土壤微生物多样性研究的新方法
土壤学中的土壤微生物群落分析方法

土壤学中的土壤微生物群落分析方法土壤生态系统是一种充满生机的生物体系,其中土壤微生物群落是其中最丰富和重要的组成部分之一。
土壤微生物在土壤生态系统中起着重要的作用,包括有机质分解、氮循环、生物固氮以及供给植物生长所需的营养元素等。
因此,对土壤微生物群落进行准确分析有助于了解土壤生态系统的健康和状况,为环境保护和农业生产提供有价值的参考依据。
本文将介绍土壤学中常用的土壤微生物群落分析方法。
一、DNA测序技术近年来,随着高通量测序技术的不断发展和成熟,DNA测序技术已成为研究土壤微生物群落多样性的主要手段。
目前常用的DNA测序技术包括Sanger测序、454测序、Illumina测序和PacBio测序等。
这些技术的主要区别在于读长、测序准确度、数据处理复杂度和成本等方面。
其中,Illumina测序技术是应用最广泛的测序技术之一。
该技术具有高通量、高准确度和低成本等优势,能够产生数百万到数十亿个序列,适用于研究微生物群落组成、特定功能基因的分布和微生物群落的分子进化等。
但该技术也存在一些限制,如读长短、测序偏差和寡核苷酸错误等,需要进行数据过滤和样本对比等后续分析。
二、FISH技术FISH(Fluorescence In Situ Hybridzation)是一种在原位的方法,能够直接观测微生物群落中细菌的存在和数量。
该技术使用DNA探针标记靶细胞的核酸序列,配合荧光探针进行检测和成像,可以定量测量目标细菌在样品中的丰度和空间分布。
FISH技术的优势在于高分辨率的成像和定量准确性,能够提示具体的微生物存在形态,如球形、杆状等。
三、PCR-DGGE技术PCR-DGGE(Polymerase Chain Reaction-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis)技术依赖PCR扩增样品中的16S rRNA基因,然后将PCR产物在含有变性剂的聚丙烯酰胺凝胶上电泳,通过电泳道中的变性梯度来分离不同的微生物群落。
土壤微生物生物量及多样性测定方法评述

基 金 项 目 :国家重 点基 础研 究发 展计 划 项 目 ( 0 7 B 02 05 ;国家 “ 2 0C 4 70 — ) 十一 五’ 技 支撑 计划 资 助项 目 ( 0 6 A 0 A 1 科 20B C 10 ) 作者 简介 :胡 婵娟 ( 9 1 生 ) 18 年 ,女 ,博士 ,主 要进 行景 观生 态学 和 士壤 生态 学 的研究 。Emalhc aja18 @16tom - i uhnun9 1 2 :
2 土壤 微 生物 多样性 的研 究方法 . 2
土壤微生物多样性测试的传统方法为分离法 , 该方法获得 的数据在一定程度上决定 于提取 的方 法和培养基类型。并且绝大部分土壤微生物无法用 现有 的分离 方法 进行 培养 。因此 ,该 方法 有很 大 的 局 限性 。在过 去 十几年 的时 间里 ,随着测 试技术 的 进步 ,土壤微 生物群 落结 构 的测 定方 法也 得到 了迅 速地 发展 ,新 的测定 方法 的 出现 如生 物标 志物法 、 磷酯脂肪酸分析法 、 核酸分析法及碳素利用法使人 们能够更好的评价土壤微生物群落结构和多样性 。 如图 1 示。 所 221 基 于培 养 的微 生物群 落的测 定方 法 . . 1 微 生物平 板 培养法 ) 微生物平板培养方法是一种传统的实验方法。 这种方法主要使用不 同营养成分 的固体培养基对 土壤中可培养的微生物进行分离培养 , 然后根据微 生物 的菌落形态及其 菌落数来计测微生物的数量 及其类型。平板培养法是进行土壤微生物分离培养 的常用方法 ,一般分为稀释 、 接种、培养和计数等 几个步骤,该方法简便易行 , 一直以来 , 被广泛应 用。这种方法在土壤健康的研究中应用较多 , 许多 研 究 表 明利 用 该 方 法 得 到 的 土壤 微 生 物 的多 样 性 与土壤 的病害控制、有机质的分解等方面存在一定 的关系【 o 但是有关研究表明与其他非培养方式 3。 ]
