离子交换柱层析法分离氨基酸(共19张PPT)
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管进行光波吸收测定（测定570nm波长的光吸收 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。
值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。
全部加在某一局限部位。
注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树 脂表面
加样示意图
6.洗脱并收集:
将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为 与的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个 烧杯中。其中的加入到直接输出溶液的那个池， 如图
将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，管×50。
3、装柱
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度， 一个同学一手手同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度
注意：
1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀
2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很 小，同时可以适当多加点水。最后一段加水和放 水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂， 但也不能溢出。
18cm
端倒 面好 高平 的 整层 ，析 无管 气 泡 ， 约
4．平衡：
将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取钠 离子强度为的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出 液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的 液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管
内的pH和缓冲液一样）即可上样。在平衡同时 进行调速：
调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流 出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其
各种氨基酸在同一pH时带有不同的电荷，与离子
交换树脂的亲和力有差异，因此可依亲和力从小 到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。
树脂对离子的亲和力，与水合离子半径、电 荷及离子的极化程度有关。水合离子半径愈小、 电荷愈高、极化程度愈大，则它的亲和力愈大。 其中静电力起主要作用。
在ph=5.8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗
注意：设置首管为1，若有50支管，建议末管号设
置为51
7．氨基酸的鉴定：
向各管收集液中加水合茚三酮显色剂并混 干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。
匀（加显色剂规则为：前10管都加，以后每隔一 试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。
2、为什么要使用梯度缓冲液来洗脱？为什么的缓
冲液加入到A池中？
3、三次加入缓冲液的作用分别是什么？ （平衡、加样、洗脱）
4、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点 分别为、、和的蛋白质混合液的方案，并简述 理由。
沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再在加过 以收集液第二管为空白，对加过显色剂和乙醇的试管进行光波吸收测定（测定570nm波长的光吸收值）。
97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，。 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
显色剂的试管中加的50%乙醇溶液，放置10min。 树脂对离子的亲和力，与水合离子半径、电荷及离子的极化程度有关。
离子交换树脂转型示意图
离子交换树脂分离氨基酸原理示意图
四、实验器材
MC99-3自动液相色谱分离层析仪 层析管（20cmX1cm） 专用试管（≥50支） 水浴锅 铝制试管架X2 分光光度计 玻璃棒 移液管
洗瓶
硅胶管
五、实验步骤
1、树脂的准备：
将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成 Na+型后洗至中性待用。方法如下：将干的强 酸型离子交换树脂用蒸馏水浸过夜或搅拌2小 时，使其充分溶胀，倾去细小颗粒，再用4倍体
标准氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成4mg／mL的盐酸溶液。 2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很小，同时可以适当多加点水。
管加一次，但当出现显色时，周围几管都加。）在 97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，。
7．显色剂：称取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加蒸馏水至100mL。
