现代组织化学技术 ppt课件
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现代组织化学技术
(Modern Histochemical Technolog
解剖学系组织胚胎学教研室
PPT课件
1
现代组织化学的内容
1、经典组织化学 2、免疫组织化学 3、原位杂交组织化学
PPT课件
2
组织化学
(也称细胞化学) （Histochemistry or cytochemistry）
PPT课件
过碘酸
品红硫酸复合物
糖
多醛
紫红色反应产物
无色，即希夫试剂
PPT课件
6
一、组织化学的基本概念
（四）组织化学技术的用途
3. 脂类:
甲醛固定，冰冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料 染色，可呈现相应颜色
4. 核酸:
DNA显示：福尔根反应——稀盐酸水解DNA，再用希夫试剂 处理，形成紫红色产物
DNA和RNA同时显示：甲基绿---派若宁
4
一、组织化学的基本概念
（三）组织化学的基本原理
化学试剂 + 拟检物质
（组织切片或细胞涂片）
化学反应
反应产物沉淀（有色）
（拟检物质所在处）
PPT课件
5
一、组织化学Байду номын сангаас基本概念
（四）组织化学技术的用途
1. 某些离子: 钙离子、铁离子、磷酸根离子等
2. 糖类: 过碘酸希父反应（PAS反应）可以显示多糖和糖蛋白的糖链
0.1 mol/L MgSO4
2.5 ml
2% Pb(NO3)2
1.5 ml
蔗糖 双蒸水
0.8 mg
PPT课件
5 ml
19
乙酰胆碱酯酶(AChE)
1、反应原理（亚铁氰化铜法）：
AChE
碘化乙酰硫代胆碱 + H2O pH 5.5 硫代胆碱 + 醋酸
硫代胆碱 + 铁氰化物
亚铁氰化物
亚铁氰化物 + Cu2+
方法Ⅰ：钙-钴法
R-PO4Na2 +
H2O
CaCl2 酶作用
R-OH + CaHPO4
（无色沉淀）
CaHPO4 Co(NO3)2 Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 (NH4)2S CoS ↓（显色）
PPT课件
10
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅱ：铅法
Pb2+
R-PO4Na2 + H2O 酶作用 R-OH + PbHPO4
Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 + (NH4)2S
CoS (棕黑色)
2、孵育液的成分：
3% β-甘油磷酸钠
2% 巴比妥钠
10 ml 10 ml
2%CaCl2
5%MgSO4 双蒸水
20 ml 1 ml 5 ml
PPT课件
17
酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理（铅法）：
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
双蒸水
1.0 ml
PPT课件
20
细胞色素氧化酶(CCO) 线粒体标志酶
1、反应原理（靛酚法）：
二甲基对苯二胺
CCO pH 5.5
二甲基对苯二胺的侧链氨基氧化
侧链氨基氧化的二甲基对苯二胺 + α-萘酚 O2 靛酚↓(蓝色）
C6H5—C
N—N—C6H5 酶作用 N＝N—C6H5 +2H C6H5—C
N—NH—C6H5 + HCl
N＝N—C6H5
四唑盐(无色)
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甲月朁 （红色1）4
3、色素形成法
II、靛酚蓝法：
H3C CH3 N
+
H3C CH3
OH
N
酶作用
+ 2H2O
NH2
-萘酚
N
二甲基–对–苯二胺
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18
三磷酸腺苷酶(ATPase)
1、反应原理（铅法）：
ATPase
A—P～P ～ P + H2O
A—P～P + H3PO4 + 能量
(ATP钠盐)
Mg2+
H3PO4 + Pb2+
Pb3(PO4)2
Pb3(PO4)2 + (NH4)2S 2、孵育液的成分：
PbS↓(棕黑色)
ATP二钠盐
10 mg
0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（ pH 7.2 ） 10 ml
素而显色。
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12
OPO2Ca
酶作用
β-磷酸萘酚
OH
+
OH
Cl N≡N
α-萘基氯化重氮盐
N=N
OH
PPT课件
13
不溶性偶氮色素
3、色素形成法
I、四唑盐法