土壤微生物的功能和多样性研究

土壤微生物的功能和多样性研究土壤是地球上最为基本的生态系统之一,其中微生物在土壤生态系统中起着重要的作用。
土壤微生物可分为细菌、真菌、放线菌、蓝藻等多种类型。
这些微生物既有好菌也有坏菌,有益菌则可以分解有机物、固定氮、增加土壤肥力,帮助作物生长。
一、土壤微生物的功能1. 分解有机物土壤的有机物质主要由植物残体、动物残体和微生物体细胞等构成。
而土壤中有机物的分解则归功于微生物的功能。
细菌和真菌通过分泌酶分解土壤中的有机物质,从而降解成较小的有机分子、无机盐和水;放线菌则能通过产生大量的酶类分解纤维素和淀粉等。
这样一来,土壤中的养料就得到了加速分解,有机物的分解速度得以加快。
2. 固定氮固定氮又称为氮素固定,指将空气中无机氮转化为可被植物吸收的氮素的过程。
土壤微生物中一些细菌可通过合成酶固定氮,从而将空气中的氮气转化为氨化合物,利用这些氨化合物可为植物提供生长所需的氮素物质,进而促进植物生长发育。
3. 提高土壤肥力土壤微生物是土壤中最有益的组成成分之一,它们通过分解有机物、固定氮、分解无机矿物质等,保持土壤肥力和生态环境的稳定性。
土壤中的细菌、真菌和放线菌和动物、植物及微生物形成了一个完整的生态系统。
其中,土壤微生物的功能起到了稳定这一土壤生态系统的重要作用。
二、土壤微生物的多样性1. 细菌多样性土壤中的细菌数量极其繁盛,其数量可能高达每克土壤数百万个,因此细菌是土壤微生物中的主要组成部分。
而细菌的多样性程度比较高,根据不同的生态环境,还可分成许多不同的类别,如硝化细菌、生物甲烷微生物、厌氧细菌等。
土壤中的细菌多样性对于保持土壤生态系统的稳定性非常重要。
2. 真菌多样性真菌也是土壤微生物中比较重要的一部分,代表了土壤中真菌的多样性。
真菌对于土壤有机物质的降解非常重要,同时也是许多植物的共生伙伴。
例如蘑菇、神经菌等,这些是土壤真菌中比较著名的代表。
土壤真菌的多样性对于维持土壤的生态环境和生态安全都有很大的意义。
土壤微生物研究方法

第二节 土壤微生物的计数与分析
• 一、培养计数法
•
根据培养基上所生长微生物的数量来 估算土壤中微生物的数量的方法
(一)一般微生物的分离与计数
• 稀释平板法
• 最大或然数法(MPN稀释法) • 土粒法
• 稀释平板法:
•
用已知质量的土壤在适量的溶液中搅拌的时候,微生 物和土壤分离,这些分开的微生物细胞在营养琼脂平板上 生长成为分散的菌落,根据菌落数换算得单位重量土壤中 微生物的数量。土壤中微生物的数量很多,因此必须取少 量样品制成土壤悬液,然后稀释,使发育在培养皿中的菌 落可以很好地分散开
测定是微生物在与野外环境完全不同的溶液 中的代谢活性,因此,也不能确定它的结果能 否反映土壤区系的实际代谢情况;
二、土壤微生物结构多样性分析
• 磷脂脂肪酸法也称为PLEA法 • (phospholipid fatty acid 法); • 磷酸脂肪酸是所有微生物细胞膜磷脂的组分,具有结构多 样性和较高的生物学特异性,用磷酸脂肪酸作为标记物来 研究鉴别土壤微生物群落结构多样性变化。
?土壤微生物细胞利用31种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如种碳源进行代谢以代谢过程产生的酶与四唑类显色物质如ttctv发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化发生颜色反应的浊度差异为基础运用独有的显性排列技术分析土壤微生物的代谢特征指纹图谱反映不同环境条件引起的土壤微生物群落变化?biolog测试板含有96个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性个小孔除对照外其余孔内分别含有不同的有机碳源和一种指示剂通过接种菌悬液根据微生物对碳源利用时指示剂颜色变化差异来鉴定微生物群落功能多样性该法优点?灵敏度高分辨力强?