蛋白质和酶的分离与纯化
酶工程与蛋白质工程
酶工程与蛋白质工程酶工程与蛋白质工程是现代生物技术的重要领域，它们以分子水平为基础，通过基因工程技术来改造酶和蛋白质。
酶工程主要研究酶的结构与功能关系以及酶催化反应机理，以此来优化酶的性质和功能；而蛋白质工程则致力于蛋白质的高表达、纯化和改造，进而实现分子水平的控制和利用。
两者交叉融合，共同应用于工业、医药、环保和食品等各个领域，促进了生物技术的发展和推广。
一、酶工程简介酶是一种生物催化剂，具有极高的选择性和催化效率。
酶工程旨在通过对酶的分子结构和催化机理的研究，优化酶的性质和功能，使其在特定条件下能够更高效地催化反应。
比如，通过改变酶的氨基酸序列，可以实现酶催化活性和稳定性的提高。
再比如，通过引入新的催化中心或变异剂，可以改变酶的底物特异性和反应特性。
这些优化方法可以显著提高酶的效率和选择性，为实现工业生产和科学研究提供了有效手段。
酶工程的具体步骤如下：1. 酶的筛选和分离。
这个步骤是酶工程的基础，通常需要从自然界中分离出能够催化特定反应的酶。
现代酶工程技术一般采用高通量筛选法，通过分子筛、高速离心、色谱法等方法来分离出酶的纯品。
2. 酶的分子结构分析。
这个步骤是为了了解酶的分子结构和功能关系，找到优化方案的基础。
目前，常用的酶的分析方法有X射线晶体学和核磁共振法。
3. 酶的基因工程改造。
通过基因工程技术，改变酶的氨基酸序列和三维结构，使其获得更高的活性和稳定性。
常用的方法有扩展、交换和修饰等方法。
4. 酶的活性和特性检测。
通过活性酶测定、底物特异性、pH和温度对酶催化反应的影响等方法来检测酶的改造效果。
5. 酶的产量提高。
通过使用表达载体、调节生产菌株的生长条件等方法，使酶的产量达到最高。
二、蛋白质工程简介蛋白质工程是将目标蛋白基因从生物体内放大、纯化、定位和表达，以达到高效率和高纯度的目的。
主要应用于药物研发、工业化生产、分子诊断和分子工业等领域，对于制造可溶性蛋白、表达蛋白、纯化蛋白和修饰蛋白等方面都发挥着重要作用。
蛋白质的理化性质及其分离纯化
第三节蛋白质的理化性质及其分离纯化一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性电离（二）蛋白质的胶体性质（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（四）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的呈色反应（一）蛋白质的两性电离蛋白质是由氨基酸构成的，其两端及侧链都含有可解离的酸性基团或碱性基团，因此在不同pH的介质中，蛋白质的带电状态就不同。
PrNH3+COOHPrNH3+COO-PrNH2COO-O H-H +O H-H +兼性离子pH=pI阳离子pH<pI 阴离子pH>pI蛋白质的等电点（pI）•概念：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。
•pI是蛋白质的特征性常数。
•利用蛋白质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。
•pH >pI 带负电荷•pH <pI 带正电荷•体内多数蛋白pI为5.0左右，pH为7.45 时多数蛋白带负电荷。
•如pI 偏于碱性－碱性蛋白质鱼精蛋白组蛋白•如pI 偏于酸性－酸性蛋白质胃蛋白酶丝蛋白（二）蛋白质的胶体性质•颗粒大小：在1～100nm之间。
属胶体。
因此溶于水，成为亲水胶体。
•稳定亲水胶体的因素：水化膜表面电荷不通透性：半透膜毛细血管壁------------++++++++++++------------（三)蛋白质的变性、沉淀和凝固1.变性（denaturation）•概念: 在某些理化因素作用下，蛋白质分子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。