是指在孵育液中含有四唑盐或双四唑盐的酶作用底物， 在脱氢酶的作用下，酶作用底物分离出氢原子，形成 红色或蓝色的色素，即甲月朁（càn） 或二甲月朁 ， 它们沉着在酶作用部位，即酶的定位。
PbHPO4 (NH4)2S PbS ↓（显色）
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11
2、偶联偶氮色素法
I、同时偶联法： 该法是孵育液中的底物被酶分解后所产生的
反应物沉淀立即与重氮盐形成重氮化合物的偶氮 色素而显色。
II、后偶联法：
该法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，而
先使酶作用于底物，使其分解产生反应物沉淀，
然后将其浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色
15
靛酚
几种酶的反应原理
酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 三磷酸腺苷酶 乙酰胆碱酯酶 细胞色素氧化酶 一氧化氮合酶
PPT课件
16
碱性磷酸酶（ALP）
1、反应原理（钙-钴法）
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
ALP pH 9.4
R-OH + H3PO4
H3PO4 + CaCl2
CaHPO4
CaHPO4 + Co(NO3)2
3
HE染色 HE染色 醛复红染色
一、组织化学的基本概念
（一）组织化学的提出
（二）组织化学的定义
在保持组织或细胞基本上不改变其生活状 态时的微细结构的条件下，采用显微镜技术观 察某些化学成分或酶活性在组织或细胞内的定 性、定位和定量及其变化规律
定性，定位， 定量; 组织原位，显微镜
铅法（ATPPP酶T课）件
2、孵育液的成分：
亚铁氰化铜 ↓(棕褐色）
碘化乙酰硫代胆碱 盐
5 mg
0.1 mol/L 醋酸缓冲液（ pH 5.5 ） 6.5 ml
0.03 mol/L (7.5%)CuSO4 0.1 mol/L (2.94%) 枸橼酸钠
1.0 ml 0.5 ml
0.005 mol/L (0.164%)铁氰化钾
1.0 ml
ACP pH 5.0
R-OH + H3PO4
H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 + (NH4)2S
Pb3(PO4)2 PbS↓(棕黑色)
2、孵育液的成分：
0.05 mol/L 醋酸盐缓冲液（ pH 5.0 ） 10 ml
3% β-甘油磷酸钠
1 ml
蔗糖
0.8 mg
硝酸铅
PPT课件
10 mg
儿茶酚胺、蛋白质、氨基酸等等
5. 酶类:
通过显示酶的活性来检测酶的存在。
PPT课件
7
常用光镜酶组织化学 显示法反应原理
PPT课件
8
酶组织化学基本反应原理
酶特异性底物 + 相关捕获剂 酶
（孵育液内）
（组织细胞内）
反应产物沉淀（有色）
镜下观察
反应产物沉淀（无色）+置换剂 有色沉淀
PPT课件
9
1、金属-金属盐显示法
(Modern Histochemical Technolog
解剖学系组织胚胎学教研室
PPT课件
1
现代组织化学的内容
1、经典组织化学 2、免疫组织化学 3、原位杂交组织化学
PPT课件
2
组织化学
(也称细胞化学) （Histochemistry or cytochemistry）
PPT课件
过碘酸
品红硫酸复合物
糖
多醛
紫红色反应产物
无色，即希夫试剂
PPT课件
6
一、组织化学的基本概念
（四）组织化学技术的用途
3. 脂类:
甲醛固定，冰冻切片，用油红O、尼罗蓝或苏丹类脂溶性染料 染色，可呈现相应颜色
4. 核酸:
DNA显示：福尔根反应——稀盐酸水解DNA，再用希夫试剂 处理，形成紫红色产物
DNA和RNA同时显示：甲基绿---派若宁
4
一、组织化学的基本概念
（三）组织化学的基本原理
化学试剂 + 拟检物质
（组织切片或细胞涂片）
化学反应
反应产物沉淀（有色）
（拟检物质所在处）
PPT课件
5
一、组织化学Байду номын сангаас基本概念
（四）组织化学技术的用途
1. 某些离子: 钙离子、铁离子、磷酸根离子等
2. 糖类: 过碘酸希父反应（PAS反应）可以显示多糖和糖蛋白的糖链
0.1 mol/L MgSO4
2.5 ml
2% Pb(NO3)2
1.5 ml
蔗糖 双蒸水
0.8 mg
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5 ml
19
乙酰胆碱酯酶(AChE)
1、反应原理（亚铁氰化铜法）：
AChE
碘化乙酰硫代胆碱 + H2O pH 5.5 硫代胆碱 + 醋酸
硫代胆碱 + 铁氰化物
亚铁氰化物
亚铁氰化物 + Cu2+
方法Ⅰ：钙-钴法
R-PO4Na2 +
H2O
CaCl2 酶作用
R-OH + CaHPO4