无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征无需分离培养纯种微生物可以最大限度地保留微生物群落原有的代谢特征?测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成测定简便数据读取与记录可以由计算机辅助完成?可以连续监测微生物的变化可批量分析该法缺点?特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用特别依赖于群体生理活性不能监测休眠体也不能检测那些不能利用biolog碳源底物的群体
土壤微生物分析方法

土壤微生物分析方法
一、引言
土壤是地球上肥沃的生活空间,也是物质循环的重要环节。
微生物在土壤中起着重要作用,它们参与着养分、水、氮的循环,帮助植物吸收养分和水,并发挥抗病虫、降解污染物等作用,是土壤生态系统中的重要组成部分。
随着科学技术的发展,目前的研究已经逐渐从单一微生物研究转变成研究其复杂而多样的群落,并且研究微生物群落的多样性和功能。
因此,准确研究土壤微生物以及其群落结构及功能,对于土壤环境的分析和调控有重要意义。
1、液体培养法
液体培养法是一种用于分析土壤微生物群落的常用方法,它的工作原理是在恒温的培养箱中,用有机物质和无机物质组成的培养基培养土壤中的微生物,并监测它们的生长。
培养基的组成成分可以根据需要变化,以考察特定微生物的生长情况及功能。
液体培养法可以清楚的显示不同类型的微生物群落的数量和组成,为分析其功能及其影响环境的作用提供重要的参考依据。
2、分子生物学技术
分子生物学技术包括核酸提取、PCR扩增、PCR测序等技术,主要用于检测土壤中的微生物群落结构,研究其适应性、多样性、抗药性等方面的知识。
微生物多样性的研究方法和应用

微生物多样性的研究方法和应用微生物是指眼不能见的微小生物,包括细菌、真菌、病毒和藻类等。
微生物广泛存在于地球上的各个角落,是地球上最重要的生物群落之一。
微生物的多样性研究对生态学、生物技术、医学等领域具有重要意义。
本文将介绍微生物多样性的研究方法和应用。
一、微生物多样性研究方法1、分子生物学方法分子生物学方法是对微生物多样性研究的主要方法之一。
该方法主要是通过分析微生物的DNA序列进行分类。
例如,通过对16S rRNA基因序列的测序可以研究并鉴定微生物群落中的细菌。
16S rRNA基因是细菌中所有菌种都具有的基因,其序列的差异可以用来辨识不同的菌属和种类,因此被广泛应用于微生物多样性研究中。
2、传统的形态学方法传统的形态学方法是对微生物多样性研究的常用方法之一。
这种方法通过研究微生物在形态上的差异进行分类。
例如,通过观察细菌在显微镜下的形态特点,可以分辨出不同的菌属和种类。
但是,这种方法的主要缺点是不能对细菌进行详细的鉴定和分类。
3、生化反应试验生化反应试验是对微生物分类和鉴定的重要方法之一。
生化反应试验的主要原理是当微生物接受某些化合物时,会发生特定的反应,如乳糖分解、葡萄糖分解等。
这些反应的差异可以用来辨识不同的微生物种类。
二、微生物多样性研究应用1、环境保护微生物在土壤、水体中具有重要的功能,如分解污染物和提高土壤肥力。
研究微生物多样性可以为环境保护提供重要的科学依据。
例如,通过分析水体中微生物的群落结构,可以推测出水体中的特定物质浓度和水质等级。
2、临床医学微生物是人类身体内的常见细菌,它们既能够维持生理平衡,也会引起人体多种疾病。
针对于微生物的研究在临床治疗和预防感染病方面具有很大的意义。
例如,通过研究肠道微生物群落的结构和功能,可以提供新的方法来治疗一些肠道相关疾病。
3、食品工业食品行业中的微生物研究主要是针对于食品中自然存在的微生物及与食品科学相关的新型微生物进行的。
这些研究可以提供新的方法,使食品更加安全。
土壤微生物生态学及其实验技术

土壤微生物生态学及其实验技术引言:土壤微生物是土壤生态系统中不可或缺的组成部分,对维持土壤生物多样性、循环养分、促进植物生长等起着重要作用。