•变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。
天然状态，有催化活性非折叠状态，无活性，二硫键被还原天然状态，二硫键恢复，而且正确配对尿素或2-巯基乙醇去除变性因素核糖核酸酶•变性因素：物理因素：加热、加压、超声波、紫外线化学因素：胍、脲、有机溶剂、强酸强碱、SDS-巯基乙醇、重金属离子生物碱试剂•蛋白质变性后的理化和生物学性质改变：溶解度↓生物活性丧失及易被蛋白酶水解粘度↑结晶能力消失、•应用：消毒灭菌低温保存生物制剂•复性(renaturation)：蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性。
阴离子交换整体柱对蛋白质的分离与纯化
阴离子交换整体柱对蛋白质的分离与纯化蛋白质是有机体中微小细胞结构的重要组成部分，它有着复杂的结构，而且受到它们的生物活动和环境因素的影响。
要正确完成蛋白质的分析和研究，就必须完成其分离与纯化。
阴离子交换整体柱被认为是最有效的蛋白质分离与纯化方法之一。
阴离子交换整体柱是一种常用的分离和分离技术，它利用阴离子交换剂作为分离活性体，以微量化合物的阴离子立体结构形式将其结合成细胞外阴离子质粒，这样就可以根据它们的电荷来实现蛋白质的分离与纯化。
阴离子交换整体柱可以用来分离和纯化多种蛋白质。
首先，蛋白质可以根据它们不同的电荷类型分离。
其次，它可以用来分离多种相似的蛋白质，特别是具有相似分子量和电荷的蛋白质，因为它可以从样品中分离出非常纯的单一蛋白质。
最后，阴离子交换整体柱可以用来分离具有复杂结构的蛋白质，如多糖蛋白和蛋白激酶，这样就可以分析它们的活性。
在实际应用中，利用阴离子交换整体柱进行蛋白质分离与纯化的实验流程主要包括以下几个步骤：首先，样品分散；其次，加入膜；然后，利用阴离子交换剂对膜上的样品进行阴离子交换；最后，洗涤、重组。
阴离子交换整体柱技术在蛋白质分离与纯化领域具有重要的应用价值，它不仅可以有效地分离蛋白质，而且可以将某种蛋白质从复杂的样本中分离出来，最终得到高质量和高纯度的蛋白质，这是完成对蛋白质进行分析和研究的关键。
但是，阴离子交换整体柱技术也有一些缺点。
由于部分样品或细胞因素的影响，可能会影响整体柱的结构，使分离的结果受到一定的影响。
同时，某些蛋白质的分离可能会受到抗原的影响，这也是一个不利的因素。
此外，不同的蛋白质对阴离子交换剂的反应也是不同的，这样也可能影响蛋白质的分离结果。
因此，要有效地完成蛋白质分离与纯化，阴离子交换整体柱技术具有重要的应用价值。
但是，在实际应用中，还必须考虑到技术的局限性，并采取相应的措施来解决问题，以确保获得最佳的分离结果。
总之，阴离子交换整体柱技术已成为一种重要的蛋白质分离与纯化方法，其应用价值已获得许多研究者的高度重视，它不仅可以用来分离不同类型的蛋白质，而且可以将具有复杂结构的蛋白质分离出来，最终以高纯度的蛋白质来完成对蛋白质的分析和研究。
酶的分离纯化方法介绍
酶的分离纯化方法介绍酶的分离纯化一般包括三个基本步骤：即抽提、纯化、结晶或制剂。
首先将所需的酶从原料中引入溶液，此时不可避免地夹带着一些杂质，然后再将此酶从溶液中选择性地分离出来，或者从此溶液中选择性地除去杂质，然后制成纯化的酶。
关键词：酶抽提纯化结晶制剂细胞破碎cell disruption 盐析亲和沉淀有机溶剂沉淀生物细胞产生的酶有两类：一类由细胞内产生后分泌到细胞外进行作用的酶，称为细胞外酶。
这类酶大都是水解酶，如酶法生产葡萄糖所用的两种淀粉酶，就是由枯草杆菌和根酶发酵过程中分泌的。
这类酶一般含量较高，容易得到；另一类酶在细胞内产生后并不分泌到细胞外，而在细胞内起催化作用，称为细胞内酶，如柠檬酸、肌苷酸、味精的发酵生产所进行的一系列化学反应，就是在多种酶催化下在细胞内进行的，在类酶在细胞内往往与细胞结构结合，有一定的分布区域，催化的反应具有一定的顺序性，使许多反应能有条不紊地进行。
