《过柱纯化》PPT课件
过柱的实验方法和技巧
过柱的实验方法和技巧常说的过柱子应当叫柱层析分别，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
由于柱分的阅历成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，盼望能有所关心。
一：柱子可以分为：加压，常压，减压1.压力可以增加淋洗剂的流淌速度，削减产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如自然化合物的分别，一个柱子几个月也是有的。
2.减压柱能够削减硅胶的使用量，感觉能够节约一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝聚），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必需同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
3.加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的供应可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
特殊是在简单分解的样品的分别中适用。
压力不行过大，不然溶剂走的太快就会减低分别效果。
个人觉得加压柱在一般的有机化合物的分别中是比较适用的。
二：关于柱子的尺寸应当是粗长的最好。
柱子长了，相应的塔板数就高。
柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分别的难度。
试想假如柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分别的难度可想而知，唯恐要用很低极性的溶剂渐渐冲了。
而假如样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较简单得到完全分别了。
当然采纳粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说或许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分铺张）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，详细的选择要详细分析。
假如所需组分和杂质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用2cm20cm的柱子）；假如相差不到0.1，就要加大柱子，我觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂的极性等等。
有机物分离与纯化的方法柱层析的一些技巧48页PPT
56、书不仅是生活，而且是现在、过 去和未 来文化 生活的 源泉。 ——库 法耶夫 57、生命不可能有两次，但许多人连一 次也不 善于度 过。— —吕凯 特 58、问渠哪得清如许，为有源头活水来 。—— 朱熹 59、我的努力求学没有得到别的好处， 只不过 是愈来 愈发觉 自己的 无知。 ——笛 卡儿
拉
60、生活的道路一旦选定，就要勇敢地 走到底 ，决不 回头。 ——左
柱层析原理详解课件
吸附剂
氧化铝: 分为酸性(PH=4), 中性, 碱性(PH=10). 这种吸附剂特别适用于分离象羧
酸和氨基酸之类的酸性物质. 碱性氧化铝的PH约为10, 故适用于分离胺. 中性
氧化铝可用于分离各种非酸性和非碱性物质.
纤维素 淀粉 糖类 硅酸镁 硫酸钙 与极性化合物发生结合作用的能力递增次序 硅酸 硅胶 人造硅酸镁 氧化镁 氧化铝 活性炭（Norit)
B 干法
• 方法一: 用溶剂将柱子充满并让它缓缓流出入柱中. 此法也可得到装得很均匀的柱. 同上 法一样, 每次使用前应将溶剂反复循环通过几次.
• 方法二: 先将干的吸附剂装入柱中, 硅胶面压实顶部水平后将溶剂缓慢渗沥穿
过柱子, 直至柱子全被浸润. 但此法容易造成柱子不匀, 空气泡和缝隙, 尤其是
流动或称沟流.
造成这种现象的原因主要是吸附剂表面不平整或在填料中有任何不平整性或
气泡.
装柱
A 湿法(浆液法)
即吸附剂以浆液状态被装入管内. 浆液是一种溶剂和一种不溶解的固体的混 合物. 操作方法是将固体吸附剂慢慢加入盛有大量溶剂的容器中. 注意要严格 遵守这种加料次序(加吸附剂至溶剂), 因为吸附剂在加入到溶剂中时会因溶剂 化效应而放热. 若向吸附剂内加溶剂, 由於发热会使溶剂几乎与加入速率一样 快地气化逸出, 使最终的混合物不均匀或结块. 因此通常的做法是将吸附剂加 入溶剂中, 边加边旋摇, 使其形成一种稠厚但能流动的浆液. 浆液应不断旋摇直 至已呈均匀状态且相对地不再含有空气泡为宜.
2. 选定的溶剂极性
3. 相对于需待分离的物料量的柱子尺寸(长度和直径)
4. 洗脱(或流动) 的速率
A.吸附剂
• 吸附剂的选择通常要根据需待分离的化合物的类型而定. 主要有: 纤维素, 淀粉和糖类: 用于对酸碱相互作用非常敏感的多官能团的动, 植物性化 合物(天然产物) 硅酸镁: 分离乙酰化的糖类, 甾体化合物和香精油. 硅胶和合成硅酸镁载体(Florisil): 对大多数化合物来说相对地比较温和, 故可 广泛适用于种种官能团—烃, 醇, 酮, 酯, 羧酸, 偶氮化合物, 胺.
