＰｃｔＶａｒｉｒｅｇａｒａＰ等几个新组。

Ｋｕｐｉｃｈａ（１９７６）全面系统地研究了世界野豌豆属，依据大量表型性状（托叶、叶结构、花序、花、果实、种子和生物化学资料）分析，重新建立了属下结构，认为本属应该分为两个亚属、２２个组．Ｍａｘｔｅｄ（】９９１）对野豌豆属进行再次修订，设两个亚属、２６个组，使野豌豆属分类系统近于完善。

北野豌豆隶属于ｓｕｂｇｅｎＩｄｃｉａ亚属、歪头菜组。

分布于中国（东北、华北、华东）、朝鲜、俄罗斯（西伯利亚、远东）。

付沛云等（１９７６）在《东北草本植物志》中，在北野豌豆种内设立千山野豌豆和贝加尔野豌豆变型。

夏振岱（１９９６１在植物分类学报中发表的“中国野豌豆属的分类研究”一文中将干山野豌豆提升为独立的种，而将分布于辽宁岫岩、风城、本溪的作为北野豌豆的变型，定名为辽野豌豆。

李瑞军等（１９９６）根据其形态、地理、染色体、同工酶等性状，将分布于中国的北野豌豆定为三个亚种，即北野豌豆Ｖ．ｒａｍｕｌ川ｏｍｓｓｐｒａｍ“？ｉ加ｒ口（Ｍａｘｉｍ）Ｏｈｗｉ、长白野豌豆ｇｒａｍｕｌｉｆｌｏｒｏｓｓｐｃｈａｎｇｂａｉｅｎｓｉｓｆＫｉｔａｇ、ＲＪ．ＬｉｅｔＸＪＬｉｕ、辽野豌豆ｇｒａｍｕｌ印ｏｒａｓｓｐａｂｂｒｅｖｉａｔａ（Ｐ．ＹＦｕｅｔＹＡ．ＣｈｅｎｌＲＪＬｉｅｔＸ，Ｊ．Ｌｉｕ。

北野豌豆亚种分布范围广，大小兴安岭、完达山、张广才岭、长良¨、五台山等地均有分布，染色体２ｎ＝１２：长白野豌豆亚种仅分布于长白１ｌｊ，２ｒ１＝２４：辽野豌豆亚种分布于辽东半岛，２ｎ：１２。

值得指出的是，李瑞军等（１９９６）对风
凰山和干山居群的北野豌豆迸行了野外实地调查，采集了花期和果期标本百余份，发现这两个居群在花部性状变异上是相似的，如花较大，长达］５ｎｍｌ，后萼齿显著长，近于萼筒长，同时花序分枝或不分枝，花序短缩，总苞片较托叶大，宿存。

因此他们认为这两个居群应属同一分类单位，并将它们台并，同时这一相关特征组明显不同于原亚种ｓｓｐｒａｍｕｌｉｆｌｏｒａ和新亚种ｓｓｐ．ｃｈａｎｇｂａｉｅｎｓｉｓ，而且地理分布仅局限于辽东半岛，所以将它们组合为新亚种ｓｓｐａｂｂｒｅｖｉａｔａ。

由于付沛云、李瑞军、夏振岱等人对北野豌豆的分类处理意见不同，因此，有必要进行全面而深入的分类学研究，提供更多的证据，给出科学的结论。

１．２细胞学和细胞地理学研究
李瑞军和刘祥君等（１９９６）对产自大兴安岭的古莲和塔河、小兴安岭的带岭、张广才岭的黄泥河和横道河子、长自山的松江河和二道白河、辽宁的千山等地的北野豌豆三个亚种居群进行了细胞学研究。

长白山的松江河居群是四倍体（２ｎ＝２４），其余居群均是二倍体（２ｎ：１２）。

核型组成上以近中部着丝点染色体（ＳＩｌｌ）为主，中部着丝点染色体（ｍ）和近端部着丝点染色体（ｓｔ）数目较少，第一和第二对染色体较其它染色体长，且多为ｍ或ｓｍ染色体。

