UNG酶用途
PCR反应体系
反 应 体 系
PCR
镁离子
引物及探针 模板
06
PCR buffer
PCR反应缓冲液的目的是给Taq DNA聚合酶提供一 个最适酶催反应条件。
成分 Tris-HCl KCl NH4+ 小牛血清白蛋白 明胶 Tween 20 二硫苏糖醇（DTT） 浓度 10-50mmol/L ≤50mmol/L 16.6mmol/L 100μg/ml 0.01% 0.05% ～0.1% 5mmol/l 有助于酶的稳定，提高试 剂的稳定性。 作用 平衡ph值 利于引物的退火（产率比 较高） 特异性比较好
的提高了扩增的准确性内参基因是为了平衡不同模板之
间的差异。加入浓度50μ L体系加入0.1μ L 25μ M ROX， 终浓度为versetranscripatase）是以RNA为模板指
导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。 ROX（ROX Reference Dye）一般用于ABI、 Stratagene等公司的Real Time PCR扩增仪上。用于消 除信号本底以及效正孔之间产生的荧光信号，最大限度
Taq酶
Taq酶是从水生栖热菌 Thermus Aquaticus （ Taq ）中分 离出的具有热稳定性的DNA聚合酶。
5'到 3'合成 DNA能力 普通Taq酶 有 5'到 3'外 切酶活性 有 3'到 5'外 切酶活性 无 3'端加A
延伸速度
有
2000base/min
热启动Taq酶
有
有
无
有
2000base/min
P C R 反 应 体 系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
尿嘧啶DNA糖苷酶(UNG酶)说明书
尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG酶）说明书货号：U8180规格：1U/μl，200U保存：每天或每周使用保存于-20℃。
长期储存可保存于-70℃，但必须严格避免-70℃保存时的反复冻融。
产品介绍：尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG、UDG）来源于大肠杆菌重组克隆表达，分子量为25kDa，可催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶。
UNG酶对RNA无活性，主要应用于PCR扩增产物的防污染。
其作用原理基于：如果在PCR反应中以dUTP替代dTTP掺入DNA中，形成了含dU碱基的PCR扩增产物，该酶能选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解该PCR扩增产物。
储存缓冲液20mM Tris-HCl，150mM NaCl，1mM EDTA，1mM DTT，0.05%Tween20，50%glycerol，pH8.0.活性定义37℃条件下，1小时降解1μg含dU碱基的单链DNA的酶量为1单位。
质量控制1、SDS-PAGE电泳纯度大于98%；2、降解活性、批间差异、稳定性；3、1U UNG在37℃处理3分钟后，103拷贝以下含U模版应完全降解，不能产生扩增产物；4、无外源核酸酶活性，无外源内切、外切核酸酶污染。
1、Incubate the product for2min at50℃；2、Inactivate UNG by heating to95℃for5min.注意事项：1、避免多次冻融，切勿暴露在温度波动较大之处。
温度波动对产品的稳定性有极大影响。
2、UNG酶可以在PCR反应前清除不慎污染的含dUTP的PCR产物，从而避免由于污染导致的假阳性结果；3、由于不同待扩增基因对dUTP的利用效率和对UNG酶的敏感度不同，因此，如果采用UNG体系导致检测灵敏度下降，应对反应体系进行调整优化；4、扩增前后要使用专用的区域和移液器，戴手套操作并经常更换，PCR反应完成后切勿打开反应管。
以最大限度的减少PCR产物对样品的污染。
荧光定量PCR常见问题解析
荧光定量PCR常见问题解析（一）1、普通PCR与荧光定量PCR技术区别？①荧光定量PCR能够实时监测PCR反应的全过程，对每一个循环进行定量或定性分析；而普通PCR只能对反应的终产物进行半定量或定性分析。
②荧光定量PCR的结果分析可以直接通过电脑读出，而普通PCR的结果必须通过下一步的电泳进行条带分析。
2、荧光定量PCR技术的特点①灵敏度高、特异性强。
② PCR实验过程全封闭，仪器自动分析和获取实验结果，无后续实验操作。
③实时监测反应过程，定量更准确。
④定量范围宽，可达到10个数量级。
⑤可以实现一次反应检测多个样本。
3、实时荧光定量PCR实验操作注意事项①应该带一次性乳胶手套并经常更换，在试剂准备室和样本处理室应该配备负压式生物安全柜，以防止对环境或对样品的污染。
②要严格防止气溶胶交叉污染。
采取的措施有：使用一次性带滤芯移液枪吸头；不使用吸头吹打液体进行混匀；在生物安全柜中进行离心操作；尽量减少在生物安全柜以外开启试剂或PCR管；禁止在荧光定量PCR结束后打开PCR管盖。
③实验中牵涉的有毒有害及有污染的样本及试剂应该严格按照生物安全相关规定操作和处理。
④荧光探针应该避光保存，加入反应液后应尽快上机，以防探针粹灭。
⑤在进行RNA相关操作时，必须使用无RNase的实验器具及耗材，并加样后立即上机操作，以防RNA的降解。
⑥所有试剂在开启之前都要瞬时离心；试剂配制完成后要瞬时离心以去除气泡。
⑦不要在荧光定量PCR管上做任何标记，不能用手接触PCR管盖上采光部位。
4、实时荧光定量PCR实验无CT值出现或无扩增信号的问题及解决方案①实验的循环数不够，设计的循环数应该在35以上，可增加至45个循环，但不可高于45个循环。
②通道选择不对，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求选择采光通道。
③荧光采集位置设计有误，应该仔细阅读产品说明书，根据说明书的要求设置荧光信号采集位置。
④引物或探针降解，要求厂家重新发货验证。
Real-Time PCR 简介
平台期
Cycle number
1
2
平台出现得迟早与模板的初始量有关，模板初 始量越多，平台出现得越早。
平台效应产生的因素：
引物二聚体的产生、反应产物、各组分的消
耗和变性、引物和已扩增的DNA片段间的竞争
等
PCR 常见问题及分析
1、扩增失败
UNG酶的好处
有效地防止污染������
UNG酶能切断所有含dU的双链或单链DNA
含U的DNA是PCR产物，其气溶胶造成实验室污染
商用PCR试剂盒均以dUTP取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的 DNA链。在定量PCR开始前增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将已 有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染。
不再随循环次数的增加而呈指数增长
技术服务部
靶序列
靶序列
Cycle 1
5' 3'
1
3' 5'
2
5' 3'
3' 5'
Denaturation: 94 – 96°C