酶的来源多为生物细胞。
生物细胞内产生的总的酶量虽然是很高的，但每一种酶的含量却很低，如胰脏中期消化作用的水解酶种类很多，但各种酶的含量却差别很大。
因此，在提取某一种酶时，首先应当根据需要，选择含此酶最丰富的材料，如胰脏是提取胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、淀粉酶和脂酶的好材料。
由于从动物内脏或植物果实中提取酶制剂受到原料的限制，如不能综合利用，成本又很大。
目前工业上大多采用培养微生物的方法来获得大量的酶制剂。
从微生物中来生产酶制剂的优点有很多，既不受气候地理条件限制，而且动植物体内酶大都可以在微生物中找到，微生物繁殖快，产酶量又丰富，还可以通过选育菌种来提高产量，用廉价原料可以大量生产。
由于在生物组织中，除了我们所需要的某一种酶之外，往往还有许多其它酶和一般蛋白质以及其他杂质，因此为制取某酶制剂时，必须经过分纯化的手续。
酶是具有催化活性的蛋白质，蛋白质很容易变性，所以在酶的提纯过程中应避免用强酸强碱，保持在较低的温度下操作。
微生物发酵的产物分离与纯化
微生物发酵的产物分离与纯化在微生物发酵领域，获得高纯度和高质量的产物是至关重要的目标。
而实现这一目标的关键步骤之一，便是对发酵产物进行有效的分离与纯化。
这一过程不仅决定了最终产品的质量和产量，还直接影响着生产的成本和效率。
微生物发酵所产生的产物多种多样，包括但不限于各种有机酸、氨基酸、抗生素、酶、蛋白质等。
这些产物在发酵液中的浓度通常较低，且往往与大量的杂质混合在一起。
因此，要将所需的产物从复杂的发酵体系中分离出来并纯化至符合要求的纯度，需要采用一系列精心设计的技术和方法。
首先，我们来谈谈过滤和离心这两种常见的初步分离手段。
过滤是利用过滤介质，如滤纸、滤膜等，将发酵液中的固体颗粒和较大的杂质去除。
而离心则是通过离心机产生的离心力，使固体颗粒或细胞等较重的成分沉淀到底部，从而实现固液分离。
这两种方法能够在一定程度上减少发酵液中的杂质含量，为后续的分离纯化步骤减轻负担。
在初步分离之后，萃取技术常常被应用于进一步提取目标产物。
萃取的原理是基于目标产物在不同溶剂中的溶解度差异。
例如，对于一些亲脂性的产物，可以使用有机溶剂从水相发酵液中将其萃取出来。
而对于某些水溶性较好的产物，则可能需要采用反胶束萃取等特殊的萃取方法。
接着，我们来看一看沉淀法。
通过改变发酵液的物理化学条件，如pH 值、温度、添加盐类等，可以使目标产物沉淀出来。
例如，在蛋白质的分离纯化中，常常通过调节 pH 值使蛋白质达到等电点，从而引发沉淀。
沉淀法操作相对简单，但可能会导致部分产物的活性损失，因此需要谨慎控制条件。
膜分离技术也是近年来发展迅速的一种分离方法。
包括微滤、超滤、纳滤和反渗透等。
这些技术利用具有特定孔径的膜，根据分子大小、形状和电荷等特性对发酵液进行分离。
膜分离具有操作方便、节能高效等优点，但膜容易受到污染和堵塞，需要定期清洗和维护。
色谱分离技术在微生物发酵产物的纯化中占据着重要地位。
例如，凝胶过滤色谱根据分子大小进行分离，离子交换色谱基于分子的电荷差异，亲和色谱则利用目标产物与配体之间的特异性亲和力。
酶的分离纯化及活性测定
第五节酶的分离、纯化及活性测定1一、酶的分离、纯化•:一类由细胞内产生然后分泌到细胞外进行作用胞外酶生然后分到行作的酶，这类酶大多都是水解酶类。
•胞内酶:另一类酶在细胞内合成后在细胞内起催化作用的，这类酶数量较多。
的多2一般原则：般原则：防止强酸、强碱, 要求加入的化学试剂不使酶变性；在低温下操作，全部操作在低温0～4℃；在分离提纯过程中避免剧烈搅拌 在分离提纯过程中，避免剧烈搅拌；在提纯溶剂中加一些保护剂如少量EDTA 在提纯溶剂中加一些保护剂，如少量EDTA、少量β-巯基乙醇；在不破坏所需酶的条件下，可使用各种“激烈的烈”的手段。