核型对称性较强，２Ａ或３Ａ型，且多具随体。

欧亚大陆是野豌豆属的分布中心和多样化中心，面地中海区可能是其起源中心。

起源后，首先在地中海北岸及其临近区域得到发展和散布。

在当时北半球气候稳定而温暖的条件下，迅速扩展到欧亚大陆，达到高纬度地区，并通过白令陆桥到达北美。

北野豌豆所处的ＳｅｃｔＯｒｏｂｏｉｄｅａ是欧亚大陆分布的林地植物，大多分布于东亚或中国特有。

染色体资料表明，其基数分布式样，欧洲种以基数７为主．亚洲种是多基数的，即Ｘ＝５，６和７，大多数种类基数为６，并以较高比例形成种内多倍体。

核型对称性分化不明显，但通过染色体组每条染色体类型和臂比的比较ｔ可以发现欧亚大陆分布的种类，其核型主要由中部着丝点染色体和近中部着丝点染色体组成，亚洲大陆种类核型主要由中部着丝点染色体、近中部着丝点染色体和近端部着丝点染色体组成。

中部着丝点染色体数目明显下降，近中部着丝点染色体数目相应增加著出现Ｉ￣２对端部着丝点染色体，亚洲种在形态上分化也较明显。

因此可以推测东亚是ｓｅｃｌＯｒｏｂｏｉｄｅａ的现代多样化中心·欧洲大陆是其发源土由．。

在中国，除分布在东北的北野豌豆长白山亚种为四倍体外，还有两个四倍体近缘种呈跳跃式间断地分布在华东的天目上、黄山、庐山和东北的长白山高海拔地区，而二倍体分布其间。

通常，多倍体形成与第四纪冰川有关。

在第四纪亚洲大陆冰川远不及欧、美的大陆冰川发达，但是一些高山发生过多次山地冰川，并且像欧洲一样大致发生了四次冰期。

据此推测四倍体是二倍体祖先对高山冰川适应的结果，最后成为耐寒的多倍体。

虽然东北在纬度上与黄山一西天目山一庐ＬＵ相差甚远，但是这些山脉的极高海拔和复杂的地势使之成为由于在第四纪冰期与间冰期的交替发生所引起的区系植物南北方向的移动下，某些冰期时形成的种类的避护所，从而形成在山区间孤岛间断分布。

而我国第四纪冰川十分有限，一般发生在高海拔的山区，因此，推测这三个隔离分布的近缘四倍体有可能是独立发生的，这样一来与之分布最近的二倍体可能参与了这些四倍体的形成。

该论点有待于进一步研究证实。

１．３形态学研究
对于北野豌豆的形态学研究，前人主要从根、茎、叶、花、果实及种子这六大方面进行了深入而全面的研究。

北野豌豆主根早期萎缩，根茎明显，长约１－３ｃｍ，在根茎上生出许多不定根组成须根系。

茎直立，无卷须，叶为偶数羽状复叶，多数具小叶４、６和８枚。

北野豌豆种群变异较大，常常一些极端变异类型被定义为种下单位，甚至种级单位，例如千山种群。

千山居群大多具有４枚小叶（占８５％），塔源和带岭居群则是６枚小叶个体较多。

小叶数目变化同地理分布有一定相关性，即从南到北，小叶数目增多。

李瑞军等（１９９６）采用组件的思想对柳叶野豌豆、北野豌豆和歪头菜幼苗亚单位时序变化和开花关系进行了分析，发现在栽培属群和野外居群中存在打破物种间形体结构界限的个体，推测歪头菜组ｓｅｃｔＯｒｏｂｏｉｄｅａ中这几种茎直立无卷须的类群可能有着共同的祖先。