5'
3'
5'
3' 5'
5'
3'
3'
Annealing: 50 – 65°C
5' 3'
1
5' 3'
3
5'
4 2
Elongation: 70 – 75°C
酶量增加使反应特异性下降;酶量过少 影响反应产量
四、脱氧核苷三磷酸（dNTP）
dATP、dCTP、dGTP、dTTP(dUTP)的混合物 ,
PCR体系优化
由于Taq DNA聚合酶是目前PCR反应体系中应用最广泛的酶，因此此文主要讨论使用该酶的PCR反应体系。
A 镁离子浓度镁离子是热稳定DNA聚合酶的辅因子，其浓度对PCR至关重要.模板DNA的浓度，鳌合物（如EDTA和柠檬酸盐）、dNTP浓度和蛋白都会影响反应体系中游离镁离子的量.如果游离的镁离子含量不够，那么Taq DNA聚合酶则无法行使功能(figure1)。
过多的游离镁离子则会降低酶的保真度，可能会增加非特异性扩增.因此，研究者应当根据实际的实验结果来优化每一反应中镁离子的浓度。
可以用一系列的镁离子浓度梯度来验证，镁离子浓度范围为1～4mM，每次增加或降低0。
5~1 mM。
扩增产量最高，非特异性产物最低时的镁离子浓度即为最优。
最优镁离子的浓度范围跟DNA聚合酶的类型相关，例如,Pfu DNA 聚合酶似乎对镁离子的依赖性更低,但其优化范围通常为2~6mM.许多DNA聚合酶产品提供Mg—free reaction buffer和单独一管25mM MgCl2，这样就可以自行调节Mg2+浓度，优化反应体系。
MgCl2溶液在反复冻融后会出现浓度分层,为获得均一的溶液，在配液的时候，要确保MgCl2溶液完全溶解并充分震荡混匀。
非常简单的两步,溶解和混匀，常常会造成实验失败。
有些科学家倾向于使用包含MgCl2的buffer,MgCl2的终浓度为1。
5mM.值得注意的是有文献报道发现使用此类buffer的结果并不稳定，有时体系内游离镁离子的浓度会有0.6mM 的变化，如果在90℃加热10min,则结果趋于稳定，因此作者假设反复冻融的buffer中MgCl2可能会有沉淀现象发生。
Figure 1.镁离子浓度对PCR扩增的影响。
用不同浓度Mg 2+测试，产物大小为1。
8kb琼脂糖凝胶电泳,EB染色泳道M为MAKER；Lane 1，0mM Mg 2+ ; Lane 2, 0。
5mM Mg 2+ ;Lane 3, 1mM Mg 2+ ; Lane 4, 1。
UNG酶用途
UNG酶用途UNG酶用途因PCR是一种极敏感的扩增技术，易受污染的影响。
小量的外源DNA 污染可以与目的模板一块被扩增。
当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染，这称之为残余污染；从其他样品中纯化的DNA 或克隆的DNA 也会是污染源。
卫生部已经明确规定，凡是用于临床检验的PCR试剂，都应该有UNG酶技术，以防止污染。
控制污染的方法主要有两种：1 、在PCR 实验过程中使用良好的实验步骤和实验环境减少残余污染：使用抗气雾剂移液管的阻止气雾剂进入eppendorf 管内；为PCR 样品配制和扩增后分析设计隔离的区域；在准备新反应前更换手套；总是使用不含有模板的阴性对照检测污染；使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。
? 使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），这种酶（也称为尿嘧啶-N- 糖基化酶或UNG酶）移除DNA 中的尿嘧啶，在PCR 反应液配制时，将dUTP和dTTP 按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对UNG 敏感，所有可以在PCR 前对新配制的反应用UNG 处理以破坏残余产物，杜绝污染。
UNG酶特征? 克隆有Thermu aquaticus DNA Polymerase 基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次过柱纯化分离出来的重组蛋白。
? 50ul 体系中，加入0.1U 的UNG 酶，能够消除10 7 带有dUTP 的、大于6 个碱基的双链DNA 污染。
? 反应条件：37-50 ℃，2 分钟；反应buffer 20mM Tris-HCl(PH8.0); 1mM EDTA; 1mM DTT 。
dNTP中加入了dUTP,那么扩增产物dna里就有了dUTP，就把把产物里的T 全变成了U，如果你的PCR产物是用来做克隆，或者是用来做PCR模板之类的，UNG酶一般不能用。
但是一般做real time PCR，或者PCR产物只需要跑胶鉴定一下，这种情况下完全不影响。
三种荧光定量PCR检测方式比较
三种荧光定量PCR检测方式比较：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR进程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一样是在PCR扩增的指数期进行的。
常见检测方式可分为以下几类：(1) SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链 DNA 结合发光的荧光染料。
其与双链 DNA 结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链 DNA 的数量相关，能够依照荧光信号检测出 PCR 体系存在的双链 DNA 数量。
SYBR Green I 的最大吸收波长约为 497nm，发射波长最大约为 520nm。
PCR 扩增程序一样为 94℃～55℃～72℃三步法，40 个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于 SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只若是双链就会结合发光，对 PCR 反映中的非特异性扩增或也会产生荧光，通常本底较高，因此在临床上利用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I 的优势：SYBR Green I 的优势是因为其缺点产生，由于它能所有的双链相结合，因此对不同模板不需专门定制不同的特异性探针，通用性较好，而且价钱相对较低。
这对科研是很有利的，因此国内外在科研中利用比较普遍。
(2) 水解探针模式(man探针)TaqMan 探针是一种探针，荧光基团连接在探针的5’结尾，而淬灭剂那么在3’结尾。
当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
在进行延伸反映时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。
一分子的产物生成绩伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积存。
因此 Taqman 探针检测的是积存荧光。
PCR 扩增程序一般是：94℃～60 ℃ 40 个循环。
经常使用的荧光基团是 FAM，TET，VIC，HEX。
QPCR原理
Wild-Type DNA
5’...GCGGACCGCG..