3酶的分离提纯三个基本环节：第一抽提，即把酶从材料转入溶剂中制成酶溶液；第二纯化，即把杂质从酶溶液中除掉或从酶溶液中把酶分离出来；第三制剂，即将酶制成各种剂型。
在酶的分离纯化过程中．每步都须做三件事：第一第，测定酶活力(IU/ml)；第二，测定蛋白质含量(mg/ml)；第三，测量体积(ml)。
4基本操作程序微生物、动物、选材植物加入提取液抽提胞内酶先破碎抽提先净化处理再沉淀法分离离子交析分离纯化换层析，凝胶过滤，液相色谱，亲和色谱和超滤等5（一）酶的抽提（）酶的抽提1、破碎细胞对于细胞外酶可用水缓冲液浸泡过对于细胞外酶可用水、缓冲液浸泡过滤后，可得粗抽提液。
对于细胞内酶要破碎细胞、动物细胞较易破碎，通常用匀浆器捣碎机，制成较易破碎，通常用匀浆器、捣碎机，制成匀浆离心后可得酶抽提液。
细菌细胞壁较厚，需用超声波、溶胞壁较声溶菌酶等抽提。
酶等提62、酶的抽提酶的抽提一般的酶可用稀酸或稀碱的水溶液抽提出来。
抽提条件：提出来抽提条件⑴抽提溶的pH选择应该在酶的pH稳定，并离范围之内，并且最好远离等电点。
低温下抽提⑵低温下抽提（0～40C）7（二）酶的纯化（）酶的纯化抽提液中除含有所需有酶外，还含有其它大抽提液中除含有所需有酶外还含有其它大分子物质。
常用分离纯化的方法：①溶解度②电荷性质③大小或质量④亲和部位。
【生物化学】第八章 蛋白质的分离纯化
㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒 的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网 状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自 由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有 机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配， 使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性 测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显 色用茚三酮显色时，得到 一个滤纸层析谱。 定义：原点到氨基酸停 留点的距离与原点至溶剂 前沿之比称为Rf值。 只要把溶剂系统、温度、 滤纸型号等条件确定，则 每一种氨基酸的Rf值是一 个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离 心机 主要技术指标： 检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？ 三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的 结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活 性部位。 在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条 件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也 可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。 胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相
蛋白质的表达和纯化技术
蛋白质的表达和纯化技术概述蛋白质是生命体内最基本的组成部分之一，它们扮演着各种不同的角色，如催化酶、参与信号转导等。
了解蛋白质的结构和功能，能够帮助科学家研究生命过程和疾病发生的机制。
因此，蛋白质表达和纯化技术是现代生物学研究中的重要环节。