柱层析法-过柱
柱层析技术适用范围：1.样品量要适中（适用于g-公斤级），如果样品量只有几百克至一克，可以考虑使用制备TLC纯化（俗称爬大板），既可以得到良好的分离效果，又可以节省大量的纯化时间。
2.样品要有良好的溶解性，否则会导致化合物在硅胶上极难解析下来，从而导致硅胶柱堵塞。
3.样品在TLC板上产物与杂质点要有一定的分离度，而不是在一个点上，硅胶板的分离效果要高于柱层析，如果硅胶板都显示无法分开的话，尽量不要选择柱层析纯化，而可以考虑使用制备HPLC，SFC或其他分离方法。
操作过程：干法上样为例1.装硅胶：在减压抽滤的状态下，将硅胶加入玻璃柱中，2.抽结实：减压抽气至10min，将硅胶抽实3.上样：将拌好硅胶的样品，加入硅胶上层4.加石英砂：加入缓冲层5.石油醚淋洗：加入低极性溶剂淋洗，开始润柱时，一定要选取低极性的溶剂淋洗，可以充分稀释残留的大极性溶剂，以免色谱带在柱子上出现抢跑现象6.加缓冲球开始过柱装柱：1.选择什么类型的柱子加压柱：速度比较易于控制，但是由于需要在柱子上方加装一个磨口，限制柱子直径至多在10cm左右，约束它的的最大上样量。
适合小于100-200 g产品的纯化。
大尺寸的加压柱难以制作，用起来危险性大。
在公司过柱时，请使用双链球加压减压柱：适用比较广，但是如果控制不好真空度的话，流速会非常快，同时溶剂很大一部分被抽走，适合任何量的过柱, 比加压柱快，需要减小流动相极性过柱(比加压柱小一倍), 不然会导致分离效果差。
常压柱：适用于量大的物料，但流速较慢。
适合大于50-100 g的产品. 常压柱是分离效果最好的，但是时间也最长。
2.选择多大柱子过柱前知道样品的量，伴样硅胶是样品量的1-2倍，柱子中的硅胶是10-30倍这些硅胶在加入柱子后的径高比在1:5-1:10为比较合适的比例。
如果比例太小1:1,1:3，硅胶高度不够，分离度比较差；如果比例太大，1:10,1:20，这样流速会非常慢3.注意事项及技巧过柱前爬板拿标样，并且NMR确认：过柱前，先拿到标样后，再开始过柱，因为在过柱过程中，你得到点往往比爬小板得到点的要多，如果每个点进行确认的话，时间损耗非常大取硅胶时必须带口罩：硅胶吸入肺中，是无法代谢出身体的，会得矽肺病必须时需要碱化硅胶：硅羟基为弱酸性，所以它可以和胺类物质发生反应，从而使化合物难以洗脱下来，需要在过柱前，使用三乙胺或氨甲醇碱化后再开始上样硅胶可以用量筒量取，质量：体积=1:2，节省时间上样：1.上样方式有几种，各有什么特点干法上样:将化合物用低极性溶剂溶解后，加入1-2倍重量的硅胶拌样，而后璇干成砂状，具良好流动性，这种上样的优点是易于操作，谱带比较整齐，但一定注意的是化合物是否有热固稳定性。
过柱的方法和技巧
关于过柱的实验方法和技巧(注意：有机溶剂对身体特有害别是心肺；肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行！！常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
由于柱分的经验成分太多，所以下面我就几年来过柱的体会写些心得，希望能有所帮助。
1、柱子可以分为：加压，常压，减压压力可以增加淋洗剂的流动速度，减少产品收集的时间，但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候，常压柱是效率最高的，但是时间也最长，比如天然化合物的分离，一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量，感觉能够节省一半甚至更多，但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝结），以及有些比较易分解的东西可能得不到，而且还必须同时使用水泵抽气（很大的噪音，而且时间长）。
以前曾经大量的过减压柱，对它有比较深厚的感情，但是自从尝试了加压后，就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法，与常压柱类似，只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气，双连球或者小气泵（给鱼缸供气的就行）。
特别是在容易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大，不然溶剂走的太快就会减低分离效果。
个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是比较适用的。
2、关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好柱子长了，相应的塔板数就高。
柱子粗了，上样后样品的原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了（有些不环保的说，不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费）。
现在见到的柱子径高比一般在1：5～10，书中写硅胶量是样品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。
实验室常规操作经验 关于过柱的实验方法和技巧 常说的过柱子应该