After Bisulfite Treatment: Unmethylated DNA 5’...GUGGAUUGUG..
Methylated DNA
5’...GCGGAUCGCG..
高通量 SNP 筛查
SNP Amplifluor™ Primer (UniPrimer™)
在定量PCR开始前增加50°C的保温步骤， UNG酶即可将已有的PCR产物降解破坏，防止可能造成的污染
Block temperature [°C]
仪器热启动
100
8°C/sec
80
脉冲 PCR
=
60
6°C/sec
超快的升温速度 +
极大缩短初始升温所需时间
40
20
• Innovative tecThimniecal feature for device-supported HotStart PCR
医学方面应用前景更是令人鼓舞 •极微量的基因表达定量 •病原体检测
绝通对常定用量标准品作为外参照制作标准曲线.
注意保持与目的基因的同源性
Unknown
标准曲线的制作
什么是阈值
基线信号的标准偏差 x 10
基线
标
阈
准
值
偏
差
基线阈值CT值
基线
阈 值
CT值
标准曲线方法
20- ••
1918-
CT
171615-
PCR Quencher
Real Time PCR 技术的诞生
• 1992年，Higuchi R等第一个报导了实时定量PCR技 术
Higuchi R, Fockler C, etal. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology,
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)说明书
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)说明书货号：U8180规格：200U保存：-20℃保存。
产品说明：UDG酶分子量25kDa，能特异性识别DNA单链或双链中的尿嘧啶残基，并从DNA上水解去除尿嘧啶残基，防止DNA发生突变，是碱基切除修复过程中的重要组分，对RNA无活性。
UDG酶常被用于消除PCR扩增中的残余污染。
在PCR反应液配制时，将dUTP和dTTP按一定的比例混用，使得扩增产物都含有脱氧尿嘧啶。
在进行PCR扩增前，在PCR混合液添加UNG酶，并增加2分钟37℃～50℃的保温步骤即可消除以往PCR产物的残留污染，由于UNG在PCR循环中的94℃变性一步便可被灭活，因此不会影响新的含dU的PCR产物。
活性定义：60分钟内催化1nmol尿嘧啶从含尿嘧啶双链DNA上释放所需要的酶量定义为一个单位。
质量控制：经多次柱纯化，SDS-PAGE检测纯度大于95%；PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。
1×UDG反应缓冲液：20m M Tris-HCl(pH8.0a t25℃)；1mM Dithiothreitol；1m M EDTA（可使用1×Taq反应缓冲液）使用建议：U D G酶在Taq酶反应缓冲液中同样具有活性。
在P CR反应液中直接添加UDG酶即可，推荐用量为0. 2U每50μl体系，在PCR循环程序前增加2分钟37℃～50℃保温及可完全消除多达1ng含UTP模板的污染。
应用实例：UNG酶特异性降解含UTP的DNA模板反应体系（以50μl反应体系为例）PCR循环程序：2×Taq PCR MasterMix25μl50℃，2分钟（降解含UTP的染模板）500bp模板（含UTP）1ng94℃，4分钟（灭活UDG，模板变性）500bp引物对终浓度0.2μM30次循环：94℃，30秒250bp模板（无UTP掺入）1ng54℃，30秒250bp引物对2终浓度0.2μM72℃，30秒ddH2O up to50μl72℃,5分钟对照组未添加UDG酶；4℃,保温验组每50μl反应体系中添加0.2U UDG酶。
UNG酶在兽用生物制品支原体PCR检测中防止假阳性的应用
UNG酶在兽用生物制品支原体PCR检测中防止假阳性的应用郭建华;李向碧;岳秀阳;曹政【摘要】为了研究尿嘧啶-N-糖基化酶(UNG酶)在减少兽用生物制品支原体PCR 检测中的假阳性情况,本研究通过在PCR试剂中加入UNG酶,在PCR反应前25℃作用10 min,再50℃作用2 min,结果显示,该法可以有效防止PCR产物的污染,减少假阳性的产生.【期刊名称】《中国兽医杂志》【年(卷),期】2016(052)007【总页数】3页(P83-85)【关键词】UNG酶;兽用生物制品;PCR;假阳性【作者】郭建华;李向碧;岳秀阳;曹政【作者单位】西南大学荣昌校区动物医学系,重庆荣昌402460;重庆澳龙生物制品有限公司,重庆荣昌402460;重庆澳龙生物制品有限公司,重庆荣昌402460;重庆澳龙生物制品有限公司,重庆荣昌402460【正文语种】中文【中图分类】TQ464.8支原体是无细胞壁、必须细胞内寄生的单细胞微生物，经常见于生物制品的污染[1]。
现行的中国兽药典中，对支原体的检查规定用细胞培养法，在显微镜下看到支原体菌落作为判断的依据，但检查的时间长达29 d，所以常见于成品、血清的检验，对半成品、原辅材料则用培养法检验不能满足需要，所以很多厂家采用更加快捷的PCR方法进行检验。
PCR方法非常敏感，但在阴性对照甚至空白对照中会出现假阳性的情况，使实验者无法对结果进行判断。
尿嘧啶-N-糖基化酶（UNG酶）可以降解含有脱氧尿嘧啶核苷酸（dU）的双链DNA或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键。
如果在PCR反应体系中以dUTP取代dTTP，使PCR产物都是含有dU的DNA链，在PCR开始前增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的dU的DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂，消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。
同时UNG酶被灭活，不会再降解新扩增的产物U-DNA。
2022年新疆PCR上岗证考试题
2022年新疆PCR上岗证考试题一，填空(每题2分，共20分)1. DNA双螺旋中两条链走向是反向平行的，即一股链是5'→3'走向，另一股链为3'→5' 走向:生物合成方向是5'→3’。
2.在极端的PH值或受热条件下，核酸分子中的氢键断裂，双螺旋结构解开，即为核酸变性。
3. 核酸分子的杂交其实就是DNA 变性、复性原理的应用。
4. PCR扩增的三个基本阶段是变性、退火、延伸，引物与模板的结合发生在退火阶段5.反转录酶催化的DNA合成反应按5'→3'方向进行，在DNA合成时也需要引物，引物为病毒颗粒中的mRNA。
6. PCR 测定中的“假阳性”的最主要的来源是PCR 产物的污染。
7.请填出以下各种微量移液器可取溶液的体积范围P10 0.510ul P20 220ulP100 20100ulP200 50200ul如需吸取100ul液体，则最好使用P100 加样器。