（优选）离子交换柱层析法分 离氨基酸
一、实验目的和要求
1.学习采用离子交换柱层析法分离氨基酸的原理和 方法。
2.掌握离子交换柱层析法的基本操作技术，包括 树脂的装柱加样、洗脱、检查等。
二、实验原理
离子交换树脂是具有酸性或碱性的合成聚苯乙
烯-苯乙二烯不溶性高分子化合物。
各种氨基酸分子的结构不同从而导致pI点不同。
的盐酸溶液。
5．混合氨基酸溶液：将上述天冬氨酸、赖氨酸各溶液按1:3的 比例混合。
6. 两种檬酸钠-氧氧化钠-盐酸缓冲液，钠离子浓度的缓冲液和
钠离子浓度为的缓冲液)取柠檬酸、氢氢化钠和浓盐酸溶于少量 蒸馏水后，定容至500Ml（另一种定容至250mL），冰箱保存。
7．显色剂：称取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加 蒸馏水至100mL。 8．50%乙醇水溶液。
积的2mol/L的盐酸浸泡一小时（树脂换为氢型）， 倾去清液，洗至中性，再用2mol/L的氢氧化钠溶
液做同样处理（树脂换为钠型），洗至中性待用。
2、连接装置
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
梯度混合器→恒流泵→层析管→部分收集器 离子交换树脂转型示意图
）在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再在加过显色剂的试管中加的50%乙醇溶液，放置10min。 1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀 加入左右混合氨基酸溶液，待样品弯月面靠近树脂顶端时，立即用少量浓度为（）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层析管内壁数次，再加入缓冲液 约3～4厘米左右。 方法如下：将干的强酸型离子交换树脂用蒸馏水浸过夜或搅拌2小时，使其充分溶胀，倾去细小颗粒，再用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡一 小时（树脂换为氢型），倾去清液，洗至中性，再用2mol/L的氢氧化钠溶液做同样处理（树脂换为钠型），洗至中性待用。 8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。 层析管（20cmX1cm） MC99-3自动液相色谱分离层析仪 茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发生紫色反应 水合离子半径愈小、电荷愈高、极化程度愈大，则它的亲和力愈大。 掌握离子交换柱层析法的基本操作技术，包括树脂的装柱加样、洗脱、检查等。 两种檬酸钠-氧氧化钠-盐酸缓冲液，钠离子浓度的缓冲液和钠离子浓度为的缓冲液)取柠檬酸、氢氢化钠和浓盐酸溶于少量蒸馏水后，定容 至500Ml（另一种定容至250mL），冰箱保存。 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。 2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很小，同时可以适当多加点水。 水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可。 离子交换树脂分离氨基酸原理示意图 将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成Na+型后洗至中性待用。 将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度，一个同学一手手执烧杯，一手用玻璃棒快速在杯口搅动树脂，使树脂缓慢均匀的流入层析 管。 干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
出的大体顺序为酸性、中性、碱性。本试验所用氨
基酸中，Asp(天冬氨酸)是酸性氨基酸， pI=2.97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，。
茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发生 紫色反应
三、实验试剂
1、732阳离子交换树脂 2、2 mol/L盐酸溶液。 3．2 mol/L氢氧化钠溶液。 4. 标准氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成4mg／mL
注意：
1.试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试
管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时 一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。 水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可。水浴 完成后用镊子和抹布把试管架拿出来。
2. 应避免用手直接接触茚三酮。
六、思考题
1、为什么要使样品缓慢的进入层析柱的树脂？
97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，。
以收集液第二管为空白，对加过显色剂和乙醇的试 将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取钠离子强度为的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的液
体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管内的pH和缓冲液一样）即可上样。 以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线
