TCID50 EID50实例

实例1鸡新城疫油苗制备
（一）培养病毒按实习四将鸡新城疫病毒接种于9～11d鸡胚的尿囊腔中，接种后48～72h收获病毒，供检测与制苗用。

（二）检测尿囊液病毒的EID50
1．EID50的概念EID50为半数鸡胚感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种鸡胚后，能使半数鸡胚发生感染的病毒量。

2．病毒EID50的测定
（1）稀释病毒将收获的尿囊液充分混匀后取1ml，作10倍递进稀释至10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…稀释度。

（2）接种鸡胚每个稀释度接种9～11d SPF鸡胚5枚，接种量为0.1ml/枚，37℃温箱培养，逐日观察至120h，其间死亡的鸡胚及时拿出冷藏，至第5d时将所有的鸡胚置4℃冰箱中冷却4h或过夜，收获每枚鸡胚的尿囊液，分别存放。

（3）检测血凝价，判断感染情况用微量血凝试验逐枚检测鸡胚尿囊液中病毒的血凝价，当HA≥1:128时判为感染。

3．根据血凝价计算EID50：EID50计算举例
(1)EID50测定结果见表实-5。

表实-5 EID50测定结果(接种剂量0.1ml)
（2）按Reed和Muench法计算EID50
EID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的
对数
本例高于50%感染鸡胚的病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.5，稀释系数的对数为-1。

代入上式则：
lg EID50=（-6）＋0.5×（-1）=-6.5
∴EID50=10-6.5/0.1ml
即：将病毒悬液作10-6.5稀释后，给鸡胚接种0.1ml，可以使50%的鸡胚感染。

(3)结果判断
在生产实践中，通过EID50检测，当尿囊液中病毒的EID50≥10-6.0时，方可作为制苗毒液，达不到标准的毒液应弃去或浓缩处理，达到毒价标准后方可灭活制苗。

实例2鸡传染性法氏囊炎弱毒活疫苗制备
（一）培养病毒
按实训五制备鸡胚成纤维细胞悬液，通过细胞计数结果，调细胞数为100万个/ml。

按0.3%～0.5%的量同步接种鸡传染性法氏囊弱病毒，
置37℃5%CO2培养箱培养72～96h，观察CPE，由法氏囊炎病毒所致的CPE主要表现为细胞变圆、拉丝、脱落等。

细胞出现70%以上的CPE时即可将培养瓶反复冻融3次，收获病毒，供检测用。

（二）检测TCID50
1．TCID50的概念TCID50为半数细胞培养物感染量，是利用不同稀释度的病毒液接种细胞后，能使培养细胞一半发生细胞病变的病毒量。

2．病毒TCID50的测定
（1）稀释病毒液将细胞培养的病毒液作10倍递进稀释，即稀释成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7…。

（2）接种细胞培养板取适宜稀释度的病毒液分别与培养液按1∶1混合，接种于96孔细胞培养板上。

每个稀释度接种4～6孔，每孔100µL，同时设立病毒对照和细胞对照组。

置37℃5%CO2培养箱培养72h。

观察记录病变情况。

（3）判断70%以上的细胞出现CPE判为感染。

3．TCID50计算举例
（1）CPE结果见表实-6
表实－6 TCID50测定结果(接种剂量100µL)
（2）计算按Reed和Muench法
TCID50的对数=高于50%病毒稀释度的对数＋距离比例×稀释系数的对数
本例高于50%病毒稀释度的对数为-6，距离比例为0.68，稀释系数的对数为-1。

代入上式则：
lgTCID50=（-6）＋0.68×（-1）=-6.64
∴TCID50=10-6.64，100µL
即：将病毒悬液作10-6.64稀释后，给细胞培养物接种100µL，可以使50%的细胞产生CPE。

（3）结果判断当细胞培养毒液中病毒的TCID50≥10-6.0方可判为合格。