8.在基因扩增检验中，使用的带滤塞吸头吸加液体，只要是为了防止标本间交叉污染。
9. TapMan荧光PCR测定原理中的关键点在于利用了Tap酶的5'→3’的外切酶活性，Ct值指的是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
10.个体化医学的全面定义:分为疾病风险预测(基因检测)和个体化治疗(基因检测)两个方面，基因预测疾病风险是指根据每个人的疾病基因组信息预测疾病的发生风险。
个体化治疗是指根据每个人的疾病基因组信息对已发生的疾病进行治疗。
二，是非题(正确的后面打J，错误的后面打x，并将错误处划线并改正，每题两分，未改正得1分，共20分)1. DNA 双链中，碱基对总是AT,CG配伍，其间以两个氢键相连。
(X)GC间以三个氢键相连2.使用有防“污染”作用的UNG的PCR试剂盒，PCR 实验室就不必严格分区。
(X) UNG 酶只对低浓度的产物污染有效3. 在全血、骨髓标本的采集时，可使用EDTA、枸缘酸钠或肝素抗凝。
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)使用说明
尿嘧啶-DNA糖基化酶(UDG)使用说明货号：U8180规格：200U保存：-20℃保存。
产品说明：UDG酶分子量25kDa，能特异性识别DNA单链或双链中的尿嘧啶残基，并从DNA上水解去除尿嘧啶残基，防止DNA发生突变，是碱基切除修复过程中的重要组分，对RNA无活性。
UDG酶常被用于消除PCR扩增中的残余污染。
在PCR反应液配制时，将dUTP和dTTP按一定的比例混用，使得扩增产物都含有脱氧尿嘧啶。
在进行PCR扩增前，在PCR混合液添加UNG 酶，并增加2分钟37℃～50℃的保温步骤即可消除以往PCR产物的残留污染，由于UNG 在PCR循环中的94℃变性一步便可被灭活，因此不会影响新的含dU的PCR产物。
活性定义：60分钟内催化1nmol尿嘧啶从含尿嘧啶双链DNA上释放所需要的酶量定义为一个单位。
质量控制：经多次柱纯化，SDS-PAGE检测纯度大于95%；PCR方法检测无大肠杆菌DNA残留，无核酸内、外切酶污染。
1×UDG反应缓冲液：20m M Tris-HCl(pH8.0a t25℃)；1mM Dithiothreitol；1m M EDTA（可使用1×Taq反应缓冲液）使用建议：U D G酶在Taq酶反应缓冲液中同样具有活性。
在P CR反应液中直接添加UDG酶即可，推荐用量为0.2U每50μl体系，在PCR循环程序前增加2分钟37℃～50℃保温及可完全消除多达1ng含UTP模板的污染。
应用实例：UNG酶特异性降解含UTP的DNA模板反应体系（以50μl反应体系为例）PCR循环程序：2×Taq PCR MasterMix25μl50℃，2分钟（降解含UTP的染模板）500bp模板（含UTP）1ng94℃，4分钟（灭活UDG，模板变性）500bp引物对终浓度0.2μM30次循环：94℃，30秒250bp模板（无UTP掺入）1ng54℃，30秒250bp引物对2终浓度0.2μM72℃，30秒ddH2O up to50μl72℃5分钟对照组未添加UDG酶；4℃保温验组每50μl反应体系中添加0.2U UDG酶。
(最新整理)PCR反应体系
模板
➢ 单、双链DNA均可。 ➢ 不能混有蛋白酶、核酸酶、DNA聚合酶抑制剂、
DNA结合蛋白类。 ➢ DNA模板使用量一般为20-200ng。 ➢ 模板浓度过高会导致反应的非特异性增加。 ➢ RNA模板注意保证其防止RNA降解。
其他成分
➢ RNasin（RNase Inhibitor）的作用：RNA酶 抑制剂，抑制RNA酶的活性。
➢ UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU 的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成 的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高 温下会进一步水解断裂，从而被消除。UNG 酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。
其他成分
➢ 反转录酶（Reversetranscripatase）是以RNA为模板指 导三磷酸脱氧核苷酸合成互补DNA（cDNA）的酶。
PCR反应体系
PCR 原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）是指在DNA聚合酶催化下， 以母链DNA为模板，以特定引物为延伸起点，通过变性、退火、延伸等 步骤，体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程。
01 PCR buffer
PCR
02 Taq酶
反 应
03 dNTPs
非特异性 产物减少 扩增
导致错配 产物减少
Mg2+可与负离子结合,所以反应体系中dNTP、EDTA等的 浓度影响反应中游离的Mg2+浓度。
引物及探针
➢ 引物是人工合成的一段寡核苷酸序列。一般为20 个碱基。
➢ 引物的序列与模板结合的特异性是决定PCR反应 结果的关键。
➢ 探针是人工合成的在两端分别标记荧光基团的一 段寡核苷酸序列。
温度敏感型UNG酶(TS-UNG)
温度敏感型UNG酶（TS-UNG）货号：U8170规格：1U/μl保存：保存于-20℃。
并避免保存时反复冻融。
产品介绍:TS-UNG（Temperature Sensitive UNG）是经大肠杆菌重组表达获得的温度敏感型UNG酶。
该酶能够催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶，对RNA无活性，主要应用于PCR扩增中防止产物污染。
TS-UNG酶与E.coil基因来源的常规UNG酶相比，对温度敏感、易于灭活，避免了常规UNG酶灭活后可能存在的残留活性在常温下对含dUTP扩增产物的降解作用。
TS-UNG酶可以在20℃~37℃，5~10min反应，以消化含dUTP的模板；然后，在50℃10min或95℃2min进行灭活。
利用TS-UNG酶低温消化、易于灭活的特性，它可以很好地与RT-PCR扩增反应程序相匹配，从而应用于反转录扩增防止产物污染。
活性定义：37℃条件下，1小时降解1µg含dU碱基的单链DNA的酶量为1单位。