蛋白质表达技术蛋白质表达技术是指将目标蛋白质基因导入到宿主细胞中，使其能够在细胞内大量表达目标蛋白质的过程。
根据目标蛋白质的性质和功能需求，可以选择不同的表达系统，如大肠杆菌、酵母、哺乳动物细胞等。
大肠杆菌是最常用的表达系统之一。
其具有成本低、表达量高等优点，同时易于培养和操作。
但是，大肠杆菌的表达系统在表达复杂蛋白质时存在很多问题，如蛋白毒性、折叠错误等。
因此，针对不同类型的目标蛋白质，需要选择不同的表达系统，并优化其表达条件。
蛋白质纯化技术蛋白质纯化技术是指从混合物中纯化目标蛋白质的过程，包括初级纯化、中级纯化和高级纯化等步骤。
初级纯化包括离心、过滤和电泳等方法，主要是为了去除大分子和杂质。
中级纯化主要使用柱层析和凝胶电泳等技术，分离目标蛋白质和杂质。
最后，高级纯化主要通过高效液相色谱（HPLC）等手段，获得高纯度的目标蛋白质。
在进行蛋白质纯化时，需要考虑目标蛋白质的性质，如分子量、电荷性、亲和力等。
根据这些属性，可以选择合适的纯化方法，并进行优化。
同时，需要注意纯化过程的选择和条件设置，以确保目标蛋白质的活性和稳定性。
结论蛋白质表达和纯化技术对于生物学研究和生物制药等领域具有重要的意义。
在不同的研究领域中，选择合适的表达和纯化技术是确保研究成功的关键之一。
因此，对蛋白质表达和纯化技术的理解和掌握，有助于推动生物科技的发展。
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-- -- 蛋白质和酶的分离纯化及鉴定
蛋白质是生命体中的重要物质基础之一。从分子水平上认识生命现象，已成为现代生物学发展的主要方向。要研究蛋白质,首先要得到高度纯化的目的蛋白。蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有上千种不同的蛋白质。要想从成千上万种蛋白质混合物中纯化出目的蛋白,就要根据蛋白质的理化性质不同设计出合理的分离方法。 目前研究为止酶除核酶外本质都是蛋白质，因此酶的分离纯化方法基本是采用蛋白质的分离纯化方法,但是酶的活性受到多种因素的影响,因此酶的分离纯化比一般的蛋白质要求更高。
一、质分离纯化的一般原则 １. 原料的选择 原则：来源方便，成本低，易操作、安全的原料。 蛋白分布:体液、组织、细胞定位 ２. 破碎方法： （1) 机械方法:通过机械运动产生的剪切力的作用,使细胞或组织破碎的方法。 如：捣碎法、研磨、匀桨法 (2） 物理方法：通过温度、压力、声波等各种物理因素的作用，使组织细胞破碎的方法。 如:反复冻融、渗透压、超声破碎 (3） 化学方法:通过各种化学试剂对细胞膜的作用，使细胞破碎的方法. 如:甲苯、丙酮、氯仿和非离子型的表面活性剂（Triton和Ｔween） （４） 酶促法：溶菌酶、蜗牛酶等 3. 目的蛋白或酶的特异、快速、精确的定性或定量方法 ４. 先粗后细，分级分离 粗分：将得到的蛋白溶液先利用简单、快速、易处理的方法除去大部分杂蛋白。如: 盐析、离心、有机溶剂沉淀等。 精制:利用蛋白质性质的差异,采用不同的方法,如：离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶等方法进一步纯化。 5. 避免蛋白质的变性(ｐH、适合的温度和缓冲体系等)
二、常用的蛋白质的分离纯化技术 可以根据各种蛋白质的结构、理化性质不同设计分离方法。 (一）根据蛋白质的溶解度不同进行分离 -- -- １. 蛋白质盐析 蛋白质属于生物大分子之一，分子量从１万至100万之巨，其分子的直径可达1-100nm，为胶粒范围之内。蛋白质的表面电荷和水化膜是其主要的稳定性因素。 大多数蛋白质都溶于水，在低盐条件下，蛋白的溶解度随着盐浓度的升高而增加,这称为蛋白质的盐溶现象，而盐浓度达到一定以后，蛋白质水化膜被破坏，电荷被中和，蛋白质的溶解度会随着盐浓度的升高而降低，并且析出,这就是盐析现象。 由于各种蛋白质分子的颗粒大小和亲水程度不同，故盐析所需的盐浓度也不一样。