生物技术实验室仪器操作简介

一. 实验目的
1.掌握琼脂糖凝胶电泳的原理; 2.学习琼脂糖凝胶电泳的操作。
二. 实验原理
琼脂糖是一种天然聚合长链状分子，沸水中溶解， 45℃开始形成多孔性刚性滤孔，凝胶孔径的大小决定于 琼脂糖的浓度。
DNA分子在碱性环境中带负电荷，在外加电场作 用下向正极泳动。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时， 有电荷效应与分子筛效应。DNA分子量及构型不同， 其泳动率就不同，从而分出不同的区带。琼脂糖凝胶电 泳法分离DNA，主要是利用分子筛效应。
4) 所加电压：低电压时，线状DNA片段的迁移速率与所加电 压成正比。
5) 嵌入染料的存在：降低线性DNA迁移率。 6) 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA的迁移率，无离
子存在时，核酸基本不泳动，离子强度过大产热厉害，熔 化凝胶并导致DNA变性，一般采用1×TAE，1×TBE， 1×TPE（均含EDTA pH8.0）。
操作程序：
台面清洁消毒 紫外灯灭菌30分钟
进行无菌操作 清理工作台面 紫外消毒30分钟 关闭紫外灯、电源
注意事项：
1）工作台面上，不要存 放不必要的物品，以 保持工作区内的洁净 气流不受干扰。
2）操作时一定注意关掉 紫外，防止对实验人 员造成伤害
灭菌锅
使用及性能： 细菌和细胞培养以及核酸等有关实验所用的
操作步骤：
1、图像采集
1）将电泳样品放入分析装置中 2）打开电脑，运行Smart View 软件，单击“Import”键进入
图像获取项目栏，选择“获取视频图像”键，进行图像采集 3）选 择紫外或可见光源，在图像采集窗口中调节好图像大
小、亮度及焦距 4）单击“采集图像”键，根据图像质量选择好优化摄影时间
溴化乙锭（EB）为扁平状分子，在紫外照射 下发射荧光。EB可与DNA分子形成EB-DNA复合 物，其发射的荧光强度较游离状态EB发射的荧光 强度大10倍以上，且荧光强度与DNA的含量成正 比。用肉眼观察，可检测到5 ng以上的DNA。
附 注：
1．影响DNA在琼脂糖凝胶中迁移速率的因素：
1) DNA分子大小
2．溴化乙锭（EB）：致癌剂，操作时应戴手套，尽
量减少台面污染。
3．电泳指示剂：核酸电泳常用的指示剂有两种，溴酚
蓝（bromophenol blue, Bb）呈蓝紫色；二甲苯青 （xylene cyanol, Xc）呈蓝色，它携带的电荷量比溴酚 蓝少，在凝胶中的的迁移率比溴酚蓝慢。
三. 仪器和试剂
四. 操作步骤
（1）制胶（以20 mL为例） a. 称取0.2 g 琼脂糖，加入20 ml 的1×TAE缓冲液摇匀； b. 微波炉加热，至琼脂糖完全溶解（要防止过热溢出三角
瓶）； c. 将制胶板放入制胶槽中，插入适当的梳子，将溶解的琼
2、仪器通电后，不要临时增加或拨除输出导线插头，以 防短路。
3、由于不同介质支持物的电阻值不同，电泳所通过的电 流量也不同，其泳动速度及泳至终点所需时间也不同，故 不同介质支持物的电泳不要同时在同一电泳仪上进行。
4、使用过程中发现异常现象，如较大噪音、放电或异常 气味，须立即切断电源，进行检修，以免发生意外。
PCR仪
PCR仪，也称DNA热循环仪、基因扩增仪，能使 一对寡核苷酸引物结合到正负DNA链上的靶序列两 侧，从而酶促合成拷贝数为百万倍的靶序列DNA片 段，它的每一循环包括DNA变性、复性、延伸三个 反应。
PCR仪主要应用于基础研究和应用研究等许多领域， 如基因分析、序列分析、进化分析、临床诊断、法医 学等。
实验一
生物技术实验室常用仪器 设备简介及操作
实验室主要仪器，设备的简介及使用方法
➢ 微量移液器 ➢ 高速台式离心机 ➢ PCR仪 ➢ 凝胶成像系统 ➢ 电泳仪 ➢ 恒温气浴摇床 ➢ 超净工作台 ➢ 灭菌锅
微量移液器
微量移液器是连续可调的、计量和转移液体的专用仪器， 其装有直接读数容量计。
微量移液器有多种规格，在移液器量程范围内能连续调 节读数。