储存缓冲液：20mM Tris-HCl，100mM NaCl，0.1mM EDTA，1Mm DTT，0.1%Triton X-100，50%glycerol，pH7.5反应条件：1、反应体系:Component Volume per Reaction（μl）Concentration in Master MixTemplate*<1μg/reactionPrimer11~50.2~1.0μMPrimer21~50.2~1.0μMd NTPs*200μM （dATP、dGTP、dCTP）d UTP(replace dTTP）*400μM10×PCR Buffer51×25mM MgCl22~8 1.0~4.0mMTaq（5U/μl）0.25 1.25UTS-UNG（1U/μl）0.5(0.1-0.5)0.5U(0.1~0.5U)H2O*——Total volume50μl2、Incubate the product for10min at37℃；3、Inactivate TS-UNG by heating to50℃for10min，or95℃for2min；质量控制：1、SDS-PAGE电泳纯度大于98%；2、降解活性、批间差异、稳定性；3、无核酸外切酶和核酸内切酶活性、RNase酶活性；注意事项:1、在20℃~37℃范围内，TS-UNG酶的活性随温度的升高有所增加，常用20℃、25℃、37℃进行反应，可对酶的用量（0.1~0.5U）及反应时间（5~10min）进行优化；特别适合RT-PCR防污染使用；2、由于不同待扩增基因对dUTP的利用效率和对UNG酶的敏感度不同，因此，如果采用UNG体系导致检测灵敏度下降，应对反应体系进行调整优化；3、避免多次冻融，切勿暴露在温度波动较大之处。
PCR上岗证考试题及答案(全)
理论考试卷一，填空（每题2分，共20分）1.DNA双螺旋中两条链走向是反向平行的，即一股链是5’→3’走向，另一股链为3’→5’走向；生物合成方向是5’→3’。
2.在极端的PH值或受热条件下，核酸分子中的氢键断裂，双螺旋结构解开，即为核酸变性。
3.核酸分子的杂交其实就是DNA 变性、复性原理的应用。
4.PCR扩增的三个基本阶段是变性、退火、延伸，引物与模板的结合发生在退火阶段5.反转录酶催化的DNA合成反应按5’→3’方向进行，在DNA合成时也需要引物，引物为病毒颗粒中的mRNA 。
6.PCR测定中的“假阳性”的最主要的来源是PCR产物的污染。
7.请填出以下各种微量移液器可取溶液的体积范围P10 P20 2-20ul P100 20-100ul P200 50-200ul如需吸取100ul液体，则最好使用P100 加样器。
8.在基因扩增检验中，使用的带滤塞吸头吸加液体，只要是为了防止标本间交叉污染。
9.TapMan荧光PCR测定原理中的关键点在于利用了Tap酶的5’→3’的外切酶活性，Ct值指的是每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数。
10.个体化医学的全面定义：分为疾病风险预测（基因检测）和个体化治疗（基因检测）两个方面，基因预测疾病风险是指根据每个人的疾病基因组信息预测疾病的发生风险。
个体化治疗是指根据每个人的疾病基因组信息对已发生的疾病进行治疗。
二，是非题（正确的后面打√，错误的后面打×，并将错误处划线并改正，每题两分，未改正得1分，共20分）1.DNA双链中，碱基对总是A-T ,C-G配伍，其间以两个氢键相连。
（×）G-C间以三个氢键相连2.使用有防“污染”作用的UNG的PCR试剂盒，PCR实验室就不必严格分区。
（×）UNG酶只对低浓度的产物污染有效3.在全血、骨髓标本的采集时，可使用EDTA、枸缘酸钠或肝素抗凝。
（×）不能使用肝素抗凝4.血清HBeAg的存在是HBV感染及感染程度的确证标志。
东洋纺酶学 尿嘧啶DNA糖苷酶（UNG），热敏性 说明书
https:///seihin/xr/lifescience/JAPAN CHINATOYOBO CO., LTD. TOYOBO (SHANHAI) BIOTECH CO., LTD. Tel(81)-6-6348-3888 Tel(86)-21-58794900.4140 F1715KUracil-DNA Glycosylase (UNG), Heat-labileCode No. UNG-101 200 U×1Store at －20°C [ 1 ] IntroductionUracil-DNA Glycosylase (UNG) hydrolyzes the N-glycosylic bond between the deoxyribose sugar and the base in uracil-containing DNA leaving an apyrimidinic site in DNA. Since DNA with an apyrimidinic site is degraded by heat treatment, UNG can be used in combination with dUTP to prevent carry-over of amplified products derived from PCR.This enzyme hydrolyzes uracil from both single- and double-stranded DNA containing dU, but it not from RNA. It can also be used to prevent carryover of RT-PCR.[ 2 ] ComponentsProduct name Conc. Package Code No. Storage Uracil-DNA Glycosylase (UNG),Heat-labile1 U/μL 200 U×1 UNG-101 －20°C [ 3 ] Properties(1) Unit definitionOne unit of UNG is defined as the amount of enzyme required to release 1 nmol uracil from uracil-containing DNA per hour at 37°C.(2) Heat inactivationThis enzyme is completely and irreversibly inactivated by incubation for 10 minutes at 50°C.19-7[ 4 ] SourceProduced in E. coli (ung-) strain expressing a recombinant uracil DNA glycosylase gene of Atlantic cod (Gadus morhua) UNG.