单克隆抗体仿制药物的结构分析策略_贾伟

（ a） Intact protein analysis （ b） Light and heavy chain analysis （ c） Peptide mapping analysis
可能发生在抗体重链。最终确认需要进行更为详细的 肽图分析。肽 图 分 析 是 通 过 蛋 白 酶，将 抗 体 酶 解 为 肽 片段，然后通过液质分析，逐肽段进行氨基酸序列鉴定 的过程。由于肽图分析的数据量巨大，因此专门的，可 以明确提示差异信息及序列覆盖率的分析软件极为重 要［1］。通过比对分析发现此例中的 Herceptin 差异来源 于重链胰蛋白酶切第 35 个肽片段。原研抗体序列为 EEMTK，而仿制单抗为 DELTK，两者质量偏差31． 9721 Da。因为 IgG 具有对称的两条重链，所以其总偏差应 在 63． 94Da。这 与 之 前 在 全 抗 体 分 析 中 两 者 差 别 为 62Da 一致（ 考虑到 Herceptin 分子量近 150000Da，因此 肽图与全蛋白分析结果在误差范围内） 。在检测抗体 氨基酸序列 表 达 正 确 性 的 过 程 中，液 相 良 好 的 分 离 度 与重现性，质谱卓越的测量准确度、以及分析软件在寻 找、对比差异方面是否便捷等性能非常关键。
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图 1 单抗氨基酸序列正确性判断方法示意图［10］
箭头所指向的内部线条为 BiopharmaLynx 软件提示 的可能的差异肽段信号［10］
Fig． 1 Strategy of analyzing protein sequence consistency for biosimilar antibody
然而与 小 分 子 药 物 不 同，抗 体 类 药 物 不 但 分 子 量 巨大，结构复杂，而且因为蛋白翻译后修饰的存在（ 如 糖基化等） ，使抗体具有结构的不均一性，以及高级结 构的可变性等特点。传统的分析方法已经无法满足对 生物大分子 进 行 结 构 检 测 的 需 求。 此 外，出 于 对 使 用 安全性，以及产业保护的考虑，发达国家的药监部门也 在不断地完 善 和 提 升 蛋 白 仿 制 药 的 质 控 要 求。 美 国 FDA 已在 2012 年连续发布了多份有关生物仿制药的 指导文件。在 这 些 文 件 中，不 但 提 出 了 对 抗 体 一 级 结 构的分析要 求，甚 至 涉 及 到 了 高 级 结 构 的 检 测。 而 此 类要求使得液相色谱-质谱联用系统成为必备的工具。
目前，使 用 液 质 系 统 检 测 单 克 隆 抗 体 药 物 结 构 的 分析项目主要有： 氨基酸序列表达正确性、糖基化修饰 形态相似性、以及高级结构统一致性。其中，判断高级
收稿日期： 2012-06-29 修回日期： 2012-07-27 * 电子信箱： wei_jia@ waters．示意图 Fig． 2 Strategy of analyzing protein glycosylation consistency for biosimilar antibody
（ a） Intact protein analysis （ b） Glycan ms / ms analysis （ c） Glycan mapping analysis
糖肽水平可明确糖基化位点及其相连糖型，但其串 联质谱分析难度较大，其原因在于糖肽碎片信号中含有 寡糖与 肽 段 两 种 碎 片，造 成 图 谱 非 常 复 杂，难 以 解 析。 BiopharmaLynx 软 件 可 直 接 分 析 糖 肽 。它 根 据 糖 肽 碎 片
2012，32（ 10）
贾 伟 等： 单克隆抗体仿制药物的结构分析策略
在图 1 中可以发现，单克隆抗体的分子量不只有 一个，这正是抗体糖基化修饰造成的不均一性的体现。 在单抗的研 发 与 生 产 质 控 过 程 中，可 先 在 完 整 单 抗 水 平对其糖型进行快速检测。图 2a 为某单克隆抗体产品 不同批次间 在 全 抗 体 水 平 的 比 较。 可 以 看 出，两 者 并 不完 全 一 致，其 中 下 方 图 谱 中 含 有 Man5＆Man5 与 Man5＆Man6 糖型的单抗比例升高。需要指出的是，目 前使用 MALDI（ 基质辅助激光解析离子化） 作为离子源 的飞行时间质谱（ MALDI TOF） 无法对完整单抗进行糖 型分析。这是因为 MALDI 离子化只能使单抗携带单电 荷。这意味着 MALDI TOF 需要对接近 15 万质荷比的 信号进行处理，但在目前，即使高端 MALDI TOF 质谱 仪的分辨率 也 只 有 几 万，因 此 无 法 分 辨 全 单 抗 的 不 同 糖型。而 ESI（ 电喷雾） 离子源可使单抗带数十个电荷， 因此 ESI QTOF 只需要对 4000m / z 以下的信号进行处 理，这对于 Q TOF 来说是游刃有余的［1］。
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中国生物工程杂志 China Biotechnology