叶形变化时常作为种下单位建立的依据。

北野豌豆叶形变异在个体发育水平上极为明显，即异形叶现象。

植株中上部叶一般叶宽在１０ｍｍ以上，而下部叶宽时常在１０ｒａｍ以下，叶长与前者没有明显差异。

这种现象在北野豌豆许多屠群中部有发现，如长白山居群、塔源居群和带岭居群。

花生物学研究表明北野豌豆为自花授粉（蕾内传粉）类群。

ＡＴＰ酶活性可能与柱头可授性相关。

花粉／胚珠值高于Ｃｒｕｄｅｎ所提出的标准。

花期物候分化为早春或春季和夏季两种类型，可能反映物种形成时地史条件的差异。

１．４种子贮藏蛋白研究
李瑞军等（１９９６）对北野豌豆的种子贮存蛋白进行了ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳谱带的研究，研究发现北野豌豆居群间种子贮藏蛋白质的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ电泳特征在二倍体和四倍体水平上没有任何分化，而北野豌豆和柳叶野豌豆问结合系数为Ｏ．９８。

因此种子贮藏蛋白质的电泳特征支持了将它们处理为种下关系或作为近缘种处理为复合种。

这与Ｋｉｔａｇａｗａ（１９７９）丰［１Ｎｏｄａ（１９８４）的经典分类处理相一致。

１．５同工酶研究
关于野豌豆属同工酶的研究，日本学者山本喜良对该属的Ｓｅｃｔ而６ｎ，Ｓｅｃｔ．Ｈｃｉａ，Ｓｅｃｔ．Ｅｒｖｕｍ，Ｓｅｃｔ．Ｃｒａｃｃａ进行了淀粉酶、酯酶等的研究。

王好友等（１９９６）利用过氧化物酶和酯酶研究同工酶在个体水平上、居群内和居群间酶谱变异式样，探讨其与染色体变异和形态变异的相关性，进而认识北野豌豆物种变异式样及其形成机制。

结果表明，同工酶谱带在个体发育的不同时期有差异，居群内个体间谱带较为一致，居群间变异明显高于居群内。

随海拔升高，北野豌豆同工酶的谱带有所减少，在海拔１０００ｍ时谱带为１０条，当海拔升至２０００ｍ时谱带为４条。

１。

６ＲｕｂｉＳＣＯ的研究
Ｒｕｂｉｓｃｏ是植物绿叶中的可溶性蛋白质，是自然界中数量最多的蛋白质。

由于Ｒｕｂｉｓｃｏ具有大的分子量（５６０ＫＤ）和极高的含量（约占叶可溶性蛋白的５０％），因此通过聚丙烯凝胶电泳能够非常容易地识别。

应用此法在研究北野豌豆同柳叶野豌豆关系问题上的结果表明，北野豌豆二倍体和四倍体细胞型（长白山居群）和柳叶野豌豆的Ｒｕｂｉｓｅｏ等电聚焦模式完全相同。

Ｒｏｂｂｉｎｓ和Ｖａｕｇｈａｎ（１９８３）研究表明Ｂｒａｓｓｉｃａｆｒｕｔｉｃｕｌｏｓａ（２ｘ）及其四倍体亚种ｓｓｐ．ｍａｕｒｉｔａｎｉｃａ具有相同的Ｒｕｂｉｓｃｏ等电聚焦模式，而ｓｓｐｍａｕｌ·ｉｔａｎｉｃａ可能是同源四倍体。

染色体研究揭示了分稚丁长白山１５００－－２０００ｍ的四倍体北野豌豆可能是同源多倍体，Ｒｕｂｉｓｃｏ的等电聚焦模式进一步证实了这点。

北野豌豆的Ｒｕｂｉｓｃｏ等电聚焦模式仅与柳叶野豌豆完全一致，而与同组的大叶野豌豆、黑龙江野豌豆、歪头菜、广布野豌豆和大花野豌豆差异显著，无共有谱带出现，反映它们在Ｒｕｂｉｓｃｏ遗传控制上有较人的差异。

所以，Ｒｕｂｉｓｃｏ的研究支持经典分类学者将北野豌豆和柳叶野豌豆处理为近缘种
的分类处理。

２．原位杂交技术在植物研究中的应用
２．１原位分子杂交技术的发展简史
２．１．１原位杂交技术的历史
原位杂交（ｉｎｓｉｔｕｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ，ＩＳＨ）不同于Ｓｏｕｔｈｅｒｎ和Ｎｏｒｔｈｅｒｎ杂交，它是将核苷酸探针直接定位于组织、细胞、核和染色体上的一种原位技术。

