海南黎族鱼茶中微生物多样性分析_王小茹

microbial resources from Yucha.
Key words: Hainan; Li nationality; Yucha; microbial diversity; 16S rRNA sequencing analysis; qRT-PCR; phylogenetic analysis
DOI:10.7506/spkx1002-6630-201706021
中图分类号：TS201.3
文献标志码：A
文章编号：1002-6630（2017）06-0136-06
引文格式：
王小茹, 徐传标, 彭湘文, 等. 海南黎族鱼茶中微生物多样性分析[J]. 食品科学, 2017, 38(6): 136-141. DOI:10.7506/
收稿日期：2016-06-15 基金项目：海南省高等学校科学研究项目（Hnky2016-12）；海南大学科研启动基金项目（KYQD1548） 作者简介：王小茹（1994—），女，本科，研究方向为食品微生物。E-mail：WangXiaoru1210@ *通信作者：张家超（1986—），男，教授，博士，研究方向为食品微生物。E-mail：zhjch321123@
※生物工程
食品科学
2017, Vol.38, No.06 137
鱼茶，又名鱼酸，是海南黎族的一种传统发酵食 品。制作方法主要是把生鱼或生肉拌入米饭，加入少许 盐，在陶罐里腌制发酵而成，为了改善鱼茶风味，也加 入辣椒、大蒜及其他调味品。鱼茶味酸而微咸，柔软且 稍韧，味道独特，诱人食欲[1-3]。
and Lactobacillus pentosus being the most predominant species. The microbial diversity in Yucha from different areas
was different. Lactobacillus rossiae was exclusively found in Yucha from Baoting while L. coryniformis, L. fermentum,
海南，位置独特、气候优越资源丰富，是我国发 展热带生物产业和研究热带生物资源的重要区域[4]。 鱼茶制作工艺沿袭传统方法，保留了许多当地自然环 境中的有益微生物，是研究海南微生物多样性的绝 佳模型。近年来，国内外有许多传统发酵食品微生 物多样性的研究，苗族酸汤中分离得到Lactobacillus plantarum、Lactobacillus acidophilus、Lactobacillus lactis 和Streptococcus thermophilus菌种[5]，西藏传统发酵乳中 Lactobacillus casei是优势菌群[6]，云南西双版纳州的景洪 市和勐海县两地区豆豉的主要优势菌种分别为Leuconostoc mesenteroides和Staphylococcus gallinarum[7]，东北传统豆 酱发酵过程中优势细菌为Bacillus和Lactobacillus[8]，印 度黑绿豆米饼中蕴含着丰富的Leuconostos、Weissella和 Pediococcus等菌属[9]，韩国八大种传统发酵食品中微生物 多样性也十分丰富[10]，这些研究为当地环境中有益微生物 的开发和利用提供了基础条件。
Analysis of Microbial Diversity in Yucha, a Traditional Fermented Rice Food of Li Nationality from Hainan
WANG Xiaoru, XU Chuanbiao, PENG Xiangwen, ZHANG Jiachao*
from different Li nationality households in Baoting and Baisha areas of Hainan province were used to isolate and purify
microbes by conventional culture method and further to determine microbial diversity by 16S rRNA sequencing analysis and
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L. namurensis and L. senioris in Yucha from Baisha. The results of the present study revealed the abundant microbial
diversity and microbial community structure in Yucha, which could provide evidence to develop and use the beneficial
1.3 方法 1.3.1 样品采集与处理