电泳仪
DYY-12型电脑三恒多用电泳仪（北京六来自百度文库仪器厂）
操作程序：
1）电泳槽的两个电极与电泳仪的直流输出端连接（极 性不要接反）；
2）打开电源，设置参数（选择稳压稳流方式及电压电 流范围）；
3）按“启动”启动程序（输出为高电压，注意安全）； 4）电泳结束，按“停止”键终止程序。
注意事项
1、电泳仪工作时，禁止人体接触电极、电泳物及其它可 能带电部分，也不能到电泳槽内取放东西，以免触电，同 时要求仪器有良好接地端，以防漏电。
台式高速离心机使用步骤
1、把离心机放置于平面桌或平面台上，检查离心机是否 放置平稳。
2、将离心管对称放入转子内，且要事先平衡。 3、锁紧门盖。 4、插上电源插座，按下电源开关。 5、设置转子号、转速、时间：
（常用，最高转速为13000r/min，时间最长为20min）； 注意：对应的转子不可超速使用，否则对试管或转子有损坏。 6、当转子停转后，打开门盖取出离心管，关断电源开关。
恒温气浴摇床
使用及性能：
➢摇床（振荡器）广泛用于对 温度和振荡频率有较高要求 的细菌培养、发酵、杂交、 生物化学反应以及酶和组织 研究等。实验室常用的液体 摇匀，微生物、细菌和细胞 培养。
SHK-99-Ⅱ型台式空气恒温摇床
操作程序：
1）样品瓶牢固放入弹簧夹中； 2）接通电源开关，设定参数（温度、时间、转速等）； 3）按启动键启动仪器，按暂停键可暂停托盘的旋转； 4）按下控制面板的电源键两秒，显示屏显示消失，关闭
V=
1 logN
（V：迁移速率
N：碱基对数目）
2) 琼脂糖浓度：不同的凝胶浓度，分辨不同范围的DNA Agarose： 0.5%：1-30 kb； 0.7%： 0.8-12 kb； 1.2%: 0.4-7 kb； 1.5%： 0.2-3 kb.
3) DNA构象：
一般迁移速率超螺旋环状>线状DNA>单链开环。
仪器 微量移液器，电泳仪，电泳槽，微波炉
试剂 琼脂糖：1.0%； 电泳缓冲液（PH8.0）（50 × TAE 电泳缓冲液：取 Tris24.2g ，冰醋酸5.7ml ， 0.25mol/L EDTA (pH8.0) 20ml ，加蒸馏水至100ml ） EB：5 µl / 100 ml TBE
电泳样品：标准分子量核酸（DL2000）
（一般情况下在12秒左右），即开始采集。
2、图像保存 单击“System 键”选择“另保存图像为”键，出现一个“图像文 件登记”窗口，输入标题，实验人，实验日期，实验摘要等 信息，按“保存”键完成图像文件登记，同时出现“另保存图 像为”窗口，输入图像名，保存图像至桌面。 3、关闭操作系统 （1）关闭紫外/可见光。 （2）退出软件界面。 （3）关闭紫外与可见分析装置的电源。
试剂、器皿及实验用具，应严格灭菌； 对于经过导入DNA重组分子的菌株，操作后
必须进行严格的高压消毒灭活处理 。
操作程序：
1）开盖：转动手轮，使锅盖离开密封圈，添加蒸馏水刚没 至板上； 2）通电：打开控制面板上电源开关，若水位低则红灯亮； 3）堆放物品：需包扎的灭菌物品，体积不超过 200mm×100mm×100mm为宜，各包装之间留有间隙， 利于蒸汽穿透，提高灭菌效果； 3）密封高压锅：推横梁入立柱内，旋转手轮，压紧锅盖； 4）灭菌：121℃， 20min；如为液体，液体必须装在可 耐高温的玻璃器皿中，不宜超过2/3； 5）灭菌结束，所有东西放入干燥箱干燥，排尽水气。
0.5～10μl
10～100μl 常见规格
20～200μl
100～1000μl
量液的操作步骤：
第一停点 第二停点
A 保持微量移液器垂直，将按钮压至第一停点； B 微量移液器头尖端浸入溶液，缓慢释放按钮； C 保持微量移液器垂直，将微量移液器头与容器壁接触，慢
慢压下按钮至第一停点； D 压至第二停点把溶液完全释放出； E 释放按钮回原状。
注意事项：
1、离心机在运转时，不得移动离心机，不要打开门盖。 2、安放离心机的台面应坚实平整，四只橡胶机脚都应与
台面接触和均匀受力，以免产生振动。 3、离心管加液要平衡，若加液差异过大运转时会产生大