调节盐的浓度可使不同的蛋白质沉淀从而达到分离的目的。 常用的中性盐:硫酸铵、醋酸钠、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等。 其中最常用的是硫酸铵,它的优点是温度系数小，溶解度高(25℃时的饱和度为4．1moｌ/L,即767g/L；0℃时的饱和度为３．9mｏl/L,即676g/Ｌ)；在这一溶解度范围内，许多蛋白都可以盐析出来;另外,硫酸铵不容易引起蛋白质变性;不同浓度硫酸铵ｐH在4.5-5.5之间，可以结合等电点进行分离纯化，沉淀效果更好。 影响盐析的因素:①温度：②pＨ：③蛋白质浓度: 盐析的缺点是蛋白质沉淀后要除盐,否则会影响后续的电泳或离子交换等相关实验。 2. 等电点沉淀法 蛋白质在等电点时，也就是静电荷为零时,蛋白质颗粒之间的静电排斥力减小,蛋白的溶解度下降,容易发生沉淀,因此，可以调节溶液的ｐH,使其达到目的蛋白的等电点，使之沉淀而分离。但是,此方法很少单独应用,一般与盐析法或后述的有机溶剂沉淀法联合应用效果更好。 3. 有机溶剂沉淀法 有机溶剂可使溶液的介电常数降低，蛋白之间的静电引力增大,互相吸引而易于集聚；也可使水化膜破坏，蛋白的溶解度降低。 优点:易于进一步的分离,不用脱盐 缺点：易引起蛋白的变性，所以沉淀后要尽快的分离 常用的有机溶剂:乙醇、丙酮、异丙醇、甲醇等。
(二）根据蛋白质分子大小进行分离 1. 透析与超滤 透析就是利用透析膜将分子大小不同的蛋白质分开。超滤是利用压力和离心力，促使大小不等的分子通过滤过膜,两者都是根据化合物的分子量进行分离的一种方法，可选择不同孔径的滤膜截留不同分子量的蛋白质。 2.凝胶过滤法 是以各种多孔凝胶为固定相，对不同分子量的组分进行分离的一种层析方法。也叫凝胶-- -- 过滤，分子排阻层析,分子筛层析等。 常用的凝胶材料: ① 葡聚糖凝胶（Sepｈadｅｘ):是由葡聚糖交联而成，具有良好的化学稳定性,耐高温(＞１２0℃), 型号多，可用于各种物质的分离和纯化。 ② 琼脂糖凝胶(Sepharｏse）：是一种天然多孔凝胶,孔径大,适用于大分子量分子的分离。 ③ 聚丙烯酰胺凝胶:是人工合成的凝胶,交联度不同，孔径不同,可用于各种蛋白的分离。缺点是强酸会使凝胶的酰胺键破坏。
（三）根据蛋白质带电性质进行分离 1. 电泳法 各种蛋白质在同一pＨ条件下,因为分子量和电荷数量不同而在电场中的迁移率不同而彼此分离。 2. 离子交换层析法 是利用离子交换剂上可解离基团对各种离子的的亲和力不同而达到分离目的的一种层析分离方法。 离子交换剂：是含有可解离的阳离子或阴离子基团不溶性高分子化合物,这些基团能与溶液中的其它阳离子或阴离子进行可逆的交换。 按活性基团性质不同：阳离子交换剂 阴离子交换剂 按母体物质种类不同：离子交换树脂:小分子量蛋白质分离 离子交换凝胶：各种分子量蛋白质分离 离子交换纤维素：各种分子量蛋白质分离 ① 阳离子交换 阳离子交换剂中含有酸性基团，能解离出氢离子，与样品溶液中的阳离子进行交换。 强酸型阳离子交换剂:磺酸（R－SO3－Ｈ） 弱酸型阳离子交换剂:磷酸（R－HＰO3-H） 羧酸(R-COＯ-H） 酚羟基（R-O-H)
② 阴离子交换 阴离子交换剂中含有的碱性基团，能释放出阴离子,与样品溶液中的阴离子进行交换。 强碱型阴离子交换剂：季胺 ［R－N+(ＣH3)3-OH-]
R-SO-3-H++Na+R-SO-3-Na ++H+
---
H+
H+
H+基架活性基团--
-- 弱碱型阴离子交换剂：伯胺 (R-N+HH2-ＯH-) 仲胺 （R-N+HCH3H-ＯＨ-) 叔胺 ［R－Ｎ+ (CH3）２H-OＨ-]
(四）根据蛋白质特异性进行分离-亲和层析 亲和层析是利用生物分子与配体之间具有的专一而又可逆的亲和力,是生物分子分离纯化的技术。 固定相:上述提到的凝胶或树脂结合上配体。 优点:选择性好，纯化步骤简单,一次就可达到很高的纯化倍数。 缺点:价格昂贵,处理量少，不适合大规模应用,洗脱剂要求高,无通用性。