28 份样品采自保亭和白沙地区的黎族家庭，鱼 茶装入无菌容器，全程4 ℃条件下低温保藏运送至 实验室。称取10 g鱼茶样品放入90 mL无菌生理盐水 （0.85 g/100 mL）中，混合均匀，按10 倍稀释法制备成 10－1～10－5的鱼茶样品稀释液。 1.3.2 微生物分离与纯化
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食品科学
※生物工程
海南黎族鱼茶中微生物多样性分析
王小茹，徐传标，彭湘文，张家超*
（海南大学食品学院，海南 海口 570228）
摘 要：以采集自海南保亭与白沙两地区的黎族家庭的28 份样本为研究对象，采用传统分离培养方法，16S rRNA 基因序列分析和实时定量聚合酶链式反应分析对样品中的微生物进行分离鉴定和多样性研究。结果表明，共鉴定 出6 个属，22 个种，其中Lactobacillus属占总数的68.56%，Bacillus属和Enterococcus属则分别占18.04%和10.82%， 又测得Lactobacillus属基因拷贝数为2.24×107，Bacillus属为1.72×105以及Enterococcus属为1.07×106。可知， Lactobacillus属是鱼茶中的主要优势菌属，Lactobacillus plantarum和Lactobacillus pentosus是鱼茶中的优势菌种。而 不同地区鱼茶中微生物多样性也存在差异，以Lactobacillus属为例，保亭地区独有Lactobacillus rossiae，而白沙地区 独有Lactobacillus coryniformis、Lactobacillus fermentum、Lactobacillus namurensis、Lactobacillus senioris。研究结果 揭示了海南黎族鱼茶中微生物的丰富多样性，反映了微生物群落结构特点，为有益微生物资源的开发利用提供参考 依据。 关键词：海南；黎族；鱼茶；微生物多样性；16S rRNA基因序列分析；实时定量聚合酶链式反应；分类进化
quantitative real-time polymerase china reaction (qRT-PCR). A total of 22 bacterial species from six genera were identified.
Among these, Lactobacillus, Bacillus and Enterococcus accounted for 68.56%, 18.04% and 10.82% of the total bacteria, respectively. Meanwhile, the copy numbers of genes in Lactobacillus, Bacillus and Enterococcus were 2.24 × 107, 1.72 × 105 and 1.07 × 106, respectively, meaning that Lactobacillus was the most predominant genus, with Lactobacillus plantarum
采用液氮冻融法，参考文献[12-14]的十六烷基三甲 基溴化铵（hexadecyltrimethy ammonium bromide，CTAB） 法提取菌株总基因组DNA，提取出的DNA置于－20 ℃ 条件下保存。基因组DNA用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测浓度 和纯度，100 V电压下0.5×TBE电泳液中电泳20 min。
spkx1002-6630-201706021.
WANG Xiaoru, XU Chuanbiao, PENG Xiangwen, et al. Analysis of microbial diversity in Yucha, a traditional fermented
1 材料与方法
1.1 材料与试剂 鱼茶样品采自海南保亭和白沙地区的黎族家庭。 MRS培养基 北京陆桥技术有限责任公司；M17培
养基 英国Oxoid公司；6×DNA loading buffer（含二甲 苯菁和溴酚蓝双染料）；2×Es Taq Master Mix、D2000 DNA ladder、蛋白酶K 北京康为世纪生物科技有限 公司；SYBR Green 2×Buffer 宝生物工程（大连） 有限公司；GoldView™核酸染料 美国Amerco公司； Agarose LE 天根生化科技（北京）有限公司。 1.2 仪器与设备
从各浓度的鱼茶样品稀释液中吸取100 μL，分别涂 布于M17琼脂和MRS琼脂培养基上，每个稀释度涂布一 个平板，37 ℃条件下培养48 h，其中MRS培养基需置于 厌氧罐中。通过肉眼观察并记录菌落形态后，从最佳稀 释梯度培养基中挑取可疑菌落，接种到对应肉汤培养基 中37 ℃条件下培养48 h。用革兰氏染色法在光学显微镜 下观察菌体形态，检验是否为纯菌种，并配合接触酶实 验初步判断乳酸菌[11]。检查为纯菌种的菌株传代培养后 甘油法－70 ℃条件下低温冻存。 1.3.3 16S rRNA基因序列分析