实验室常规操作经验关于过柱的实验方法和技巧常说的过柱子应该实验室常规操作经验关于过柱的实验方法和技巧常说的过柱子应该叫柱层析分离也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
由于柱分的经验成分太多所以下面我就几年来过柱的体会写些心得希望能有所帮助。
注意有机溶剂对身体特有害别是心肺肝脏等所有过柱操作都要在通风橱里进行柱子可以分为加压常压减压。
压力可以增加淋洗剂的流动速度减少产品收集的时间但是会减低柱子的塔板数。
所以其他条件相同的时候常压柱是效率最高的但是时间也最长比如天然化合物的分离一个柱子几个月也是有的。
减压柱能够减少硅胶的使用量感觉能够节省一半甚至更多但是由于大量的空气通过硅胶会使溶剂挥发有时在柱子外面有水汽凝结以及有些比较易分解的东西可能得不到而且还必须同时使用水泵抽气很大的噪音而且时间长。
以前曾经大量的过减压柱对它有比较深厚的感情但是自从尝试了加压后就几乎再也没动过减压的念头了。
加压柱是一种比较好的方法与常压柱类似只不过外加压力使淋洗剂走的快些。
压力的提供可以是压缩空气双连球或者小气泵给鱼缸供气的就行。
特别是在容易分解的样品的分离中适用。
压力不可过大不然个人觉得加压柱在普通的有机化合物的分离中是溶剂走的太快就会减低分离效果。
比较适用的。
关于柱子的尺寸应该是粗长的最好。
柱子长了相应的塔板数就高。
柱子粗了上样后样品的原点就小反映在柱子上就是样品层比较薄这样相对的减小了分离的难度。
试想如果柱子十厘米而样品就有二厘米那么分离的难度可想而知恐怕要用很低极性的溶剂慢慢冲了。
而如果样品层只有 0.5 厘米那么各组分就比较容易得到完全分离了。
当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了不过这些成本相对于产品来说也许就不算什么了有些不环保的说不过溶剂回收重蒸后也就减小了部分浪费。
现在见到的柱子径高比一般在 1510书中写硅胶量是样品量的 3040 倍具体的选择要具体分析。
如果所需组分和杂质分的比较开是指在所需组分 rf 在 0.20.4杂质相差 0.1 以上就可以少用硅胶用小柱子例如 200 毫克的样品用2cm×20cm 的柱子如果相差不到 0.1就要加大柱子我觉得可以增加柱子的直径比如用 3cm 的也可以减小淋洗剂的极性等等。
柱色谱实验PPT演示课件
色谱法在有机化学中的应用主要包括以下几个 方面： （1）分离混合物 （2）精致提纯化合物 （3）利用比移值（Rf）鉴定化合物 ( 4 ) 跟踪反应进程
•3
实物图
柱色谱常用的有吸附色谱和分配色谱两 类。前者常用氧化铝或硅胶为吸附剂。后者 以硅胶，硅藻土和纤维素为支持剂，以吸收 大量的液体为固定相。当加入的洗脱剂流下 时，由于不同化合物吸附能力不同，因而以 不同的速度沿柱向下流动，继续洗脱时，吸 附能力弱的组分随溶剂首先流出。在连续洗 脱过程中，不同组分或不同色带就能分别收 集，从而达到分离纯化的目的。
•11
装柱要求吸附剂必须均匀地填在柱内，没有气泡、没有 裂缝，否则将影响洗脱和分离。通常采用糊状填料法，即把 柱竖直固定好，关闭下端活塞，底部用少量脱脂棉或玻璃棉 轻轻塞紧，加入约1cm厚的洗净干燥的石英砂层，然后加入 溶剂到柱体积的1/4,；用一定量的溶剂和吸附剂在烧杯内调成 糊状，打开柱下端的活塞，让溶剂一滴一滴地滴入锥形瓶中， 把糊状物快速倒入柱中，打开柱下端的活塞，在不断敲打柱 身的情况下，填加固体吸附剂。柱填好后到吸附剂 •7
2、柱子中若有气泡或装填不均匀，将给分离造成什么样 的结果？如何避免？
答：柱子若装填不均匀或有气泡会造成洗脱剂流动不规则 而形成“沟流”，引起色谱带变形，影响分离效果。
操作方法：用溶剂和少量吸附剂充填柱子，装填到合适的 高度。在装填之前，应将被玻璃棉和砂子用溶剂润湿，否 则柱子会有空气泡。此外，还可以预先将溶剂和吸附剂调 好，倒入柱子里，使它慢慢沉落，如果柱子底部有旋塞， 可以打开旋塞。溶剂慢慢流过柱子，使吸附剂装填均匀。 也可以用铅笔或其他木捧敲打，使吸附剂沿管壁沉落。
高度以下，这样将会出现气泡或裂缝。柱顶部 1/4处一般不充填吸附剂，以便使吸附剂上面始 终保持一液层。
过柱 操作技巧PPT课件
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关于柱子的尺寸，应该是粗长的最好。 柱子长了，相应的塔板数就高。柱子粗了，上样后样品的 原点就小（反映在柱子上就是样品层比较薄），这样相对的 减小了分离的难度。试想如果柱子十厘米，而样品就有二厘 米，那么分离的难度可想而知，恐怕要用很低极性的溶剂慢 慢冲了。而如果样品层只有0.5厘米，那么各组分就比较容易 得到完全分离了。
主要是纸上层析法的用词。源自流速（rate of flow）。溶剂 从原点渗透到距离a（一般在20—30厘米时测定）的时候， 如 果 位 于 原 点 的 物 质 从 原 点 向 前 移 动 到 b ， 那 么 b/a 的 值 （0.0—1.0）就是这种物质的Rf值。例如把葡萄糖和果糖在 20℃下于正丁醇-醋酸-水（4∶1∶5）中展开，可分别得到 0.18、0.23的Rf值，在醋酸乙酯-吡啶-水（2∶1∶1）中展开， 则分别得到0.28、0.32的Rf值。若滤纸、溶剂温度等保持恒 定，则各种物质呈现特定的Rf值，成为鉴定物质的极重要的 常数.
