《干细胞基础知识》PPT课件

*用RA（维甲酸）作诱导90％以上的ES细胞分 化为神经胶质细胞， *聚集培养的ES细胞诱导分化则可分化为有节律 性收缩的心肌细胞。 *将ES细胞注射到同源动物皮下，可形成组织瘤， 其细胞组成可代表3个胚层细胞。 *用ES细胞作核供体进行细胞核移植，可以得到 可发育重构胚和动物个体。
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碱性磷酸酶的表达
ES细胞形态结构及核型
(1) 各种动物的ES细胞具有与早期胚胎细胞相似 的形态结构，胞体体积小，核大，有一个或几个核 仁。
(2) ES细胞与卵圆柱期（egg cylinder stage） 胚胎外胚层和胎儿生殖脊的原始生殖细胞类似。 (3) 细胞中多为常染色质，胞质结构简单，散布着 大量核糖体和线粒体，核型正常，保留了整倍体性 质。正常ES细胞染色体正常，如发生异常则其很难 发育分化形成动物个体。
照无色。小鼠3．5日龄胚胎ICM为强阳性。
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SSEA-I 免疫荧光标记
第1抗体，SSEA－1（鼠抗ES细胞单克隆抗体），1:100稀释； 第2抗体，羊抗鼠 1：10稀释;封闭液，羊抗兔lgG。
步骤①杜氏PBS洗3次,2％Triton作用20 min； ②再以杜氏PBS洗3次,封闭液中置20min； ③以杜氏PBS洗3次，加第1抗体于4℃过液； ④以杜氏PBS洗3次，加第2抗体于30℃温箱置30min； ⑤再以杜氏PBS洗3次后用甘油PBS封片。
早期胚胎细胞表面均表达胚胎阶段特异性表面抗原（SSEA －1）。在胚胎的原始外胚层细胞、ES细胞、EC细胞和原始生 殖细胞的表面均可检测到SSEA－1的表达。小鼠SSEA－1的表 达自8细胞期开始，直到原始外胚层形成期。早期囊胚ICM细 胞全部呈强阳性，晚期囊胚中部分ICM呈强阳性，部分呈弱阳 性，少部分为阴性。因此，SSEA也常作为ES细胞鉴定的一个 标志。
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ES细胞的高度分化潜能
ES细胞的全能性是其区别于成纤维细胞等 体细胞的显著特点 (1) ES细胞在体外需在饲养层细胞上培养才 能维持其未分化状态，一旦脱离饲养层就自 发地进行分化。 (2) 在单层培养时细胞自发分化成多种细胞， 悬浮培养中： “简单类胚体” “囊状胚 体” 细胞分化物。
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(3) ES细胞可进行诱导分化
干细胞研究及其应用
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2000年十月发生在美国 Colorado的一个故事
In early October,
a Colorado couple
has a
baby named Adam,
whose umbilical
cord
stem cells could
cure his six-year-
old sister
许多资料表明，小鼠、大鼠的桑椹胚细胞和 囊胚细胞均有碱性磷酸酶（AKP）表达，小鼠的EC 细胞和ES细胞中均含有丰富的AKP。而在已分化的 EC细胞和ES细胞中AKP呈弱阳性或阴性。猪、兔的 桑椹胚和早期囊胚AKP呈阳性。因此，AKP常用来作 为鉴定EC细胞或ES细胞分化与否的标志之一。
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胚胎阶段特异性细胞表面抗原的表达
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One cell is removed from an eight-cell embryo in preparation
for preimplantation genetic diagnosis.
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Two separated blastomeres subjected to FISH analysis to check the chromosomes
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Pluripotent stem cells可分化成为特定组织的干细胞， 如血液干细胞（heamatopoitent stem cells）、神经干细 胞（neural stem cells）、皮肤干细胞（skinstemcells） 等等。这些特定之干细胞仅能发育成为特定组织之分化细 胞（end-differentiation cell terminal cells），例如 血液干细胞除可不断分裂成为相同之血液干细胞外，亦可 接受不同刺激分化成为骨髓细胞和淋巴细胞；骨髓细胞则 可进一步分化成为红血球、血小板、嗜中性粒细胞等。
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1. ES细胞的全能性主要体现在以下几方面：
①形成畸胎瘤。将ES细胞注入同源动物皮下可形成畸胎瘤，包括三个胚 层细胞；
②形成类胚体。培养ES细胞在非粘附底物中悬浮生长，或控制增殖细胞 数目。能够使之生成类胚体，它是一个与畸胎瘤相似的多种系混杂的集合体、 具有三个胚层组织；
③直系分化。通过控制ES细胞生长环境，或遗传操纵特定基因表达，ES 细胞可直接分化成某特定种系细胞，例如将神经决定基因NeuroD2和NeuroD3 转人ES细胞，可使之分化为神经细胞；
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专能干细胞（ multipotent stem cell ），这 类干细胞只能向 一种类型或密切相关的两种 类型的细胞分化，如上皮组织、基底层干细胞、 肌肉中的成肌细胞等。
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根据来源来分: 来源于胚胎--- 胚胎干细胞 ESC （Embryonic Stem Cell ） 胚胎性生殖细胞 EGC （Embryonic Germ Cell ） 来源于成体--- 成体组织来源的干细胞 ASC （Adult-derived Stem Cell ）