（无色沉淀）
CaHPO4 Co(NO3)2 Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 (NH4)2S CoS ↓（显色）
PPT课件
10
1、金属-金属盐显示法
方法Ⅱ：铅法
Pb2+
R-PO4Na2 + H2O 酶作用 R-OH + PbHPO4
Co3(PO4) 2
Co3(PO4) 2 + (NH4)2S
CoS (棕黑色)
2、孵育液的成分：
3% β-甘油磷酸钠
2% 巴比妥钠
10 ml 10 ml
2%CaCl2
5%MgSO4 双蒸水
20 ml 1 ml 5 ml
PPT课件
17
酸性磷酸酶(ACP)
1、反应原理（铅法）：
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
双蒸水
1.0 ml
PPT课件
20
细胞色素氧化酶(CCO) 线粒体标志酶
1、反应原理（靛酚法）：
二甲基对苯二胺
CCO pH 5.5
二甲基对苯二胺的侧链氨基氧化
侧链氨基氧化的二甲基对苯二胺 + α-萘酚 O2 靛酚↓(蓝色）
C6H5—C
N—N—C6H5 酶作用 N＝N—C6H5 +2H C6H5—C
N—NH—C6H5 + HCl
N＝N—C6H5
四唑盐(无色)
PPT课件
甲月朁 （红色1）4
3、色素形成法
II、靛酚蓝法：
H3C CH3 N
+
H3C CH3
OH
N
酶作用
+ 2H2O
NH2
-萘酚
N
二甲基–对–苯二胺
PPT课件
18
三磷酸腺苷酶(ATPase)
1、反应原理（铅法）：
ATPase
A—P～P ～ P + H2O
A—P～P + H3PO4 + 能量
(ATP钠盐)
Mg2+
H3PO4 + Pb2+
Pb3(PO4)2
Pb3(PO4)2 + (NH4)2S 2、孵育液的成分：
PbS↓(棕黑色)
ATP二钠盐
10 mg
0.2 mol/L Tris-HCl缓冲液（ pH 7.2 ） 10 ml
素而显色。
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12
OPO2Ca
酶作用
β-磷酸萘酚
OH
+
OH
Cl N≡N
α-萘基氯化重氮盐
N=N
OH
PPT课件
13
不溶性偶氮色素
3、色素形成法
I、四唑盐法
是指在孵育液中含有四唑盐或双四唑盐的酶作用底物， 在脱氢酶的作用下，酶作用底物分离出氢原子，形成 红色或蓝色的色素，即甲月朁（càn） 或二甲月朁 ， 它们沉着在酶作用部位，即酶的定位。
PbHPO4 (NH4)2S PbS ↓（显色）
PPT课件
11
2、偶联偶氮色素法
I、同时偶联法： 该法是孵育液中的底物被酶分解后所产生的
反应物沉淀立即与重氮盐形成重氮化合物的偶氮 色素而显色。
II、后偶联法：
该法是为了防止重氮盐对酶的抑制作用，而
先使酶作用于底物，使其分解产生反应物沉淀，
然后将其浸渍于重氮盐溶液中，使其形成偶氮色
15
靛酚
几种酶的反应原理
酸性磷酸酶 碱性磷酸酶 三磷酸腺苷酶 乙酰胆碱酯酶 细胞色素氧化酶 一氧化氮合酶
PPT课件
16
碱性磷酸酶（ALP）
1、反应原理（钙-钴法）
R-O-PO3Na2 (β-甘油磷酸钠)
ALP pH 9.4
R-OH + H3PO4
H3PO4 + CaCl2
CaHPO4
CaHPO4 + Co(NO3)2
3
HE染色 HE染色 醛复红染色
一、组织化学的基本概念
（一）组织化学的提出
（二）组织化学的定义
在保持组织或细胞基本上不改变其生活状 态时的微细结构的条件下，采用显微镜技术观 察某些化学成分或酶活性在组织或细胞内的定 性、定位和定量及其变化规律
定性，定位， 定量; 组织原位，显微镜
铅法（ATPPP酶T课）件
2、孵育液的成分：
亚铁氰化铜 ↓(棕褐色）
碘化乙酰硫代胆碱 盐
5 mg
0.1 mol/L 醋酸缓冲液（ pH 5.5 ） 6.5 ml
0.03 mol/L (7.5%)CuSO4 0.1 mol/L (2.94%) 枸橼酸钠
1.0 ml 0.5 ml
0.005 mol/L (0.164%)铁氰化钾
1.0 ml
ACP pH 5.0
R-OH + H3PO4
H3PO4 + Pb2+ Pb3(PO4)2 + (NH4)2S
Pb3(PO4)2 PbS↓(棕黑色)
2、孵育液的成分：
0.05 mol/L 醋酸盐缓冲液（ pH 5.0 ） 10 ml
3% β-甘油磷酸钠
1 ml
蔗糖
0.8 mg
硝酸铅
PPT课件
10 mg
儿茶酚胺、蛋白质、氨基酸等等
5. 酶类:
通过显示酶的活性来检测酶的存在。
PPT课件
7
常用光镜酶组织化学 显示法反应原理
PPT课件
8
酶组织化学基本反应原理
酶特异性底物 + 相关捕获剂 酶
（孵育液内）
（组织细胞内）
反应产物沉淀（有色）
镜下观察
反应产物沉淀（无色）+置换剂 有色沉淀
PPT课件
9
1、金属-金属盐显示法