精选ppt课件2021
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当然采用粗大的柱子要牺牲比较多的硅胶和溶剂了，不过这 些成本相对于产品来说也许就不算什么了（不过溶剂回收重 蒸后也就减小了部分浪费）。
精选ppt课件2021
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现在见到的柱子径高比一般在1：5~10，书中写硅胶量是样 品量的30～40倍，具体的选择要具体分析。如果所需组分和杂 质分的比较开（是指在所需组分rf在0.2～0.4，杂质相差0.1以 上），就可以少用硅胶，用小柱子（例如200毫克的样品，用 2cm×20cm的柱子）；如果相差不到0.1，就要加大柱子，我 觉得可以增加柱子的直径，比如用3cm的，也可以减小淋洗剂 的极性等等关于无水无氧柱，适用于对氧，水敏感，易分解的 产品。
样品纯化技术：过柱技巧
《过柱纯化》PPT课件
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未纯化前 质粒DNA
mark
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未纯化前 未纯化前 PCR产物 质粒DNA
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有利于提高洗脱效率。
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1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的 开关按键来实现功能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按
PCBA
键
开关 键
传统机械按键设计要点： 1.合理的选择按键的类型， 尽量选择平头类的按键，以 防按键下陷。 2.开关按键和塑胶按键设计 间隙建议留0.05~0.1mm，以 防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计 算累积公差，以防按键手感 不良。
弃滤液。 9.将700 µl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒，
弃滤液 。 10.重复操作步骤9，然后12,000 rpm再离心1分钟。 11.将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column
膜的中央处加入25 µl 的灭菌蒸馏水*，室温静置1分钟*。 12. 12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA。
2.切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提 高DNA的回收率。
3.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1µl 进行计算。
4.向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下 表：
5.均匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂只需在45 ℃)，间断 振荡混合，使胶块充分融化（约6～10分钟)。
6、电泳、割胶、纯化DNA
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1、实验目的：(p140)
将所需要的DNA片段进行回收，纯化。 （TaKaRa公司 凝胶回收试剂盒）
过柱子的原理与方法之欧阳歌谷创作
过柱子的原理与方法欧阳歌谷（2021.02.01）标签：过柱子硅胶原理方法常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
，硅胶层析是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使物质分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。
硅胶层析主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯，高纯度物质的制备等。
硅胶层析性状：该产品为白色均匀颗粒，主要成分为二氧化硅，由优质硅胶为原料加工制成。
其主要特点是能通过对混合物质中的不同成分吸附保留时间的差异，达到分离提纯的目的。
依其纯度又分为工业级粗孔柱层析硅胶、试剂级柱层析硅胶。
用途：主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯，高纯度物质的制备等。
硅胶表面结构概述在色谱和工业水处理领域中，无定形硅胶已得到了广泛的应用，它具有多孔的无定形结构，不产生任何x 射线衍射[1,4]。
硅胶的表面存在着硅醇基团(sioh)和暴露的硅氧烷键(siosi)。
硅醇基团是强吸附的极性基团，而硅氧烷键是疏水基团。
硅氧烷键上的δ键被dπpπ作用而加强，氧原子上的孤对电子参与π作用，不能参与给体与受体间的相互作用，不能形成氢键。