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二、干细胞的分类
按分化潜能大小来分类:
➢全能干细胞（ Totipotent stem cell ）： 它具有形成完
整个 体的分化潜能。如受精卵，胚胎干细胞。 在生物发育学里，当精子和卵子结合成为受精卵后，
一个受精卵分裂成为二个完全相同的细胞，二个细胞分裂成 为四个细胞、八个细胞，在此时期此八个细胞中任何一个细 胞单独放入成熟女性子宫中均可发育成为单独且完整之个体， 此种细胞即称为totipotent stem cells。
样本在激光共聚焦图像系统下观察, 结果依细胞是否出现 荧光作出判断。
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分化能力检测
体外分化试验 体内分化试验 嵌合体形成
核移植
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4.胚胎干细胞的制备
(1) 直接由动物体内获取囊胚再分离ICM的方法，这 样得到的囊胚数量少，质量也可能不高，由此会影响 分离ES细胞的效率。
(2) 卵细胞去核培养、转入体细胞核，体外培养，获 得高质量的去透明带囊胚，由此囊胚进一步分离得到 胚胎干细胞。
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一、干细胞的概念
胞。
干细胞是一类具有自我更新和分化潜能的细
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干细胞研究成为继人类基因组大规模测序之后最具活 力、最有影响和最有应用前景的生命学科研究领域，1999年 干细胞研究被美国《科学》杂志评为1999年度世界十大科学 之冠，2000年干细胞研究再次被《科学》杂志评为该年度世 界十大科学成就之一。
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3. ES细胞的鉴定
-- 细胞的形态结构 -- 核型分析 -- 碱性磷酸酶（AKP）染色 -- SSEA-I 免疫荧光标记 -- 分化能力检测 体外分化试验
体内分化试验 嵌合体形成试验 核移植试验
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ES细胞形态学鉴定
依ES细胞的形态结构（胞体体 积小，核大、有一个或几个核仁） 和生长特性（呈克隆状生长，细胞 紧密聚集，形似鸟巢，界限不清） 对ES细胞进行初步鉴定。
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事实上，所谓同卵双胞胎、三胞胎、四胞胎，即 为受精卵分裂成二个或四个totipotent stem cells 后， 每个细胞单独分开发育，故成为双胞胎或四胞胎，至于 三胞胎则为四个totipotent stem cells中的一个在发育 过程中不幸未能成熟之故。Totipotent stem cells时期 大约仅维持四天，即进入下一阶段之发育，形成特殊分 化细胞，称为原始胚囊体（blastocyst）。
组织工程是以干细胞研究为基础发展起来，它有望 解决临床上急需的人工组织与器官问题，进展极为迅速，已 经成为干细胞应用的主要方向。
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干细胞有几个主要特征
➢干细胞本身不是终末分化细胞； ➢干细胞能无限增殖分裂； ➢干细胞可连续分裂几代，也可在较长时间内处于静止
状态；
➢干细胞分裂产生的子细胞只能有两种命运——保持为
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根据干细胞组织发生的名称进行分类:
➢胎胎干细胞 ➢造血干细胞 ➢骨髓间质干细胞 ➢肌肉干细胞 ➢成骨干细胞 ➢内胚层干细胞 ➢视网膜干细胞 ➢胰腺干细胞
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三、胚胎干细胞
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1998年美国有两个小组分别培养出了人多能 ( pluripotent )干细胞：
James A. Thomson在 Wisconsin大学领导一个研究小组从 人胚胎组织中培养出了干细胞株。他们使用的方法是：人卵 体外受精后，将胚胎培育到囊胚阶段，提取 inner cell mass细胞，建立细胞株。经测试这些细胞株的细胞表面 marker 和酶活性，证实它们就是胚胎干细胞。用这种方法， 每个胚胎可取得15－20个细胞用于培养。 John D. Gearhart在 Johns Hopkins大学领导另一个研究 小组也从人胚胎组织中建立了干细胞株。他们的方法是：从 受精后5－9周人工流产的胚胎中提取生殖母细胞 ( primordial germ cell )。由此培养的细胞株，证实具有 多能干细胞的特征。
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核型分析
ES细胞具有正常二倍体核型， 可用核型分析进行检验
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碱性磷酸酶（AKP）染色
*常用快绿（Fast Green Staining)染色法， *对照以已建系ES细胞（或小鼠的桑椹胚
或囊胚）作为阳性对照， *作用液中不含α-萘酚磷酸钠为阴性对照。 *结果判定阳性对照ES细胞染成棕色，阴性对
干细胞 或分化为特定细胞。
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1981年Evans和Kaufrnan及Martin首次由小鼠中分 离得到鼠的胚胎干细胞。
至今已分离得到的胚胎干细胞物种有： 金黄地鼠（1988）、貂（1993）、猪（1994，1997）、鸡 （1996）、恒河猴（1995）、绒猴（1996）。