Vol． 32 No． 10 2012
表 1 全球前六大单抗药物专利相关信息 Table 1 The related information of monclonal antibody drugs in the world’s first six places
DOI：10.13523/j.cb.20121015
中国生物工程杂志 China Biotechnology，2012，32（ 10） ： 93-98
单克隆抗体仿制药物的结构分析策略
贾 伟* 陈 熙 周春喜 宋兰坤
（ 沃特世科技（ 上海） 有限公司 上海 100026）
摘要 市场高达数千亿美元的单克隆抗体药物即将结束专利保护期，这对发展中国家产业升级， 提高国民医疗水平，都是一次难得的战略机遇。然而，单抗类蛋白仿制药的研发与质控工作难度 巨大，必须使用液相色谱-质谱联用技术进行分析。针对单抗仿制药结构必须进行的分析项目（ 氨 基酸序列表达正确性、糖基化修饰形态相似性、以及高级结构统一致性） 的液质分析方法进行了 系统介绍。此外还就分析工作效率及质控过程的法规依从问题予以讨论。 关键词 单克隆抗体 生物仿制药 液质联用 四级杆飞行时间质谱 超高效液相色谱 中图分类号 Q819
对单抗中寡糖的分析可以获得更加充分的定性信 息以及更加准确的定量结果。使用糖苷酶将抗体中的 寡糖链切割下并用 2-aminobenzamide 标记后，可通过色 谱将寡糖混 合 物 分 离，使 用 荧 光 及 质 谱 检 测 而 进 行 寡 糖水平分析。 近 年 来，液 相 在 寡 糖 分 析 方 面 取 得 了 长 足的进步，特别是 HILIC（ 亲水相互作用色谱） 的发展， 革命性地提高了液相分析寡糖的能力。与反相色谱对 疏水性肽段的强保留能力相反，HILIC 对寡糖等亲水性 物质的亲和强度大，分离效果好。加之 UPLC 的卓越性 能，使寡糖的液 质 分 析 进 入 了 全 新 的 时 代［2］。Waters 已与 NIBRT 建立了全球共享的 GlycoBase 寡糖分析数 据库，可以通过实验得到的寡糖 GU 值，在此数据库中 查询，对寡糖 进 行 定 性 分 析。 毛 细 管 电 泳 是 另 一 种 寡 糖分析技术。 它 的 理 论 塔 板 数 高，在 上 世 纪 末 成 为 分 离领域的一 个 热 点 探 索 方 向，但 其 具 有 重 现 性 差 等 一 些突出困难。由于毛细管电泳技术需要使用高盐缓冲 液，目前几乎无法与质谱联用。因此，使用毛细管电泳 进行寡糖定性必须具备相应的标准品。在无寡糖标品 的情况下，将无法对寡糖定性。此外，对于不带电荷的 中性寡糖，如常见的 Man5、Man6 等，毛细管电泳无法进
结构一致性的主要内容为二硫键链接正确与否。但对 于高级结构的检测分析项目的标准正在不断提升中。 以下将就 以 上 三 个 检 测 项 目 的 分 析 方 法 逐 一 进 行 阐 述。并在最后就分析工作效率及质控过程的法规依从 问题予以讨论。
1 仿制与原研单抗药物蛋白序列一致性判 断的分析策略
目前认为仿制单克隆抗体与原药的氨基酸序列必 须完全一致，否 则 将 被 认 为 是 新 的 抗 体 药 物。 在 仿 制 的单抗产品 中，错 误 的 氨 基 酸 序 列 产 生 的 来 源 主 要 有 两个： （ 1） 原药厂商出于自身保护，公布了错误的序列； （ 2） 在表达过程中出现偏差，造成序列改变。虽然错误 的来源不同，但都将表现在液质数据中，因此可通过仿制 抗体与原药的对比分析确定序列是否一致。对比分析通 常在三个水平上进行： 完整抗体水平、还原抗体水平、肽 图水平。并使用这三种数据结果间相互验证（ 图 1） 。
2 仿制与原研单抗药物糖基化一致性判断 的分析策略
糖基化 对 蛋 白 的 生 物 活 性 至 关 重 要，因 此 仿 制 单 克隆抗体与 原 研 抗 体 之 间 糖 基 化 修 饰 的 相 似 性，是 生 物仿制药结构确证中第二个必须回答的问题。而实际 上，原药生产 厂 也 无 法 保 证 其 每 批 次 单 抗 成 品 药 物 的 糖基化形式 完 全 一 致。 因 此，仿 制 药 生 产 厂 可 以 采 取 的分析策略是： 对多批次原研抗体的糖基化形式都进 行表征，发现 其 糖 基 化 形 式 的 变 化 范 围。 之 后 证 明 仿 制单抗药 物 的 糖 型 结 构 在 原 研 抗 体 糖 型 的 变 化 范 围 内。抗体糖基化修饰的表征分为 3 个层面。全抗体糖 型分析、糖基化位点分析、寡糖链分析。
中常 见 的 糖 诊 断 离 子 （ 204． 0817m / z、186． 0817m / z、 168． 0817m / z、274． 0187m / z、292． 0817m / z、366． 1012m / z、 657． 1111m / z） ，以及 Y1 离子碎片（ 完整肽段与寡糖还原 端一个糖残基相连形成的离子） 等质谱特点，可以对单 抗中的糖肽自动鉴定分析及定量。所获得的糖肽鉴定 与定 量 信 息，可 用 来 与 全 抗 体 水 平 数 据 进 行 相 互 验证［2］。