scott和kucera证实硅氧烷基团几乎不吸附极性溶剂分子。
然而，由于硅氧烷键的疏水作用性，可以吸附某些非极性溶剂分子。
对硅胶改性而言，硅醇基比硅氧烷基重要得多。
硅醇基团可以孤立、成对(双生)和缔合(连位)等不同的方式存在于硅胶表面。
最近研究表明，不仅两个或两个以上的缔合硅醇基团可以形成键合对，甚至成对硅醇基团也可以形成键合对。
硅胶表面的结构可以通过许多方法进行测定。
一般情况下，随着比表面积的增加，硅胶表面上硅醇基团的浓度略有降低。
通常硅醇含量的测定方法有同位素交换法、滴定法、光谱法和烷基铝法等。
nawrock[1]报道了用同位素交换法测定硅胶表面的硅醇基浓度是8.0±1.0μmol/m2，而且这个数值常常被视为硅胶的物理化学常数。
过柱子的原理与方法之欧阳理创编
过柱子的原理与方法标签：过柱子硅胶原理方法常说的过柱子应该叫柱层析分离，也叫柱色谱。
我们常用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱。
，硅胶层析是根据物质在硅胶上的吸附力不同而使物质分离，一般情况下极性较大的物质易被硅胶吸附，极性较弱的物质不易被硅胶吸附，整个层析过程即是吸附、解吸、再吸附、再解吸过程。
硅胶层析主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯，高纯度物质的制备等。
硅胶层析性状：该产品为白色均匀颗粒，主要成分为二氧化硅，由优质硅胶为原料加工制成。
其主要特点是能通过对混合物质中的不同成分吸附保留时间的差异，达到分离提纯的目的。
依其纯度又分为工业级粗孔柱层析硅胶、试剂级柱层析硅胶。
用途：主要用于石油产品的精制，脱除芳烃物质或用于中草药有效成分的分离提纯，高纯度物质的制备等。
硅胶表面结构概述在色谱和工业水处理领域中，无定形硅胶已得到了广泛的应用，它具有多孔的无定形结构，不产生任何x 射线衍射[1,4]。
硅胶的表面存在着硅醇基团(sioh)和暴露的硅氧烷键(siosi)。
硅醇基团是强吸附的极性基团，而硅氧烷键是疏水基团。
硅氧烷键上的δ键被dπpπ作用而加强，氧原子上的孤对电子参与π作用，不能参与给体与受体间的相互作用，不能形成氢键。
scott和kucera证实硅氧烷基团几乎不吸附极性溶剂分子。
然而，由于硅氧烷键的疏水作用性，可以吸附某些非极性溶剂分子。
对硅胶改性而言，硅醇基比硅氧烷基重要得多。
硅醇基团可以孤立、成对(双生)和缔合(连位)等不同的方式存在于硅胶表面。
最近研究表明，不仅两个或两个以上的缔合硅醇基团可以形成键合对，甚至成对硅醇基团也可以形成键合对。
硅胶表面的结构可以通过许多方法进行测定。
一般情况下，随着比表面积的增加，硅胶表面上硅醇基团的浓度略有降低。
通常硅醇含量的测定方法有同位素交换法、滴定法、光谱法和烷基铝法等。
nawrock[1]报道了用同位素交换法测定硅胶表面的硅醇基浓度是8.0±1.0μmol/m2，而且这个数值常常被视为硅胶的物理化学常数。
薄层色谱-过柱子
过柱子总结（吸附剂与洗脱剂）一、吸附剂与洗脱剂根据待分离组分的结构和性质选择合适的吸附剂和洗脱剂是分离成败的关键。
1．吸附剂的要求①对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。
②对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。
③颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速（一般为1.5mL·min-1）通过色谱柱。
④材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。
2、常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁）、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。
3、几种常见吸附剂的特性（1）氧化铝：市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100～150目。
碱性氧化铝（pH9—10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。
但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。
酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。
所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。
酸性氧化铝（pH3.5—4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。
中性氧化铝（pH7—7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。
（2）硅胶：硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O，又叫缩水硅酸。
柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。