[ 5 ] Buffer compositionConc. Component20 mM Tris-HCl, pH 7.5 (25℃)50 mM NaCl1 mM DTT0.1% (v/v) Tween2050% (v/v) Glycerol[ 6 ] Usage exampleBy adding to PCR reagent and incubating at room temperature (20-25℃) just prior to PCR reaction (RT reaction in RT-PCR), it is possible to eliminate carryover of uracil-containing amplified products. Since UNG is inactivated during PCR denaturation, there is no effect on the following reaction.The following table shows a preparation example and reaction cycling conditions using UNG and our qRT-PCR reagent (THUNDERBIRD TM Probe One-step qRT-PCR Kit, Code: QRZ-101). Please change the amount of UNG as necessary.RNase free water X μL X μL2×Reaction Buffer 10 μL25 μL1×DNA Polymerase 0.5 μL 1.25 μLRT Enzyme Mix 0.5 μL 1.25 μLForward Primer 10 pmol 25 pmol 0.5 μM Reverse Primer 10 pmol 25 pmol 0.5 μM TaqMan® probe 4 pmol 10 pmol 0.2 μM50×ROX Reference dye 0.4 / 0.04 μL 1 / 0.1 μL1×/ 0.1×Uracil-DNA Glycosylase（UNG）, Heat-labile 0.4 μL 1.0 μL 0.4 / 1.0 U RNA solution Y μL Y μLTotal reaction volume 20 μL50 μLJAPAN CHINATOYOBO CO., LTD. TOYOBO (SHANHAI) BIOTECH CO., LTD.Tel(81)-6-6348-3888 Tel(86)-21-58794900.4140JAPAN CHINATOYOBO CO., LTD. TOYOBO (SHANHAI) BIOTECH CO., LTD. Tel(81)-6-6348-3888 Tel(86)-21-58794900.4140Cycling conditions Temperature TimeUNG reaction 25℃ 10 min. Reverse transcription 50℃ 10 min. Denaturation 95℃ 1 min. PCR Denaturation: 95℃ 15 sec. (40～45 cycles) Extension (Annealing) 60℃ 45 sec.[ 7 ] Related productsProduct name Package Code No.Uracil-DNA Glycosylase (UNG), Heat-labile<Glycerol Free> 200 U ×1 UNG-201 dUTP (100 mM) 0.5 mL ×1 UTP-101 dNTPs Mixture (A, C, G, U each 2 mM) 1 mL ×1 NTP-501 THUNDERBIRD TM Probe One-step qRT-PCR Kit 100 reactions QRZ-101。
UDG酶
尿嘧啶DNA糖基化酶Uracil-DNA Glycosylase(UNG酶)一、产品规格100ul 1U/ul-20℃保存二、产品简介尿嘧啶DNA糖基酶（UDG）来源于大肠杆菌重组克隆表达。
该酶分子量为25KDa，它催化含尿嘧啶的单链和双链DNA释放游离尿嘧啶，它对RNA无活性。
主要应用于PCR扩增产物的防污染。
它的作用原理基于：在PCR反应中以dUTP替代dTTP掺入DNA中，形成了含dU碱基的PCR扩增产物，Uracil-DNA Glycosylase能选择性断裂单链和双链DNA中U碱基的糖苷键，降解PCR扩增产物。
三、单位定义37ºC-50ºC，1小时，可降解1mg含dU碱基的单链DNA的酶量为1单位。
四、酶储存缓冲液50% glycerol, 30mM Tris-HCl (pH 7.5), 150mM NaCl, 1mM EDTA, 1mM DTT, 0.05% Tween 20。
五、反应缓冲液10 x Reaction Buffer : 100mM NaCl, 200mM Tris-HCl (pH8.0), 10mM EDTA, 1mg/ml BSA。
六、使用介绍1、 Taq酶与UNG酶的反应缓冲液和酶储存液可以通用。
2、 通常将Taq酶与UNG酶按一定的比例加入PCR反应体系中，先37ºC-50ºC 2分钟，进行dUTP的消化，然后94ºC4分钟灭活，（同时这一步也达到预变性的效果），随后做PCR扩增。
3、 PCR反应体系配制示例反应液组份 加量 (μl)终浓度 备注10×PCR buffer 5 1×上游引物 5 50~900nM下游引物 5 50~900nMdATP（10mM） 1 200nMdGTP（10mM） 1 200nMdCTP（10mM） 1 200nMTaq酶（5U/ul）0.5模板 5ddH2O 21.5总体积504、反应条件：37℃-50ºC 2分钟，94℃4分钟，然后94℃30秒40个循环，最后72℃5分钟。
实时荧光定量PCR简介、结果分析及报告
示温度的不一致性等；
试剂问题：如Taq酶和（或）反转录酶的失活、探针的纯
度及标记效率和核酸提取试剂的效率等；
广西临床检验中心
失控的一般情况
阳性质控或样本失控的预防措施
纯化核酸：但不能完全避免来自标本核酸提取过程中所混入的去垢剂、 有机溶剂的抑制作用；
重复性实验：对临床样本进行重复双份测定，避免由于操作的随机性
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对数曲线与线性曲线的转换
对数曲线
线性曲线
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数据分析一般流程
曲线分析（Amplification Plot）
检测通道的选择：该步骤主要是由于多色
荧光检测在PCR检测中的应用越来越广泛，
比如含有内标的试剂，内标的检测通道与 目的基因的检测通道不同，因此需根据需 求选择不同的通道进行结果分析。
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标准曲线分析
斜率、截距、相关性
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数据分析一般流程
标准曲线分析（Standard Curve）
Slope（斜率）：理论值为-3.32。可以从两个方面来分析，首先是标准曲线 的10倍梯度关系，如果梯度正确，斜率数值会比较接近理论值；其次是试剂
的扩增效率，当梯度正确的情况下，扩增效率越高越接近理论值。
• 定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利 用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最 后通过Ct值和标准曲线对未知模板起始浓 度进行定量分析的方法。
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TaqMan作用机理
1. 2. 3.