其基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则，将携带放射性或非放射性标记的外源核酸—探针，与染色体上的经过变性后的单链ＤＮＡ互补配对，结合成核酸杂交分子，再经过一定的检测手段，将待测核酸在染色体上的位置显示出来（李懋学，张赞平１９９６；张乃群，董庆阁２０００，Ｌｅｉｔｃｈ等１９９４）。

１９６９年Ｇａｌｌ和Ｐａｒｄｕｅ首次成功地将放射性标记的ｒＤＮＡ探针定位于非洲爪蟾细胞核上。

原位杂交技术最初主要采用放射性标记的探针，其优点在于灵敏度高，可以定位单拷贝基因，但是检测杂交信号手段繁琐，耗费时间长。

为克服以上缺陷，非放射性的原位杂交技术逐渐发展起来（Ｌａｎｇｅｒ－Ｓａｆｅｒｅｔａ１．１９８２）。

起初，非放射性的原位杂交技术仅仅用来检测多线染色体重复序列，而多色标记系统和检测系统将多个单拷贝序列以较高的分辨率同时定位和作图（Ｌｉｃｈｔｅｒｅｔａｌ１９９０）．Ｄａｕｗｅｒｓｅ等人（１９９２）已将荧光原位杂交技术（ＦＩＳＨ）发展到可同时检测１２种ＤＮＡ探针分子。

原位杂交技术在动物及人类研究中发展很快，１９８５年，原位杂交技术首次应用在对植物的研究中（ＲａｙｂｕｍａｎｄＧｉｌｌ．１９８５），由于细胞壁对探针有阻碍作用，这一技术在植物中的应用曾受到一定限制．但随着植物染色体制片技术和原生质体制备技术的发展，原位杂交技术在植物研究中越采越广泛。

以下主要介绍原位杂交技术在植物研究中的一些应用和原位杂交技术上的进展。

２．１．２原位杂交技术的主要应用
原位杂交技术在基因的染色体物理作图、杂种中亲本染色体的鉴定、外源染色体或染色体片段的检测、物种进化及亲缘关系的探讨、遗传转化材料的分析、染色体基因组的结构、组成和在细胞中的空间排列等研究中，取得了重要成果，展示了ｆ。

阔的应用前景。

２．１．２．１检测某一特定的染色体、染色体片段或基因组
利用染色体文库，可以将某一特定染色体在中期或间期分裂相的细胞制片中定位，进而分析染色体的结构及其变异（如不平衡移位）。

这一技术使得利用染色体分带技术难以检测的结构变化可以在显微镜下直接观察。

异常染色体可以利用荧光激活细胞分选术（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ—ａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｉｎｇ）将其分离出来，用其作为模板进行ＰＣＲ扩增，以扩增产物作为探针，进行原位杂交，通过杂交信号的分布来研究异常染色体的来源（Ｐｅｄｅｒｓｅｎｅｔａ１．，１９９４，称这一技术为ｒｅｖｅｒｓｅｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｐａｉｎｔｉｎｇ）。

２．１．２．２检测外源染色质
在植物育种方面，很重要的方法就是将含有目的基因的外源染色体片断导入到受体植株中，同时此种方法在构建染色体的物理图谱和特定染色体的ＤＮＡ文库方面的应用也越来越广（Ｃｒａｓｔａｅｔａｌ２０００）。

虽然有多种不同的方法可以用来检测外源染色质，例如以发展最早的分子标记技术～限制性片断长度多态性（ｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎｆｒａｇｍｅｎｔｌｅｎｇｔｈｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ，ＲＦＬＰ）可检测外源染色质，但此方法无法判断外源染色体的数量。

在原位杂交技术中，以高度分散的种特异性重复序列作为探针（Ｋｉｍｅｔａｌ１９９３），使跟踪和鉴定外源染色质具有很高的实用性和直观性，但是分离此种探针难度较大，耗时长。