土壤微生物生态学研究土壤微生物的多样性、功能和相互作用,探索其在土壤生态系统中的重要功能和生态过程。
本文将介绍土壤微生物生态学的基本概念和研究方法。
一、土壤微生物生态学的基本概念:1. 土壤微生物:土壤中的微生物包括细菌、真菌、放线菌和原生动物等。
它们广泛分布于土壤中,有不同的生理特性和功能。
2. 多样性:土壤微生物的多样性是指土壤中微生物的种类和数量。
多样性越高,土壤生态系统的稳定性越强。
3. 功能:土壤微生物具有多种功能,包括有机物分解、养分循环、固氮、抗病害等。
二、土壤微生物生态学的研究方法:1. 分离培养法:通过分离培养方法,可以获得纯培养的土壤微生物菌株,进一步研究其生理特性和功能。
2. 生物计量学方法:通过测定土壤微生物的生物量和活性,揭示土壤微生物的数量和功能特点。
3. 分子生物学方法:利用分子生物学技术,如PCR、DGGE等,可以研究土壤微生物的多样性和群落结构。
4. 同位素示踪法:通过同位素标记技术,可以追踪土壤微生物在土壤生态系统中的功能和相互作用。
5. 生态学模型:利用生态学模型,可以模拟和预测土壤微生物的分布和功能。
三、土壤微生物生态学的研究内容:1. 土壤微生物多样性:研究土壤微生物的多样性,探索其影响因素和生态功能。
2. 土壤微生物功能:研究土壤微生物的功能特点,如有机物分解、养分循环、固氮等。
3. 土壤微生物群落结构:研究土壤微生物的群落结构和变化规律,揭示其对环境变化的响应。
4. 土壤微生物与植物互作:研究土壤微生物与植物之间的相互作用,探索其对植物生长和健康的影响。
5. 土壤微生物生态功能评价:评价土壤微生物对土壤生态系统功能的贡献和稳定性。
结论:土壤微生物生态学是研究土壤微生物的多样性、功能和相互作用的学科,具有重要的理论和应用价值。
土壤微生物多样性调查方法与应用

土壤微生物多样性调查方法与应用土壤微生物是指土壤中的一种微小生物,经过千百年的演化,形成了生态系统这一整体。
土壤微生物具有调节土壤质量的作用,尤其是其中的细菌和真菌,可以分解和吸收有机物,促进植物生长。
因此,对于生态保护和农业发展有着重要的作用。
而调查土壤微生物多样性就成为了现代生态学研究的一大重点。
一、土壤微生物多样性调查的方法目前,针对土壤微生物多样性的调查方法主要有现场调查、分子生态学分析和计算机仿真等多种方法。
1. 现场调查法现场调查是一种传统的调查方法,也是许多生态学研究者经常使用的方法。
该方法主要是通过取样分析来确定土壤中生物的活动情况。
在土壤中选择样本进行物理化学分析,在基因型和表型上进行生物学分类,以确定微生物的种群结构和生态性状。
2. 分子生态学分析法分子生态学分析法是一种从分子水平上研究微生物多样性的方法。
该方法主要是通过分离DNA或RNA并进行放大、序列化,来确定微生物中特殊引物的种群结构和理解微生物之间的生物学关系。
与其他方法相比,该方法更为准确,可以发现更多的微生物群落,同时也提高了调查效率和准确度。
3. 计算机仿真法计算机仿真法是一种利用计算机模拟微生物多样性的方法。
其对科学学者进行详细的观察,不同的模拟形式可以得出不同的模拟结果。
该方法主要通过模拟计算机程序对微生物多样性数据的模拟分析,可以得到研究结果和结论,对研究微生物多样性的分析和比较,提高了研究快速性和深度。
二、土壤微生物多样性调查的意义1. 保护生态系统健康通过调查土壤中微生物多样性,可以评估土壤的生态质量,对于土壤生态疾病、物理和化学因素的影响有着重要的指导意义。
同时,可以对土壤质量进行科学监测,保护生态系统,维护生态平衡。
2. 提高土地利用率对于开发和利用耕地资源,了解土壤中存在的微生物的特征和生长情况,可以对其进行指导,提高土地利用率,增加农业生产效益,同时也可以保护土地生态系统的完整性。
3. 促进精准农业了解土壤中存在的微生物种类和分布情况,可以更好地利用先进的土壤检测技术,制定更为合理的农作物种植和肥料施用方案,从而提高农作物的产量质量,实现农业的可持续发展。