总之，根据拟分离的蛋白质的理化性质、防止变性以及样品情况和实验条件选择最佳方法。有时往往不止用一种方法进行分离纯化，而是选择几种适当的方法进行分离,力求达到纯化和高产的目的。
+++
OH-OH-
OH-基架活性基团
R-N+(CH3)3-OH-+Cl-R-N+(CH3)3-Cl-+OH---
-- 实验一 -球蛋白的分离纯化 一、实验目的 掌握蛋白质分离纯化的基本方法和步骤。
二、原理 γ-球蛋白是一组结构相似但又有差异的蛋白质，统称为免疫球蛋白(immunoglobin， Iｇ)。 按其结构和免疫化学性质的差异分为五类。分别为IgG,ＩgA,IgM,IgＤ，ＩgE，其中IgG占70%。 血清中有70余种蛋白质，本实验的目的是要从70余种血清蛋白中分离出γ－球蛋白。 1. 粗分,采用饱和硫酸铵盐析法,如果蛋白质溶液体积大，要求达到的硫酸铵饱和度在50%以上时,可在蛋白质混合溶液中直接加入硫酸铵试剂如果蛋白质溶液体积小，要求达到的硫酸铵饱和度在５0％以下时,可采用饱和硫酸铵溶液法，饱和硫酸铵溶液的加入量按下式计算： V=Ｖ0（C2－Ｃ１）／(１00-Ｃ2） 或者是V=V０(C２-C１）/（１－Ｃ2) V： 应加入饱和硫酸铵溶液的体积; V0：蛋白质溶液的原始体积； C１:原溶液的硫酸铵饱和度; C2：要达到的硫酸铵饱和度。 硫酸铵盐析法可使蛋白质纯度提高5倍，而且可以除去核酸等杂质。 ２. 除盐：采用透析法使硫酸铵除去。 3. 精制:采用阴离子交换层析法 利用阴离子交换纤维素层析其优点是:具有开放性支持骨架,大分子可以自由进入和迅速扩散，吸附量大;具有亲水性,用温和的条件可以洗脱，不易引起蛋白质的变性或酶的失活;具有多孔性，表面积大,交换容量大,回收率高，可用于分离和制备。 4. 纯度鉴定：采用醋酸纤维素薄膜电泳。
三、试剂和器材 １．试剂 ① 正常血清（人、兔、狗） ② 饱和硫酸铵溶液 ③ 0．0１75moｌ/L磷酸缓冲液１.0ml（pH6.３) ④ DEAE-纤维素 -- -- ⑤ 纳氏试剂：碘化汞和碘化钾的碱性溶液，与氨氮反应生成淡红棕色的化合物（410-425ｎm）。 ⑥ 20％磺柳酸试剂 2． 器材 ① 层析柱及支架 ② 白色和黑色比色板 ③ 透析袋及细线 ④ 烧杯2个、试管２０支 ⑤ 吸管1个
四、操作步骤 1. 取少许血清作为A样。 2. 盐析:取2ml血清加2ml生理盐水于离心管中,混匀后缓慢滴加饱和硫酸铵溶液4ml,边加边混,室温放置10mｉn，3０00 rpm，离心1０ｍin，小心除去上清，沉淀加0.0175mol/L磷酸缓冲液１.0ml(ｐH6.3)复溶。 3. 透析除盐：用细线扎住透析袋一端,将溶解的-球蛋白溶液倒入透析袋内,用线扎紧透析袋另一端，放入一大烧杯中,加入蒸馏水进行透析，每隔１０min用纳氏试剂在白板上检测烧杯中的NH4+,并更换蒸馏水直至检测不到NH4+为止，留取透析袋内液体2滴,作为B样。 4. DＥAE-纤维素离子交换层析： ① 装柱：取层析柱加入蒸馏水,观察水流是否通畅,然后将层析柱垂直固定到支架上,关闭下端出口，将处理再生后的DEAE-纤维素悬液搅拌均匀后缓慢倒入层析柱,使柱床高度达到10-1５cm。 ② 平衡：打开柱的下端出口,用3个柱床体积的０.０１75mｏl/L磷酸缓冲液（pH６.3）平衡后关闭柱的下端出口。 ③ 上样：将透析脱盐后的蛋白质溶液缓慢加到ＤＥAE-纤维素柱床上,开下端出口,使样品进入柱床。 ④ 洗脱：用0．0175ｍol/L磷酸缓冲液（pH6．3)洗脱蛋白，并且立即收集洗脱液，流速为10滴/ｍiｎ，每２min收集1管,按顺序排列。 ⑤ 洗脱液中蛋白质的检测:取黑色比色板或干净的试管一个,按洗脱管顺序分别取1滴于其中，然后加入２0%磺柳酸试剂1滴,出现白色浑浊或沉淀即为蛋白质析出,记录并估计各管的蛋白质浓度,取浓度最高的一管作为C样。
五、实验注意事项