forward primer
5' 3'
每产生一条DNA链，就切断一条探针 每切断一条探针，就产生一个单位信号 信号强度与结合探针的DNA分子数成正比
三种荧光定量PCR检测方式比较
三种荧光定量PCR检测方式比较：以参照物为标准，对PCR终产物进行分析或对PCR进程进行监测，从而达到评估样本中靶基因的拷贝数，称为定量PCR。
定量PCR的可行性定量一般是在PCR扩增的指数期进行的。
常见检测方式可分为以下几类：(1) SYBR Green I 检测模式SYBR Green I 是一种能与双链DNA 结合发光的荧光染料。
其与双链DNA 结合后，荧光大大增强。
因此，SYBR Green I 的荧光信号强度与双链DNA 的数量相关，可以按照荧光信号检测出PCR 体系存在的双链DNA 数量。
SYBR Green I 的最大吸收波长约为497nm，发射波长最大约为520nm。
PCR 扩增程序一般为94℃～55℃～72℃三步法，40 个循环。
SYBR Green I 的缺点：由于SYBR Green I 没有特异性，不能识别特定的双链，只如果双链就会结合发光，对PCR 反映中的非特异性扩增或也会产生荧光，通常本底较高，所以在临床上利用可能会有假阳性发生。
SYBR Green I 的长处：SYBR Green I 的长处是因为其缺点产生，由于它能所有的双链相结合，所以对不同模板不需特别定制不同的特异性探针，通用性较好，而且价钱相对较低。
这对科研是很有利的，因此国内外在科研中利用比较普遍。
(2) 水解探针模式(man探针)TaqMan 探针是一种探针，荧光基团连接在探针的5’结尾，而淬灭剂则在3’结尾。
当探针与靶序列配对时，荧光基团发射的荧光因与3’端的淬灭剂接近而被淬灭。
在进行延伸反映时，聚合酶的5’外切酶活性将探针切断，使得荧光基团与淬灭剂分离，发射荧光。
一分子的产物生成绩伴随着一分子的荧光信号的产生。
随着扩增循环数的增加，释放出来的荧光基团不断积累。
因此Taqman 探针检测的是积累荧光。
PCR 扩增程序一般是：94℃～60 ℃40 个循环。
常常利用的荧光基团是FAM，TET，VIC，HEX。
udg酶作用原理
udg酶作用原理UDG酶作用原理引言UDG酶（Uracil-DNA glycosylase）是一种重要的酶，参与DNA 修复和维护基因组的完整性。
它以其独特的酶活性，在维持DNA的稳定性和可靠性方面扮演着重要角色。
本文将从浅入深，逐步解释UDG 酶的作用原理。
UDG酶的功能UDG酶主要负责修复DNA中的尿嘧啶（Uracil）残基，它能够识别DNA中的尿嘧啶所在的位置，并将其切除。
这一过程对于维持DNA 的正常结构和功能至关重要。
UDG酶的特点•UDG酶具有高度特异性，只能识别和修复DNA中的尿嘧啶残基，不会对其他碱基产生影响。
•UDG酶能够与DNA中的尿嘧啶形成特定的结合，并通过催化作用将其剪切。
UDG酶的作用步骤1.UDG酶首先与DNA中的尿嘧啶形成特异性结合。
2.酶催化作用使酶与DNA链结合更加牢固。
3.UDG酶使尿嘧啶之间的键断裂，并将尿嘧啶残基从DNA链中剪切。
4.酶与DNA链分离，此时DNA中的缺口由DNA修复酶填充。
UDG酶的作用机制UDG酶的作用机制主要包括两个步骤：识别和切割DNA中的尿嘧啶残基。
识别尿嘧啶残基•UDG酶通过其特定的活性位点能够识别DNA中的尿嘧啶残基，与其形成氢键相互作用。
•活性位点中的氨基酸残基与尿嘧啶之间的氢键能够提供稳定的结合力，保证酶和DNA的结合稳定性。
切割尿嘧啶残基•UDG酶通过催化作用使标记尿嘧啶的糖磷酸链键断裂。
•酶催化作用的过程中，能够将水分子引入反应中，使尿嘧啶与DNA链分离。
•断裂后的DNA链上形成一个缺口，由DNA修复酶填充修复。
UDG酶的重要意义UDG酶在维持基因组稳定性和完整性方面发挥着重要作用。
防止突变的发生•通过修复DNA中的尿嘧啶残基，UDG酶能够防止突变的发生。
尿嘧啶残基的存在可能导致碱基对错误配对，进而导致突变。
•及时修复尿嘧啶残基可以有效减少遗传信息的丧失和突变的积累。
协助其他修复酶•UDG酶在DNA修复过程中与其他修复酶紧密合作，共同完成对DNA的修复工作。
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UNG酶用途
UNG酶用途
因PCR是一种极敏感的扩增技术，易受污染的影响。
小量的外源DNA 污染可以与目的模板一块被扩增。
当前一次扩增产物用来进行新的扩增反应时，会发生共同来源的污染，这称之为残余污染；从其他样品中纯化的DNA 或克隆的DNA 也会是污染源。
卫生部已经明确规定，凡是用于临床检验的PCR试剂，都应该有UNG酶技术，以防止污染。
控制污染的方法主要有两种：
1 、在PCR 实验过程中使用良好的实验步骤和实验环境减少残余污染：使用抗气雾剂移液管的阻止气雾剂进入eppendorf 管内；为PCR 样品配制和扩增后分析设计隔离的区域；在准备新反应前更换手套；总是使用不含有模板的阴性对照检测污染；使用预先混合的反应成分，而不是每个反应的每个试剂单独加入。