适用范围：非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。
（3）聚酰胺：色谱用聚酰胺主要又锦纶6（聚己内酰胺）和锦纶66（聚己二酰己二胺）两种，分子量一般在16000～20000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。
过柱子的原理与方法
过柱子的道理与办法标签：过柱子硅胶道理办法常说的过柱子应当叫柱层析分别,也叫柱色谱.我们经常运用的是以硅胶或氧化铝作固定相的吸附柱.,硅胶层析是依据物资在硅胶上的吸附力不合而使物资分别, 一般情形下极性较大的物资易被硅胶吸附,极性较弱的物资不轻易被硅胶吸附,全部层析进程等于吸附.解吸.再吸附.再解吸进程.硅胶层析重要用于石油产品的精制,脱除芳烃物资或用于中草药有效成分的分别提纯,高纯度物资的制备等.硅胶层析性状：该产品为白色平均颗粒,重要成分为二氧化硅,由优质硅胶为原料加工制成.其重要特色是能经由过程对混杂物资中的不合成分吸附保存时光的差别,达到分别提纯的目标.依其纯度又分为工业级粗孔柱层析硅胶.试剂级柱层析硅胶.用处：重要用于石油产品的精制,脱除芳烃物资或用于中草药有效成分的分别提纯,高纯度物资的制备等.硅胶概况构造概述在色谱和工业水处理范畴中,无定形硅胶已得到了普遍的运用,它具有多孔的无定形构造,不产生任何x 射线衍射[1,4].硅胶的概况消失着硅醇基团(sioh)和吐露的硅氧烷键(siosi).硅醇基团是强吸附的极性基团,而硅氧烷键是疏水基团.硅氧烷键上的δ键被dπpπ感化而增强,氧原子上的孤对电子介入π感化,不克不及介入给体与受体间的互相感化,不克不及形成氢键.scott和kucera证实硅氧烷基团几乎不吸附极性溶剂分子.然而,因为硅氧烷键的疏水感化性,可以吸附某些非极性溶剂分子.对硅胶改性而言,硅醇基比硅氧烷基重要得多.硅醇基团可以孤立.成对(双生)和缔合(连位)等不合的方法消失于硅胶概况.比来研讨标明,不但两个或两个以上的缔合硅醇基团可以形成键合对,甚至成对硅醇基团也可以形成键合对.硅胶概况的构造可以经由过程很多办法进行测定.一般情形下,跟着比概况积的增长,硅胶概况上硅醇基团的浓度略有降低.平日硅醇含量的测定办法有同位故旧流法.滴定法.光谱法和烷基铝法等.nawrock[1]报导了用同位故旧流法测定硅胶概况的硅醇基浓度是8.0±1.0μmol/m2,并且这个数值经常被视为硅胶的物理化学常数.硅醇基团具有显著的酸性,测定的pka值是7.1.经由过程对硅胶概况的构造剖析,可知硅胶概况硅醇基的类型.浓度和概况散布都邑影响所制备键合相的机能,而硅胶的预处理则可以转变概况硅醇类型的散布,进步概况的缔合硅醇的含量,改良硅胶概况键合相的机能.硅胶柱层析技巧硅胶柱层析道理硅胶层析法的分别道理是依据物资在硅胶上的吸附力不合而得到分别, 一般情形下极性较大的物资易被硅胶吸附,极性较弱的物资不轻易被硅胶吸附,全部层析进程等于吸附.解吸.再吸附.再解吸进程.硅胶柱层析流淌相极性小的用乙酸乙酯：石油醚洗脱;极性较大的用甲醇：氯仿洗脱;极性大的用甲醇：水：正丁醇：醋酸洗脱;拖尾可以参加少量氨水或冰醋酸硅胶柱层析习用办法1.称量.00目硅胶,称3070倍于上样量;假如极难分,也可以用100倍量的硅胶H.干硅胶的视密度在0.4阁下,所以要称40g 硅胶,用烧杯量100ml也可以.2.搅成匀浆.参加干硅胶体积一倍的溶剂用玻璃棒充分搅拌.假如洗脱剂是石油醚/乙酸乙酯/丙酮系统,就用石油醚拌;假如洗脱剂是氯仿/醇系统,就用氯仿拌.假如不克不及搅成匀浆,解释溶剂中含水量太大,尤其是乙酸乙酯/丙酮,假如不与水配伍走分派色谱的话,必须预先用无水硫酸钠久置湿润.氯仿用无水氯化钙湿润,以除去1%的醇.假如样品对酸迟钝,不克不及用氯仿系统过柱.3.装柱.将柱底用棉花塞紧,不必用海沙,参加约1/3体积石油醚（氯仿）,装上蓄液球,打开柱下活塞,将匀浆一次倾入蓄液球内.跟着沉降,会有一些硅胶沾在蓄液球内,用石油醚（氯仿）将其冲入柱中.4.压实.沉降完成后,参加更多的石油醚,用双联球或气泵加压,直至流速恒定.柱床约被紧缩至9/10体积.无论走常压柱或加压柱,都应进行这一步,可使分别度进步很多,且可以防止过柱时因为柱床萎缩产生开裂.5.上样.干法湿法都可以.海沙是没须要的.上样后,参加一些洗脱剂,再将一团脱脂棉塞至接近硅胶概况.然后就可以宁神地参加大量洗脱剂,而不会冲坏硅胶概况.6.过柱和收集.柱层析现实上是在集中和分别之间的衡量.太低的洗脱强度其实不好,推举用梯度洗脱.收集的例子：10mg上样量,1g硅胶H,0.5ml收一馏分;12g上样量,50g硅胶（00目）,2050ml收一馏分.7.检测.要更多地运用专用喷显剂,假如仅用紫外灯,会损掉较多产品,紫外的敏锐度一般比喷显剂底12个数目级.8.送谱.收集的产品旋干,在送谱前平日须要重结晶.假如样品太少或为液体,可过一小凝胶柱,作为送谱前的最后纯化手腕.可除去氢谱1.5ppm阁下所谓的“硅胶”峰.留意事项1.先依据TLC办法筛选好洗脱剂,使两相邻物资Rf值之差最大化2.将柱子必须装平整.平均柱层析分别的试验办法和技能1B= vrGq一：柱子可以分为：加压,常压,减压压力可以增长淋洗剂的流淌速度,削减产品收集的时光,但是会减低柱子的塔板数.所以其他前提雷同的时刻,常压柱是效力最高的,但是时光也最长,比方自然化合物的分别,一个柱子几个月也是有的.