ＧＩＳＨ却是一种最为高效和精确的方法，它可以准确地估计易位系中外源染色体的数目及检测易位染色体上的断裂位点（Ｊａｃｏｂｓｅｎｅｔａ１．１９９５，Ｇａｒｒｉｇａ—Ｃａｌｄｅｒｅｅｔａ１．１９９９．Ｌｉｍｅｔａ１．２０００）。

２．１．２．３ＲＮＡ序列的定位
Ｈａｒｒｉｓｏｎ等（１９７４）利用Ｈ（标记的ＲＮＡ）检测胎儿肝细胞中球蛋白基因的表达，Ｃｏｘ等（１９８４）利用单链ＲＮＡ探针来检测海胆胚中的组蛋白ｍＲＮＡ（Ｌｅｉｔｃｈｅｔａ１．】９９４）。

自此以来，利用ＲＮＡ序列做探针在动、植物研究中的应用已有许多报道。

在植物中，赋予过程中基因表达的调节，通过原位杂交进行研究的内容包括以下几方面：（１）参与自体不融合基因的互作；（２）花发育过程中基因的调节：（３）种子储藏过程中ｍＲＮＡ的分布、种子萌发过程中基因的表达等。

２．１．３原位杂交技术新的进展
２．１．３．】染色体寡聚核苷酸引物原位杂交技术（ＰＲＩＮＳ）
染色体寡聚核苷酸引物原位杂交技术（ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ·砸ｒｅｅｄｉｎｓｉｔｕｌａｂｅｌｌｉｎｇ。

ＰⅪＮｓ）是利用标记好的寡聚核苷酸引物，在聚合酶催化下，渗入已标记的脱氧核糖核苷酸，进行引物原位延伸，据此检测探针杂交的位置。

在人类细胞遗传学研究中，ＰＲＩＮＳ在重复序列和低拷贝序列作图、染色体鉴定、染色体重排等方面取得成功；在植物中，应用该技术在豆类、谷类和黑麦类等中成功地进行了ｒＲＮＡ基因、端粒序列、ｐＶｆ７重复序列、Ｖｉｃｉｌｉｎ基因的定位（Ｍｅｎｋｅｅｔａ１．１９９８）。

目前ＰＲＩＮＳ还不能有效的检测短片断的单拷贝基因，但此方法省去了繁琐的杂交程序，提高了检测的效率。

２．１．３．２原位ＰＣＲ．ＦＩＳＨ（ｉｎｓｉｔｕＰＣＲ－ＨＳＨ）
传统的原位杂交技术在检测低／单拷贝序列中灵敏度较低，主要因为高度浓缩染色质以及细胞壁碎片和细胞残余的存在，使得低／单拷贝小片断探针与染色体上靶序列的杂交相当困难，而且杂交信号很弱，难以被检测。

原位ＰｅＲ—ＦＩＳＨ技术通过在单细胞或染色体水平上对＂ｆ氐ｃ／单拷贝的特异性ＤＮＡ或ＲＮＡ序列进行原位ＰＣＲ扩增，省去了探针与染色体靶序列的杂交过程，直接根据带有标记的扩增产物来检测定位，它与ＰＲＩＮＳ技术相似，但其反应为多次循环，其灵敏度比常规的ＦＩＳＨ高两个数量级，在低拷贝和单拷贝基因的定位中具有强大的发展前景（王玲等２０００）。

自从１９９０年首次报道以来，逐渐形成了较完整的体系，在人类病理学研究中应用最为广泛（苏惠慈等１９９７）。

２．１．３．３ＤＮＡ纤维ＦＩＳＨ（Ｆｉｂｅｒ－ＦｉＳＨ）
在用ＦＩＳＨ技术构建ＤＮＡ分子图谱时，它的分辨率也就是指两个不同ＤＮＡ探针能够被检测到的最小距离，将决定分子图谱的准确性和精密程度。

以中期染色体作为靶ＤＮＡ的载体，ＦＩＳＨ的分辨率常常只有１．３Ｍｂ的水平，而且目前大多数实验室还不能定位少于ｌＯｋｂ的目标序列．这对于构建高分辩率的ＤＮＡ物理图谱来说，是远远不够的。