的振动，此时应停机检查，使加液符合要求，离心试管必 须对称放入。 4、若运转时有离心试管破裂，会引起较大振动应立即停 机处理。 5、离心机彻底停止后，才可开盖，取样。
操作程序:
1）开机：打开电源，显示主界面； 2）创建程序：使用”create”输入新程序（包括PCR 循
环数，预变性、变性、复性、延伸的时间和温 度），保存程序（包括用户名和方法名）; 3）放入样品，盖上盖子; 4）在所建用户名下按“run”键，找到设定的程序， 按“start”键启动程序; 5）运行结束后按“stop”键停止运行，取出样品，关 闭电源。
量液操作注意问题：
1． 未装吸嘴的微量移液器绝对不可用来吸取任何液体。 2． 一定要在允许量程范围内设定容量，千万不要将读 数的调节超出其适用的刻度范围，否则会造成损坏。 3． 不要横放或倒拿带有残余液体吸嘴的移液器。 4． 不要用大量程的移液器移取小体积样品。
5. 移液器使用完后，将刻度调到最大刻度，收藏。
注意事项：
1、 不要戴“脏”手套触摸电脑鼠标、键盘及其它位置； 2、 不要戴“脏”手套触摸仓门和灯箱电源开关； 3、 不要戴“脏”手套触摸外接电源开关； 4、在图像获取过程中，若通过软件打开紫外/可见光，则
必须再通过软件关闭，若通过紫外与可见分析装置上 打开紫外/可见光，则从分析装置上关闭，严禁互用， 导致紫外灯长亮。
电源总开关。
超净工作台
使用及性能：
超净工作台为分子生物 学无菌操作提供可能， 分为垂直送风和水平送 风两种。
超净台由三相电机作鼓风动力，空气通过由特 制的微孔泡沫塑料片层叠合组成的“超级滤清器” 后吹送出来，形成连续不断的无尘无菌的超净空 气层流，即所谓“高效的特殊空气”，能够防止 附近空气可能袭扰而引起的污染，同时也不会妨 碍采用酒精灯或本生灯对器械等的灼烧消毒。工 作人员就在这样的无菌条件下操作，可以保持无 菌材料在转移接种过程中不受污染。
如何设置一个PCR程序：
1、预变性：可用94～95℃，2～10min,一般用 5min。 2、变性：一般用94℃，30s~2min,一般45s~1min。 3、退火：温度自定，30s~2min。 4、延伸：72℃，对于(1kb=1min,每增加1kb加1min)。 5、循环数：一般25～35个循环(2,3,4步循环）。 6、最终延伸：72℃，5～15min。 7、保存：4℃，时间设为0。 8、END。
台式高速离心机
离心机的分类 低速：每分钟几千转 高速：每分钟1 ~ 3万转 超速：每分钟3万转以上
离心机的功能：分离，纯化
低速：细胞等大分子 高速：DNA，蛋白等 超速: 病毒，蛋白，细胞器等
➢基因片段的分离、酶蛋白的沉淀和回收以及其它生物样品 的分离制备实验中都离不开低温离心技术 ➢本实验室所用离心机:台式高速离心机（ Thermo ），配有 角式转头：24×1.5ml；极限转速13000rpm ;台式低温高速 离心机（sigma),极限转速20000rpm。
FR-980生物电泳图像分析系统
系统简介：
系统可以通过紫外/可见光分析装置及透光扫描仪直接 获得核酸、蛋白质凝胶电泳图像。系统配置有 SmartView生物电泳图像分析软件，可以进行密度扫 描、密度定量、分子量计算等电泳分析。此外，该系统 含有多种图像滤波器，可降低图像的噪音，从而获得较 清晰的图像。
注意事项：
1）如是手动的灭菌锅，灭菌过程中，应注意排 净锅内冷空气，否则会影响灭菌效果。
2）灭菌结束后，要等温度降为“0”，才可打开灭 菌锅锅盖；
3）高压蒸汽灭菌时，须保持高温高压，因此必 须严格按照操作规程操作，否则易发生意外 事故。
实验二
琼脂糖凝胶电泳的制 备及核酸检测
带电荷的物质在电场中的趋向运动称为电泳。电泳一 般分为自由界面电泳和区带电泳两大类:自由界面电泳 不需支持物，这类电泳目前已很少使用;而区带电泳则 需用各种类型的物质作为支持物，常用的支持物有滤纸、 醋酸纤维薄膜、非凝胶性支持物、凝胶性支持物及硅胶 -G薄层等，分子生物学领域中最常用的是琼脂糖凝胶电 泳其优点主要在于操作简单、快速、灵敏。