ELISA实验方案

实验仪器：组织匀浆器、酶标仪、37℃恒温箱、10ml移液管、200ml量筒、加样器及枪头：0.5-10微升、20-200微升、200-1000微升；吸水纸若干
试剂：生理盐水或PBS缓冲液、蒸馏水
操作：
Step1：组织匀浆：将纹状体按1:2（m/v）加预冷生理盐水或PBS缓冲液用组织匀浆器在冰水浴条件下匀浆，3000转/分钟离心10分钟，取上清液。

Step2：确定样品稀释倍数：分别取空白纹状体、7min时间点纹状体、8h时间点纹状体上清液，按加待测样本50微升、加待测样本20微升+样本稀释液30微升操作，试验确定使OD 值在1.0左右所需稀释倍数。

Step3：洗涤液的配制：20×洗涤缓冲液：蒸馏水按1:20稀释，取10ml洗涤缓冲液加190ml 蒸馏水。

Step4：从室温平衡20min后的铝箔袋中取出所需板条，剩余板条用自封袋密封放回4℃
Step5：设置标准品孔、样本孔和空白孔，空白孔什么都不加；标准品孔各加不同浓度的标准品50微升
注释：1、2…为标准品孔及其复孔，01、02…为空白对照组及其复孔，1-n/2-n/3-n分别为第1、2、3只第n个时间点实验组及其复孔
Step6：待测样本孔先加样本稀释液（由Step2确定，设为x微升），再加待测样本(50-x)
Step7：随后标准品孔和样本孔中加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗体100微升，空白孔不加，用封板膜封住反应孔，37℃恒温箱温育60分钟。

Step7：弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置1分钟，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，重复洗板5次。

Step8：所有孔加入底物A、B各50微升，37℃避光温育15分钟。

Step9：所有孔加入终止液50微升，15分钟内，在450nm波长处测定各孔的OD值。

注意事项：
1. 试剂盒保存在2-8℃，使用前室温平衡20分钟。

从冰箱取出的浓缩洗涤液会有结晶，属于正常现象，水浴加热使结晶完全溶解后再使用。

2. 严格按说明书中标明的时间、加液量及顺序进行温育操作。

3. 所有液体组分使用前充分摇匀。

4. 试剂盒：标准品线性回归系数r大于等于0.9900；最低检测浓度小于10mU/ml；板内、板间变异系数（C.V,SD/MN）均小于15%。