因此必须要提高ＦＩＳＨ分辨率。

近年来，在ＤＮＡ纤维（ｅｘｔｅｎｅｄＤＮＡｆｉｂｅｒ）上进行ＦＩＳＨ（Ｆｉｂｅｒ—ＦＩＳＨ），这项技术首先由Ｈｅｎｇ等（１９９２）在人类细胞中获得成功，已将分辨率的水平提高到与常规分子生物学技术ＳｏｕｔｈｅｒｎＢｌｏｔ分析相当的水平，分辨率可达２００ｂｐ，５００ｂｐ左右的靶序列可以被有效地定位（Ｊ．ＨａｎｓｄｅＪｏｎｇ１９９９）。

这项技术已经引入植物，已在马铃薯，番茄、拟南芥（Ｆｒａｎｓｚ１９９６，Ｊａｃｋｓｏｎ１９９８）等植物中获得成功，分辨率可达到１０ｋｂ
左右。

２．１．３．４其他ＦＩＳＨ相关衍生技术
很显然，高分辨率的ＦＩＳＨ将会更有利于我们对单拷贝序列和重复序列在染色体上的组织方式的理解，除Ｆｉｂｅｒ—ＦＩＳＨ外，在ＦＩＳＨ技术基础上发展起了多种先进的技术。

在多色荧光原位杂交方面，有组合标记ＦＩＳＨ（ｃｏｍｂｉｎａｔｏｒｉａｌＦＩＳＨ）、比较基因组原位杂交（ＣＧＨ）；在提高检测灵敏度方面，有酪胺信号放大一ＦＩＳＨ（ＴｓＡ—ＦＩｓＨ）、人工酵母染色体一ＦＩｓＨ（ＢＡＣ／ＹＡｃ—ＦＩｓＨ）；在提高杂交特异性方面，有多肽核酸一ＦＩＳＨ（ＰＮＡ—ＦＩｓＨ）、锁链探针一ＦＩＳＨ（ｐａｄｌｏｃｋ．ＦＩＳＨ）（王玲等２０００）。

它们对ＦＩＳＨ向定量和特异性方面发展大有促进。

２．２原位杂交技术在植物进化生物学中的应用
染色体比较研究一直是进化植物学的主要手段之一。

通过染色体数目，形念，染色体带型等可以获得一些不同类群之间关系的有用信息。

原位杂交则从分子生物学层次，将特定ＤＮＡ序列变为显微镜中染色体上可以直接观察的信号，通过信号的有无及其分布式样的比较，得到有关染色体结构和结构变异直观信息，进而从分子细胞遗传学角度分析种间关系。

下面从ｒＤＮＡ的定位比较和基因组原位杂交等方面详细介绍其应用。

２．２．１重复序列和多拷贝家族的定位
２．２．１．１以ｒＤＮＡ为探针进行染色体识别并建立分子核型
近１００年来，染色体数目及核型变异为研究植物进化提供了重要信息（Ｓｔｅｂｂｉｎｓ，１９７１），但某种程度上由于这种变异不大而便研究很难深入。

例如．一些种的有丝分裂细胞，染色体很小，不易观察到结构变异，因此无法进行细胞学分析。

近年来，由于Ｃ一带技术的应用，相对克服了这种局限，但对于识别每条染色体来说，这项技术所提供的信息量依然很少。

小染色体或在缺少明显识别特征情况下，传统核性分析方法仍然不可行。

ＤＮＡ重复序列作为一种重要的染色体标记，为染色体识别、与物种形成有关的进化及变异分析、植物育种提供了一条新途径。

通过用重复序列及其特殊的分子标记来标定染色体的某些区域，根据这些标记的位置变化可以研究染色体的结构重排和变异（ＺｈａｎｇａｎｄＳａｎｇ１９９８），省去了两性杂交的麻烦．克服了传统方
法（分带、银染技术及配对行为）中的一些限制因素（Ｊｉｅｔａｌ１９９９）。

