祛瘀生肌法对大鼠糖尿病创面新生肉芽组织中 Bax 和Bcl唱2

基金项目：国家自然科学基金资助项目（Ｎｏ．３９９００１９５）；上海市重点学科建设资助项目（Ｎｏ．Ｔ０３０４）Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｅｎｃｅ：ＢｉｎｇＬＩ，ＭＤ，Ｐｒｏｆｅｓｓｏｒ；Ｔｅｌ：０２１唱６５１６１７８２唱６０５９；Ｅ唱ｍａｉｌ：ｄｒｌｉｂｉｎ８８８＠ｙａｈｏｏ．ｃｏｍ．ｃｎ祛瘀生肌法对大鼠糖尿病创面新生肉芽组织中Ｂａｘ和Ｂｃｌ唱２的影响李福伦，李斌，王振宜，范斌，徐文彬，徐蓉上海中医药大学岳阳中西医结合医院皮肤科，上海２００４３７目的：探讨祛瘀生肌法促进糖尿病皮肤溃疡大鼠模型创面愈合的辨证用药规律。

方法：７２只ＳＤ大鼠尾静脉注射四氧嘧啶造成糖尿病模型后，剪去背部全层皮肤造成糖尿病皮肤溃疡，将其随机分成生肌化瘀方１（生肌方∶化瘀方＝１∶２）组、生肌化瘀方２（生肌方∶化瘀方＝１∶１）组和生理盐水对照组。

分别于创伤后第３天、第７天和第１１天取创面新生肉芽组织，采用免疫组织化学法检测新生肉芽组织中Ｂａｘ和Ｂｃｌ唱２蛋白表达。

结果：生肌化瘀方１组创面愈合时间较生肌化瘀方２组和生理盐水组短（Ｐ＜０．０５）。

创面修复第３天，各组均未检测到Ｂａｘ和Ｂｃｌ唱２表达，创面修复第７天和第１１天，与生理盐水组和生肌化瘀方２组比较，生肌化瘀方１组新生肉芽组织中Ｂａｘ和Ｂｃｌ唱２呈阳性表达（Ｐ＜０．０５）。