试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。 将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度，一个同学一手手执烧杯，一手用玻璃棒快速在杯口搅动树脂，使树脂缓慢均匀的流入层析
标绘制洗脱曲线 管。
标准氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成4mg／mL的盐酸溶液。
流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。
5．加样:
平衡好后，停止加入缓冲溶液，待缓冲溶液弯月 面靠近树脂顶端时，关闭下端开口。加入左右混 合氨基酸溶液，待样品弯月面靠近树脂顶端时， 立即用少量浓度为（）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层
析管内壁数次，再加入缓冲液约3～4厘米左右。
加样时应避免冲破树脂表面，且避免将样品
试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。
值）。以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐 调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。
全部加在某一局限部位。
注意：平衡、加样、洗脱时都不能冲破树 脂表面
加样示意图
6.洗脱并收集:
将体积均70mL（建议适量多加）离子强度为 与的两种缓冲溶液分别加入到梯度混合器的两个 烧杯中。其中的加入到直接输出溶液的那个池， 如图
将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
同时开始用部分收集器开始收集洗脱液，管×50。
3、装柱
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度， 一个同学一手手同学控制洗瓶加水的速度以及水流出的速度
注意：
1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀
2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很 小，同时可以适当多加点水。最后一段加水和放 水都要慢，装柱过程中水面一定不能低于树脂， 但也不能溢出。
18cm
端倒 面好 高平 的 整层 ，析 无管 气 泡 ， 约
4．平衡：
将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取钠 离子强度为的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出 液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的 液体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管
内的pH和缓冲液一样）即可上样。在平衡同时 进行调速：
调节恒流泵流速，定时收集流出液并测量流 出液的体积，根据流出液体积与所需时间计算其
各种氨基酸在同一pH时带有不同的电荷，与离子
交换树脂的亲和力有差异，因此可依亲和力从小 到大的顺序被洗脱液洗脱下来，达到分离的效果。
树脂对离子的亲和力，与水合离子半径、电 荷及离子的极化程度有关。水合离子半径愈小、 电荷愈高、极化程度愈大，则它的亲和力愈大。 其中静电力起主要作用。
在ph=5.8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗
注意：设置首管为1，若有50支管，建议末管号设
置为51
7．氨基酸的鉴定：
向各管收集液中加水合茚三酮显色剂并混 干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。
匀（加显色剂规则为：前10管都加，以后每隔一 试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。
2、为什么要使用梯度缓冲液来洗脱？为什么的缓
冲液加入到A池中？
3、三次加入缓冲液的作用分别是什么？ （平衡、加样、洗脱）
4、试设计利用离子交换剂分离一种含等电点 分别为、、和的蛋白质混合液的方案，并简述 理由。
沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再在加过 以收集液第二管为空白，对加过显色剂和乙醇的试管进行光波吸收测定（测定570nm波长的光吸收值）。
97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，。 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。
显色剂的试管中加的50%乙醇溶液，放置10min。 树脂对离子的亲和力，与水合离子半径、电荷及离子的极化程度有关。
离子交换树脂转型示意图
离子交换树脂分离氨基酸原理示意图
四、实验器材
MC99-3自动液相色谱分离层析仪 层析管（20cmX1cm） 专用试管（≥50支） 水浴锅 铝制试管架X2 分光光度计 玻璃棒 移液管
洗瓶
硅胶管
五、实验步骤
1、树脂的准备：
将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成 Na+型后洗至中性待用。方法如下：将干的强 酸型离子交换树脂用蒸馏水浸过夜或搅拌2小 时，使其充分溶胀，倾去细小颗粒，再用4倍体
标准氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成4mg／mL的盐酸溶液。 2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很小，同时可以适当多加点水。