由于原位杂交不受位点内变异和位点间拷贝数的影响，荧光原位杂交技术己成为重复序列和多拷贝基因家族作图的重要手段。

这些重复序列包含ｒＲＮＡ基因、端粒重复序列、着丝粒重复序列等。

到目前为止，已经从植物中分离得到了大量的重复序列，并且将它们定位在特定的染色体上（Ｂａｄａｅｖａ１９９６，Ｊａｃｋｓｏｎ１９９７，Ｋａｔｓｉｏｔｉｓ１９９８，Ｃｈｅｎ２０００）。

Ｂａｄａｅｖａ（１９９６）３０用高度重复序列（ＰＳＣｌｌ９和ＰＡＳｌ）的定位，结合Ｃ带分析，对１２个山羊草属（Ａｅｇｉｌｏｐｓ）的二倍体种进行了系统的基因组分化分析。

在染色体定位中应用最广泛的多基因家族是１８Ｓ．５．８Ｓ～２６ＳｒＤＮＡ和５ｓｒＤＮＡ，它们已经被成功地定位在多种植物的染色体上（Ｈｉｚｕｍｅｅｔａ１．１９９２，Ｈｉｚｕｍｅ】９９３，１９９９，Ｂａｄａｅｖａ１９９６，ＢａｕｍａｎｄＪｏｈｎｓｏｎ１９９８，ＺｈａｎｇａｎｄＳａｎｇ１９９８．１９９９，Ｏｓ＠ｅｔａ１．１９９８，ＲａｉｎａａｎｄＭｕｋａｉ１９９９，Ｔｒｏｎｔｉｎｌ９９９．Ｒａｋｔｏａｒｉｓｏａ２０００）。

】８Ｓ一５．８Ｓ一２６ＳｒＲＮＡ基因和５ＳｒＲＮＡ基因在动、植物基因中为高度串联重复序列，前者每一个串联重复单位约１０ｋｂ长，包括三个基因和ＩＴＳｔ、ＩＴＳ２及ＩＧＳ三个基因间隔区的基因簇，在基因组中有ｌ对或几对染色体具此位点，其位置在染色体的核仁组织区（ＮＯＲ），当该位点在间期表达时，则能形成核仁，中期的染色体也在ＮＯＲ处具次缢痕（Ｌｅｉｔｃｈ，Ｈｅｓｌｏｐ－Ｈａｒｒｉｓｏｎ．１９９２）；而５ＳｒＲＮＡ基因或者与前者位于同一条染色体上或者位于其它多条染色体上。

这两个基因由于其拷贝数大，不同染色体中该基因位点的长度也可能有变化，而且其位点数目较多，有些位点又不表达，故难以用ＲＦＬＰ或其它遗传学手段将其准确定位。

１８Ｓ．５．８Ｓ一２６ＳＲＮＡ基因簇在染色体上的位置可以用显带、银染等技术初步确定．而５ＳＲＮＡ基因由于无染色体形态学标记，故利用原位杂交技术对之定位是最好的方法。

由于两种ｒＲＮＡ基因在植物基因组中的重复序列高度保守，故可以利用异源探针在不同类群中进行研究，有关定位的研究报道相当多，如大麦属（ＬｅｉｔｃｈＨｅｓｌｏｐ—Ｈａｒｒｉｓｏｎ，１９９２；Ｇｅｃｈｅｆｆ，１９９４）、小麦属（Ｍｕｋａｉｅｔａ１．，１９９１；Ｊｉａｎｇｇｉｌｌ．１９９４）、稻属（Ｆｕｋａｉ１９９４）、云杉属（Ｂｒｏｗ—ｎｅｔａ１．，１９９３）、苏铁属（Ｈｉｚｕｍｅｅｔａｌ，．１９９２）等至少２６属１３０种中已有报道，这些研究使得植物学研究者越来越意识到ｒＤＮＡ以及其它一些重复序列可以作为一种分子标记来研究物种之间的关系，并通过这些基因在染色体水平和基因组水平的定位比较研究束揭示其进化机制。

Ａ¨等人（２０００）利用５Ｓ和２５Ｓ双标ＦＩＳＨ在山黧豆属７个种中期染色体上。