减压柱可以或许削减硅胶的运用量,感到可以或许节俭一半甚至更多,但是因为大量的空气经由过程硅胶会使溶剂挥发（有时在柱子外面有水汽凝聚）,以及有些比较易分化的器械可能得不到,并且还必须同时运用水泵抽气（很大的噪音,并且时光长）.以前曾大量的过减压柱,对它有比较深挚的情感,但是自从测验测验了加压后,就几乎再也没动过减压的念头了.加压柱是一种比较好的办法,与常压柱相似,只不过外加压力使淋洗剂走的快些.压力的供给可所以紧缩空气,双连球或者吝啬泵（给鱼缸供气的就行）.特殊是在轻易分化的样品的分别中实用.压力不成过大,不然溶剂走的太快就会减低分别后果.小我以为加压柱在通俗的有机化合物的分别中是比较实用的.三：关于无水无氧柱实用于对氧,水迟钝,易分化的产品,可以湿柱,也可以干柱.不过在样品之前至少要用溶剂把柱子饱和一次,因为溶剂和硅胶饱和时放出的热量有可能是产品分化,毕竟要分别的是迟钝的东东,当心不为过.也是因为分别的器械比较迟钝,所以吸收瓶必定要用可密封的,遵守schlenk操纵.至于是加压.常压.减压,随需而定.因为是schlenk操纵,所以点板是个问题,假如样品是显色的,恭喜了,不必点板,直接看柱子上的色带就行了.假如样品无色,只好预备几十个schlenk瓶,一瓶一瓶的点,不过几回之后就知道样品在哪,也就可以省些了.像我以前过一根无水无氧柱,须要六个schlenk,如今只一个就能把所要的全收集到.无水无氧柱顶用的比较多的是用氧化铝作固定相.因为硅胶中有大量的羟基袒露在外,很轻易是样品分化,特殊是金属有机化合物和含磷化合物.而氧化铝可以做成碱性.中性和酸性的,选择余地比较大,但是比硅胶要贵些.据说有个办法,就是用石英做柱子,然后用HF254做固定相,如许在柱子外面用紫外灯一照就知道产品在哪里了,没有验证过.哪位做过可以提出来大家参详参详.四：关于湿法.干法上样湿法省事,一般用淋洗剂消融样品,也可以用二氯甲烷.乙酸乙酯等,但溶剂越少越好,不然溶剂就成了淋洗剂了.很多样品在上柱前是粘乎乎的,一般没紧要.可是有的上样后在硅胶上又会析出,这一般都是比较大量的样品才会消失,是因为硅胶对样品的吸附饱和,而样品本身又是比较好的固体才会产生,这就应当先重结晶,得到大部分的产品后再柱分,假如不克不及重结晶,那就不管它了,直接过就是了,样品跟着淋洗剂流淌会消融的.有些样品消融性差,能消融的溶剂又不克不及上柱（比方DMF,DMSO等,会跟着溶剂一路走,显色是一个很长的脱尾）,这时就必须用干法上柱了.样品和硅胶的量有一种说法是1：1,我以为是越少越好,但是要包管在旋干后,不克不及看到显著的固体颗粒（那解释有的样品没有吸附在硅胶上）.五：溶剂的选择当然是最便宜,最安然,最环保的了.所以大多选用石油醚,乙酸乙酯.文献中有写用正己烷的,太贵了,除非特殊须要不要用不然银子哗哗的,流的比淋洗剂还快,不过因为极性很小,有时照样非它不成.乙醚也可以用,但是就是轻易睡觉,留意保持苏醒别让溶剂流干了,那样柱子也就不爽了.二氯甲烷也有效的,但是要知道,它和硅胶的吸附是一个放热进程,所以炎天的时刻经常会在柱子里产朝气泡,气象冷的时刻会好一些.甲醇据说能消融部分的硅胶,所以产品假如想过元素剖析的话要留心,应当经事后继处理,比方说重结晶等.其他的溶剂用的相对较少,要依小我的不合须要选择了. Q7&Yy25因为某些原因,用到的淋洗剂多是大包装的（便宜嘛）,我们这里是用10升或25升的塑料桶装的,就要留意这些工业品的纯度是较低的.经常可以或许从送来的大桶底部看见有色的杂质,其他的杂质就可想而知了,所以在比较严厉的柱分时就要对溶剂重蒸.当然过原料时就可以免除这一步了,横竖下面还有提纯的办法.别的溶剂在过柱子后最好也收受接管运用,一方面环保,另一方面也能节俭部分经费,缺陷是要消费必定的人工.这里要留意的是,一般在过柱同时进行的是减压旋蒸,石油醚和乙酸乙酯的比例因为挥发度的不合会导致极性的变更,一般会使得极性变大,在梯度淋洗时比较适合,正好极性越来越大了.在过完柱子后,溶剂最后收受接管要采取常压,因为在减压旋蒸时会有部分低沸点的杂质一路出来,常压时就会削减这种现象,假如杂质和你下面要过的样品有反响那就惨了.六：关于操纵问题1. 装柱柱子下面的活塞必定不要涂润滑剂,会被淋洗剂带到产品中的,可以采取四氟节门的.干法和湿法装柱以为没什么差别,只要能把柱子装实就行.装完的柱子应当要适度的慎密（太密了淋洗剂走的太慢）,必定要平均（不然样品就会从一侧斜着下来）.书中写的都是不克不及见到气泡,我以为在大多半情形下有些吝啬泡没太大的影响,一加压气泡就全下来了.当然假如你装的柱子老是有气泡就解释须要多演习了.但是柱子更隐讳的是开裂,甭管竖的照样横的,都邑影响分别后果,甚至作废！2. 加样用少量的溶剂溶样品加样,加完后将下面的活塞打开,待溶剂层降低至石英砂面时,再加少量的低极性溶剂,然后再打开活塞,如斯两三次,一般石英砂就根本是白色的了.参加淋洗剂,一开端不要加压,等溶样品的溶剂和样品层有一段距离（2～4cm就够了）,再加压,如许防止了溶剂（如二氯甲烷等）夹带样品快速下行.3. 淋洗剂的选择感到上要使所需点在rf0.2～0.3阁下的比较好.不要以为在板上爬高了分的比较开,过柱子就用那种极性,假如rf在0.6,即使相差0.2也不轻易在柱子上离开,因为柱子是一个多次爬板的状况,可以经由过程公式的比较：0.6/0.8一次的分别度,确定不如（0.2/0.3）的三次方或四次方大.4. 