? 使用尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG酶），这种酶（也称为尿嘧啶-N- 糖基化酶或UNG酶）移除DNA 中的尿嘧啶，在PCR 反应液配制时，将dUTP
和dTTP 按一定的比例混用，使得扩增产物含有脱氧尿嘧啶，这种产物对UNG 敏感，所有可以在PCR 前对新配制的反应用UNG 处理以破坏残余产物，杜绝污染。
UNG酶特征
? 克隆有Thermu aquaticus DNA Polymerase 基因的大肠杆菌经诱导表达后，再经三次过柱纯化分离出来的重组蛋白。
? 50ul 体系中，加入0.1U 的UNG 酶，能够消除10 7 带有dUTP 的、大于6 个碱基的双链DNA 污染。
? 反应条件：37-50 ℃，2 分钟；反应buffer 20mM Tris-HCl(PH8.0); 1mM EDTA; 1mM DTT 。
dNTP中加入了dUTP,那么扩增产物dna里就有了dUTP，就把把产物里的T 全变成了U，如果你的PCR产物是用来做克隆，或者是用来做PCR模板之类的，UNG酶一般不能用。
但是一般做real time PCR，或者PCR产物只需要跑胶鉴定一下，这种情况下完全不影响。
就看你PCR产物是用来干什么了。
尿嘧啶糖苷酶（UNG）法
由于UV照射的去污染作用对500bp以下的片段效果不好，而临床用于检测的PCR扩增片段通常为300bp左右，因此UNG的预防作用日益受到重视和肯定。
1. 原理：在PCR产物或引物中用dU 代替dT。
这种dU化的PCR产物与UNG一起孵育，因UDG可裂解尿嘧啶碱基和糖磷酸骨架间的N-糖基键，可除去dU而阻止TaqDNA聚合酶的延伸，从而失去被再扩增的能力。
UNG 对不含dU的模板无任何影响。
UNG可从单或双链DNA中消除尿嘧啶，而对RNA中的尿嘧啶和单一尿嘧啶分子则无任何作用。
2. dUTP法：用dUTP代替dTTP，使产物中掺入大量dU。
在再次进行PCR 扩增前，用UNG处理PCR混合液即可消除PCR产物的残留污染。
由于UNG 在PCR循环中的变性一步便可被灭活，因此不会影响含dU的新的PCR产物。
3. dU引物法：合成引物时以dU 代dT，这样PCR产
物中仅5ˊ端带dU。
UNG处理后，引物失去了结合位点而不能扩增。
对长片段（1-2kb以上）的扩增用dUTP法效率较用dTTP低，而用dU法就可克服这一缺点。
dU引物最好将dU设计在3ˊ端或近ˊ端。
该法仅能用于引物以外试剂的处理。
4. 优点：可以去除任何来源的污染；UNG处理可以和PCR扩增在同一个反应管内进行；由于扩增产物中有大量dU存在，可彻底消除污染源。
5. 需注意的是掺入dUTP的DNA不应对产物的任何操作有影响，在进行PCR产物克隆时，应该转化UNG-（UNG缺陷）大肠杆菌受体菌，否则转化产物会被受体菌UNG消化掉。
尿嘧啶-N- 糖基化酶(UNG)酶原理：UNG酶的作用原理是选择性水解断裂含有dU的双链或单链DNA中的尿嘧啶糖苷键，形成的有缺失碱基的DNA链，在碱性介质以及高温下会进一步水解断裂，从而被消除.UNG酶的最佳活性温度为50℃，95℃灭活。
作用：为保证PCR结果的准确性，要预防非特异性PCR扩增和污染。
常用的措施是使用UNG酶(Uracil-N-Glycosylase)和Taq酶热启动。
PCR反应最常见, 最重要的污染物是PCR产物,防污染热启动PCR试剂盒以dUTP取代dTTP，所以PCR产物都是含有dU的DNA链。
在PCR开始前增加50℃的保温步骤，UNG酶即可将反应体系中已有的U-DNA污染物中的尿嘧啶碱基降解，并在随后变性这步的条件下DNA链断裂,消除由于污染DNA产生的扩增，从而保证扩增结果的特异性，准确性。
同时UNG酶被灭活,不会再降解新扩增的产物U-DNA。
高品质的UNG酶可以消除高达108的U-DNA产物，和热启动Taq酶一同用于建立含有UNG/dUTP防污染体系的热启动PCR反应系统。
*UNG 酶特征·克隆有Ecoli K12 Uracil-N-Glycosylase 基因的大肠杆菌经诱
导表达后，再经三次过柱纯化分离出来的重组蛋白。
分子量25.66 KDa。
·反应条件：50 ℃，2 分钟；反应buffer: 20mM Tris-HCl(PH:8.0); 1mM EDTA; 1mM DTT 。
dNTP用途:高质量的脱氧核糖核苷酸(dNTP) 对PCR 、RT-PCR 、测序和标记等反应的成功都非常重要；PCR反应中dUTP 替代dTTP ，导致产物中含有尿嘧啶，这种掺入适用于很多应用，将尿嘧啶－N －糖基化酶UNG酶(有时称为UDG) 加入到PCR 反应中，可切割任何污染PCR产物中的尿嘧啶，从而避免错误的形成，这在临床PCR 诊断试剂中应用非常广泛。
如果四种脱氧核糖核苷酸的浓度不一致，将大大增加聚合酶的错配机率；如果纯度不高，或者混有甲基化的脱氧核糖核苷酸将造成产物的甲基化；或者含有脱氧核糖核苷一磷酸、脱氧核糖核苷二磷酸也会降低聚合酶的聚合能力。