管加一次，但当出现显色时，周围几管都加。）在 97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，。
7．显色剂：称取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加蒸馏水至100mL。
（优选）离子交换柱层析法分 离氨基酸
一、实验目的和要求
1.学习采用离子交换柱层析法分离氨基酸的原理和 方法。
2.掌握离子交换柱层析法的基本操作技术，包括 树脂的装柱加样、洗脱、检查等。
二、实验原理
离子交换树脂是具有酸性或碱性的合成聚苯乙
烯-苯乙二烯不溶性高分子化合物。
各种氨基酸分子的结构不同从而导致pI点不同。
的盐酸溶液。
5．混合氨基酸溶液：将上述天冬氨酸、赖氨酸各溶液按1:3的 比例混合。
6. 两种檬酸钠-氧氧化钠-盐酸缓冲液，钠离子浓度的缓冲液和
钠离子浓度为的缓冲液)取柠檬酸、氢氢化钠和浓盐酸溶于少量 蒸馏水后，定容至500Ml（另一种定容至250mL），冰箱保存。
7．显色剂：称取2g水合茚三酮溶于75mL乙二醇单甲醚中，加 蒸馏水至100mL。 8．50%乙醇水溶液。
积的2mol/L的盐酸浸泡一小时（树脂换为氢型）， 倾去清液，洗至中性，再用2mol/L的氢氧化钠溶
液做同样处理（树脂换为钠型），洗至中性待用。
2、连接装置
干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
梯度混合器→恒流泵→层析管→部分收集器 离子交换树脂转型示意图
）在沸水浴中准确加热15min后冷却至室温，再在加过显色剂的试管中加的50%乙醇溶液，放置10min。 1、装柱过程不可中断，倒树脂要缓慢均匀 加入左右混合氨基酸溶液，待样品弯月面靠近树脂顶端时，立即用少量浓度为（）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层析管内壁数次，再加入缓冲液 约3～4厘米左右。 方法如下：将干的强酸型离子交换树脂用蒸馏水浸过夜或搅拌2小时，使其充分溶胀，倾去细小颗粒，再用4倍体积的2mol/L的盐酸浸泡一 小时（树脂换为氢型），倾去清液，洗至中性，再用2mol/L的氢氧化钠溶液做同样处理（树脂换为钠型），洗至中性待用。 8 的缓冲液中，在阳离子柱中氨基酸洗出的大体顺序为酸性、中性、碱性。 层析管（20cmX1cm） MC99-3自动液相色谱分离层析仪 茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发生紫色反应 水合离子半径愈小、电荷愈高、极化程度愈大，则它的亲和力愈大。 掌握离子交换柱层析法的基本操作技术，包括树脂的装柱加样、洗脱、检查等。 两种檬酸钠-氧氧化钠-盐酸缓冲液，钠离子浓度的缓冲液和钠离子浓度为的缓冲液)取柠檬酸、氢氢化钠和浓盐酸溶于少量蒸馏水后，定容 至500Ml（另一种定容至250mL），冰箱保存。 将层析管与恒流泵，恒流泵与梯度混合器联接。 2、刚开始倒树脂时，水流出速度要控制到很小，同时可以适当多加点水。 水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可。 离子交换树脂分离氨基酸原理示意图 将强酸型阳离子交换树脂用氢氧化钠处理成Na+型后洗至中性待用。 将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度，一个同学一手手执烧杯，一手用玻璃棒快速在杯口搅动树脂，使树脂缓慢均匀的流入层析 管。 干净的烧杯内装入大约20mL树脂和10mL蒸馏水。
出的大体顺序为酸性、中性、碱性。本试验所用氨
基酸中，Asp(天冬氨酸)是酸性氨基酸， pI=2.97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，。
茚三酮跟蛋白质或者多肽在加热条件下发生 紫色反应
三、实验试剂
1、732阳离子交换树脂 2、2 mol/L盐酸溶液。 3．2 mol/L氢氧化钠溶液。 4. 标准氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成4mg／mL
注意：
1.试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试
管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时 一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。 水浴锅内水面刚好没过试管架中层即可。水浴 完成后用镊子和抹布把试管架拿出来。
2. 应避免用手直接接触茚三酮。
六、思考题
1、为什么要使样品缓慢的进入层析柱的树脂？
97;Lys(赖氨酸）是碱性氨基酸，。
以收集液第二管为空白，对加过显色剂和乙醇的试 将层析管与恒流泵联接，从烧杯中吸取钠离子强度为的柠檬酸缓冲液平衡层析柱，流出液达床体积的四倍以上时，用pH试纸测流出的液
体的pH，直到和缓冲液的pH一样时（即试管内的pH和缓冲液一样）即可上样。 以光吸收值为纵坐标，以洗脱体积为横坐标绘制洗脱曲线
试管太多，建议大家进行水浴时使用铝制试管架或100mL烧杯水浴，使用橡皮筋绑试管时一捆不要太多，否则中间的管容易脱出摔裂。 将层析管用层析管架固定在铁架台上适当高度，一个同学一手手执烧杯，一手用玻璃棒快速在杯口搅动树脂，使树脂缓慢均匀的流入层析
标绘制洗脱曲线 管。
标准氨基酸溶液：天冬氨酸2mg/mL、赖氨酸均配制成4mg／mL的盐酸溶液。
流速，反复调整测量直到流速约为1mL/min。
5．加样:
平衡好后，停止加入缓冲溶液，待缓冲溶液弯月 面靠近树脂顶端时，关闭下端开口。加入左右混 合氨基酸溶液，待样品弯月面靠近树脂顶端时， 立即用少量浓度为（）的柠檬酸缓冲溶液冲洗层
析管内壁数次，再加入缓冲液约3～4厘米左右。
加样时应避免冲破树脂表面，且避免将样品