样品的收集用硅胶作固定相过柱子的道理是一个吸附与解吸的均衡.所以假如样品与硅胶的吸附比较强的话,就不轻易流出.如许就会产生,后面的点先出,而前面的点后出.这时可以采取氧化铝作固定相.别的,收集的试管大小要以样品量而定,特殊是小量样品,假如用大试管,可能一根就收到了三个样品,wuwu.假如都用小试管那工作量又太大.5.最后的处理柱分后的产品,因为运用了大量的溶剂,个中的杂质也会累积到产品中,所以假如想送剖析,最好用少量的溶剂洗涤一下,因为大部分的杂质是溶在溶剂里的,一洗根本就没了,须要时进行重结晶.别的,再过柱的时刻,有时会消失气泡,一是和运用的溶剂有关,假如是易挥发的溶剂,如乙醚.二氯甲烷等,在室温稍高的情形下,很轻易消失这种现象,是以,在室温高的时刻,可以选择沸点较高,挥发相对小的溶剂.还有,运用混杂溶剂时,运用的两种溶剂的沸点应当相差不大,如：乙酸乙酯和石油醚(60~90),而乙醚却要选择30－60的石油醚.二是：不管是用带砂板的照样塞棉花的,在装柱之前,都要将空气用加压的办法将空气排干,如许就可防止柱中有空气！。
有机化学色谱柱层析法(过柱子)
吸附剂与洗脱剂（一）吸附剂与洗脱剂根据待分离组分的结构和性质选择合适的吸附剂和洗脱剂是分离成败的关键。
1．吸附剂的要求①对样品组分和洗脱剂都不会发生任何化学反应，在洗脱剂中也不会溶解。
②对待分离组分能够进行可逆的吸附，同时具有足够的吸附力，使组分在固定相与流动相之间能最快地达到平衡。
③颗粒形状均匀，大小适当，以保证洗脱剂能够以一定的流速（一般为1.5mL·min-1）通过色谱柱。
④材料易得，价格便宜而且是无色的，以便于观察。
2、常用吸附剂的种类：氧化铝、硅胶、聚酰胺、硅酸镁、滑石粉、氧化钙（镁）、淀粉、纤维素、蔗糖和活性炭等。
3、几种常见吸附剂的特性（1）氧化铝：市售的层析用氧化铝有碱性、中性和酸性三种类型，粒度规格大多为100～150目。
碱性氧化铝（pH9—10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。
但这种吸附剂能引起被吸附的醛、酮的缩合。
酯和内酯的水解、醇羟基的脱水、乙酰糖的去乙酰化、维生素A和K等的破坏等不良副反应。
所以，这些化合物不宜用碱性氧化铝分离。
酸性氧化铝（pH3.5—4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。
中性氧化铝（pH7—7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也可以用来分离弱的有机酸和碱等。
（2）硅胶：硅胶是硅酸的部分脱水后的产物，其成分是SiO2·xH2O，又叫缩水硅酸。
柱色谱用硅胶一般不含粘合剂。
适用范围：非极性和极性化合物，适用于芳香油、萜类、甾体、生物碱、强心甙、蒽醌类、酸性、酚性化合物、磷脂类、脂肪酸、氨基酸，以及一系列合成产品如有机金属化合物等。
（3）聚酰胺：色谱用聚酰胺主要又锦纶6（聚己内酰胺）和锦纶66（聚己二酰己二胺）两种，分子量一般在16000～20000，其亲水性和亲脂性均较好，因此既可分离水溶性成份，也可分离脂溶性成分。
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1
1、实验目的：(p140)
将所需要的DNA片段进行回收，纯化。 （TaKaRa公司 凝胶回收试剂盒）
2、实验原理：
精选课件ppt
2
实验操作
1.在紫外灯下切出含有目的DNA的琼脂糖凝胶，用纸巾吸尽凝胶 表面的液体。此时应注意尽量切除不含目的DNA部分的凝胶， 尽量减小凝胶体积，提高DNA回收率*。
2.切碎胶块。胶块切碎后可以加快操作步骤6的胶块融化时间，提 高DNA的回收率。
3.称量胶块重量，计算胶块体积。计算胶块体积时，以1 mg=1µl 进行计算。
4.向胶块中加入胶块融化液DR-I Buffer，DR-I Buffer的加量如下 表：
5.均匀混合后75℃加热融化胶块(低熔点琼脂只需在45 ℃)，间断 振荡混合，使胶块充分融化（约6～10分钟)。
弃滤液。 9.将700 µl的Rinse B加入Spin Column中，12,000 rpm离心30秒，
弃滤液 。 10.重复操作步骤9，然后12,000 rpm再离心1分钟。 11.将Spin Column安置于新的1.5 ml的离心管上，在Spin Column
膜的中央处加入25 µl 的灭菌蒸馏水*，室温静置1分钟*。 12. 12,000 rpm离心2分钟洗脱DNA。
*把灭菌蒸馏水加热至60℃使用时有利于提高洗脱效率。
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未纯化前 未纯化前 PCR产物 质粒DNA
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*切胶时请注意不要将DNA长时间暴精选露课于件p紫pt 外灯下，以防止DNA损伤。 3
6.加入DR-I Buffer量的1/2体积量的DR-II Buffer，均匀混合。 7.将溶液转移至Spin Column中，12,000 rpm离心1分钟，弃滤液
(可重复一次，提高DNA回收率)。 8.将500 µl的Rinse A加入Spin Column中，12,000 rpm离心30s，