结论：祛瘀生肌中药可调节糖尿病大鼠模型创面新生肉芽组织中Ｂａｘ和Ｂｃｌ唱２蛋白表达，是祛瘀生肌法促进创面愈合的原因之一。

重用化瘀药物有利于创面愈合。

关键词：糖尿病；溃疡；伤口愈合；Ｂｃｌ唱２基因；大鼠中图分类号：Ｒ５８７．２９；文献标识码：Ａ；文章编号：１６７２唱１９７７（２００７）０６唱０６６１唱０４ＥｆｆｅｃｔｓｏｆｒｅｓｏｌｖｉｎｇｓｔａｇｎａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｉｎｇｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＢａｘａｎｄＢｃｌ唱２ｉｎｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｔｉｓｓｕｅｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓｄｕｒｉｎｇｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇＦｕ唱ｌｕｎＬＩ，ＢｉｎＬＩ，Ｚｈｅｎ唱ｙｉＷＡＮＧ，ＢｉｎＦＡＮ，Ｗｅｎ唱ｂｉｎＸＵ，ＲｏｎｇＸＵＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＤｅｒｍａｔｏｌｏｇｙ，ＹｕｅｙａｎｇＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＩｎｔｅｇｒａｔｅｄＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅａｎｄＷｅｓｔｅｒｎＭｅｄｉｃｉｎｅ，ＳｈａｎｇｈａｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅＭｅｄｉｃｉｎｅ，Ｓｈａｎｇｈａｉ２００４３７，ＣｈｉｎａＯｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｒｅｓｏｌｖｉｎｇｓｔａｇｎａｔｉｏｎａｎｄｐｒｏｍｏｔｉｎｇｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｔｈｅｒａｐｙｏｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓｏｆＢａｘａｎｄＢｃｌ唱２ｉｎｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｔｉｓｓｕｅｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓｄｕｒｉｎｇｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：Ｓｅｖｅｎｔｙ唱ｔｗｏｍａｌｅＳＤｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓｗｉｔｈｆｕｌｌ唱ｔｈｉｃｋｎｅｓｓｓｋｉｎｌｅｓｉｏｎｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙｄｉｖｉｄｅｄｉｎｔｏ３ｇｒｏｕｐｓ：ＳＪＨＹＲ１唱ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐ，ＳＪＨＹＲ２唱ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐａｎｄｎｏｒｍａｌｓａｌｉｎｅ（ＮＳ）ｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ．ＳＪＨＹＲ１ｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｗｉｔｈＳｈｅｎｇｊｉＲｅｃｉｐｅ（ＳＪＲ，ａｃｏｍｐｏｕｎｄｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｆｏｒｐｒｏｍｏｔｉｎｇｇｒａｎｕ唱ｌａｔｉｏｎ）ａｎｄＨｕａｙｕＲｅｃｉｐｅ（ＨＹＲ，ａｃｏｍｐｏｕｎｄｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌＣｈｉｎｅｓｅｈｅｒｂａｌｍｅｄｉｃｉｎｅｆｏｒｒｅｓｏｌｖｉｎｇｓｔａｇｎａｔｉｏｎ）ａｔａｒａｔｉｏｏｆ１∶２，ｗｈｉｌｅＳＪＨＹＲ２ｗａｓｐｒｅｐａｒｅｄｗｉｔｈＳＪＲａｎｄＨＹＲａｔａｒａｔｉｏｏｆ１∶１．ＩｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｗａｓｕｓｅｄｔｏａｓｓｅｓｓＢａｘａｎｄＢｃｌ唱２ｐｒｏｔｅｉｎｌｅｖｅｌｓｉｎｇｒａｎｕｌａｔｉｏｎｔｉｓｓｕｅ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：ＳＪＨＹＲ１ｃｏｕｌｄａｃｃｅｌｅｒａｔｅｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇａｓｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＳＪＨＹＲ２ａｎｄＮＳ（Ｐ＜０．０５）．Ｏｎｔｈｅｔｈｉｒｄｄａｙｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ＢａｘａｎｄＢｃｌ唱２ｐｒｏｔｅｉｎｓｗｅｒｅｎｏｔｆｏｕｎｄｉｎａｎｙｇｒｏｕｐｓ，ｂｕｔｏｎｔｈｅｓｅｖｅｎｔｈａｎｄｅｌｅｖｅｎｔｈｄａｙｉｎｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ，ＢａｘａｎｄＢｃｌ唱２ｐｒｏｔｅｉｎｓｉｎＳＪＨＹＲ１唱ｔｒｅａｔｅｄｇｒｏｕｐｗｅｒｅｍｕｃｈｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈｏｓｅｉｎｔｈｅｏｔｈｅｒｔｗｏｇｒｏｕｐｓ（Ｐ＜０．０５）．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＳＪＲａｎｄＨＹＲｉｎｄｉｆｆｅｒｅｎｔｒａｔｉｏｓｍａｙａｌｌｈａｖｅａｒｏｌｅｉｎｒｅｇｕｌａｔｉｎｇＢａｘａｎｄＢｃｌ唱２ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｇｒａｎ唱ｕｌａｔｉｏｎｔｉｓｓｕｅｏｆｄｉａｂｅｔｉｃｒａｔｓｄｕｒｉｎｇｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｄｉａｂｅｔｅｓｍｅｌｌｉｔｕｓ；ｕｌｃｅｒ；ｗｏｕｎｄｈｅａｌｉｎｇ；Ｂｃｌ唱２ｇｅｎｅｓ；ｒａｔｓＬｉＦＬ，ＬｉＢ，ＷａｎｇＺＹ，ＦａｎＢ，ＸｕＷＢ，ＸｕＲ．ＪＣｈｉｎＩｎｔｅｇｒＭｅｄ／ＺｈｏｎｇＸｉＹｉＪｉｅＨｅＸｕｅＢａｏ．２００７；５（６）：６６１唱６６４．ＲｅｃｅｉｖｅｄＪａｎｕａｒｙ９，２００７；ｐｕｂｌｉｓｈｅｄｏｎｌｉｎｅＮｏｖｅｍｂｅｒ１５，２００７．Ｆｒｅｅｆｕｌｌｔｅｘｔ（ＰＤＦ）ｉｓａｖａｉｌａｂｌｅａｔｗｗｗ．ｊｃｉｍｊｏｕｒｎａｌ．ｃｏｍ 促进创面修复和减少瘢痕形成是外科领域中既相互联系，又相互矛盾的两个方面。

中医中药能有效促进创面愈合［１，２］，并且能够减少瘢痕形成。

近来有研究报道表明难愈性溃疡创面不易愈合与细胞凋亡失衡有关［３］。

凋亡基因Ｂａｘ可促进创面细胞凋亡，而Ｂｃｌ唱２则抑制细胞凋亡的发生，两者的平衡在创面愈合过程中占有重要地位。

本实验将通过祛瘀生肌中药对ＳＤ大鼠糖尿病皮肤溃疡模型创面的干预作用，观察祛瘀生肌中药对凋亡基因Ｂａｘ和Ｂｃｌ唱２蛋白水平的影响，阐明祛瘀生肌中药促进糖尿病创面愈合的部分机制和辨证用药规律。

１　材料与方法１．１　实验动物　清洁级ＳＤ大鼠，雄性，体质量（２５０±２０）ｇ，８４只，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供（批号：医动字第０４唱２０唱３号）。

在上海中医药大学岳阳中西医结合医院清洁级动物实验室饲养。

１．２　造模方法１．２．１　糖尿病大鼠模型　糖尿病大鼠模型的制造参照付小兵等［４］方法并加以改进。

８４只ＳＤ大鼠禁食不禁水２４ｈ后，分别在乙醚麻醉下尾静脉注射１．５％四氧嘧啶５０ｍｇ／ｋｇ和等体积生理盐水，造模后４ｈ给予５％葡萄糖注射液５ｍｌ灌胃，次日经尾部取血测血糖，血糖值在１１ｍｍｏｌ／Ｌ以上，表明造模成功。

模型制成后，３ｄ测一次血糖，直到动物被处死。

淘汰血糖不达标及不合格者，筛选其中７２只。

１．２．２　糖尿病大鼠难愈创面模型　糖尿病大鼠模型制造完成后３ｄ，参照并改进付小兵等［４］方法以制造糖尿病大鼠难愈创面模型。

ＳＤ大鼠用１％盐酸氯胺酮３ｍｌ／ｋｇ腹腔注射麻醉。

局部备皮，常规消毒后，于ＳＤ大鼠背部取直径为３ｃｍ左右圆形切口，剪开皮肤全层，至皮下筋膜，无菌敷料加盖，每天换药一次。

１．３　实验方法　将７２只糖尿病难愈性创面模型大鼠随机分为创面造模后喂药３ｄ、７ｄ、１１ｄ三个观测时段。

每个时段又分为生肌化瘀方１组、生肌化瘀方２组和生理盐水组，每组各８只。

１．３．１　药物来源及制剂加工　生肌方：黄芪、太子参、白术、生地各１５ｇ。

化瘀方：丹参１５ｇ、水蛭９ｇ、桃仁９ｇ、当归９ｇ。

根据著名中医外科专家顾伯华和唐汉钧教授的临床经验与我科的临床实践，生肌化瘀１方由生肌方和化瘀方按１∶２的比例配制；生肌化瘀２方由生肌方和化瘀方按１∶１的比例配制。

药液由上海中医药大学岳阳中西医结合医院制剂室制备成合剂（批号：０４０７２０），生肌方和化瘀方相当于含生药０．６ｇ／ｍｌ。

生理盐水组予以生理盐水。

３组动物给药剂量根据成人日服用药量折算，每只大鼠灌胃剂量为６ｇ／（ｋｇ・ｄ），从创面造模后第２天开始，每天灌胃１次，连续灌胃３ｄ、７ｄ、１１ｄ。

１．３．２　标本采取　创伤形成后第３天、第７天和第１１天，将动物以氯胺酮麻醉后处死，用眼科手术剪分离新生创面肉芽组织，并成块取下，作为所需实验样品。

１．４　试剂及仪器　大鼠创面模型制备用药：新洁尔灭酊和生理盐水，由上海中医大学岳阳医院提供。

盐酸氯胺酮（上海中西药业股份公司产品）。

四氧嘧啶（Ａｌｌｏｘａｎ，瑞士ＦＵＬＫＡ公司产品），试剂编号为２２４４唱１１唱３，由上海中医药大学药理毒性实验室提供。

罗氏ＡＣＣＵ唱ＣＨＥＫＡＣＴＩＶＥ血糖仪和血糖测试试纸，编号为２００５唱１０，２２８９６９３１，瑞士Ｒｏｃｈｅ公司产品。

１．５　实验步骤１．５．１　Ｂａｘ和Ｂｃｌ唱２蛋白检测　运用免疫组织化学法检测Ｂａｘ和Ｂｃｌ唱２蛋白，在上海复旦大学肿瘤医院病理实验室和上海中医药大学药理毒性实验室进行。

１．５．２　ＨＥ染色切片制备　９组（３个时段，每个时段分３组）标本均用１０％中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，每例分别进行ＨＥ染色（用以对照病理诊断），并同时运用同一试剂进行免疫组化Ｅｎ唱Ｖｉｓｉｏｎ二步法测定。

１．５．３　免疫组化染色　取存档蜡块制成５μｍ连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水。

将切片移入电饭煲水浴中（内含０．０１ｍｏｌ／ＬｐＨ６．０的柠檬酸三钠缓冲液），温度保持在９５～１００℃，煮２０ｍｉｎ，保温１０ｍｉｎ，进行抗原修复，取出后在室温下自然冷却。

Ｔｒｉｓ盐缓冲液（ＴＢＳ）洗涤，５ｍｉｎ３次。

滴加一抗（分别为Ｂａｘ兔ＩｇＧ多抗、Ｂｃｌ唱２兔ＩｇＧ多抗及相应抗体稀释度），在湿盒中室温（２０～２５℃）孵育６０ｍｉｎ后移入４℃冰箱过夜。

ＴＢＳ洗涤３次。

滴加ＥｎＶｉｓｉｏｎ反应液（抗鼠，抗兔），５０μｌ／片，室温下孵育３０ｍｉｎ。

ＴＢＳ洗涤３次。

０．０５％３，３唱二氨基联苯胺盐酸盐＋０．０３％Ｈ２Ｏ２显色５～１０ｍｉｎ。

流水洗，苏木素衬染，盐酸酒精分化、蓝化。

递增梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规树脂封片。

显微镜下观察有棕黄色染色者为阳性对照，用ＴＢＳ代替一抗做阴性对照。

１．５．４　免疫组织化学阳性着色的定量分析　染色结果应用ＩｍａｇｅＰｒｏＰｌｕｓ４．１版计算机图像分析系统在４０倍显微镜下计算阳性细胞面积，Ｂｃｌ唱２、Ｂａｘ阳性细胞率（％）为阳性细胞面积总和与参考面积的比值，求出１０个视野的均数和标准差。