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EDTA 和
图 1 澳大利亚森林土壤中提取的土壤微 生物 DNA
Fig. 1 Soil microbial DNA extracted from Pine and Eucalyptus forest soils 2 桉树林土壤 3 松树林土壤 Line 1 1 kb ladder, Line 2 Eucalyputus forest in Mt. Ash, Line 3 Pine forest in Creswick 1 1kb 的分子量标记
土壤是一个固、 液、 气三相组 成的高度异质环 境, 发育着丰富的微生物群落 ( 主要有细菌、 放线菌 和真菌三大类) 。它们参与土壤生物化学过程、 有机 物的分解转化、 菌根的形成、 与植物互利共生以及对 生物多样性和生态系统功能的影响等, 在生态系统 中起着举足轻重的作用 。 虽然土壤微生物研究一直深受各国土壤学家和 生态学家的关注 , 但是, 长期以来土壤微生物的深入 研究受限于手段落后已是不争的事实 [ 4~ 7] 。比如 : 对于土壤细菌认识, 人们通常是通过先分离细菌细 胞再在培养基上培养、 鉴定菌落的方法 , 但事实上 , 土壤中只有少部分细菌可以通过此方法得到 , 而大 部分细菌是极难培养成功的 , 这使得许多土壤细菌 包含的大量遗传信息难以被发现 。土壤真菌和 放线菌也是一样 , 人们对它们的认识主要依赖于其 地上的果实体或分生孢子的形态 , 而现实中的许多 真菌和放线菌的菌丝体在土壤中处于休眠或不活动 状态 , 用常规调查方法只能了解到其中的一小部分 , 很难得 到大多数 种类的 信息[ 1, 5, 7~ 10] 。所以 , 方法 的局限性, 造成了人们全面了解和深入研究土壤微 生物多样性的主要障碍。 近些年来, 把分子生物学技术运用在土壤微生 物生态学的研究 , 使人们可以避开传统的分离培养 过程, 通过 DNA 水平上的研究 , 直接探讨土壤微生
104
土
壤
学
报
41 卷
壤微生物多样性的分析时 , 采用最近几年发展起来 的 T RFLP ( 末 端限 制 性酶 切片 段长 度多 态 性 ) 技 术[ 4, 12, 13] 。
DNA 的纯度和产量可通过 1% 琼脂糖凝胶电泳 来检测, 结果如图 1。电泳显示 DNA 片段分子量大 于 10 000 bp ( basepair 碱基对 ) , 表明已获得较大片 段的土壤微生物 DNA。
- 1 -1 [ 3, 5, 9, 10]
1期
马万里等: 土壤微生物多样性研究的新方法
105
DNA 的 ITS 区域都是研究土壤微生物多样性非常重 要的目标区域[ 3~ 5, 7] 。T RFLP 就是根据样品中的这 些目标区域 DNA 序列的不同或变化, 进行 PCR 扩增 后得到目标 DNA 片段 , 酶切后将会产生不同长度的 限制性片段。由于 T RFLP 方法是把目标 DNA 片段 的一个末端 ( 通常是 5 端) 用荧光引物标记, 这样在 酶切后 , 分析的目标只限于有荧光标记的末端限制 性片段上。酶切后产生长度不等的末端限制性长度 片段在单一泳道上分离, 并经 ABI 自动测序仪上检 测和计算后, 输出末端限制性片段的大小和强度图。 泳道上分离的酶带越多, 或测序仪上输出不同的波 峰越多 , 则表明微生物种类越多。通过比较不同样 品间的异同 , 该方法能为评估土壤微生物多样性提 供更敏感的数量化基础。 同时 , 通过 ABI 自动测序仪对任何一末端限制 性片段的测序, 并与 Internet 中的数据库的数据进行 比较分析 , 可以来确定其系统分类地位[ 7, 15] 。
- 1 - 1 - 1
1 2 3 PCR 扩增和目标 DNA 的确定
电泳 ( 图
1) 显示的 DNA 片段中还可能包含其它生物的 DNA, 如土壤中原生动物 DNA、 细菌 DNA 、 高 等植物根系 [ 1] 以及昆虫 DNA 。因此 , 必须用专一的特异性探针 或引物来验证获得的 DNA 中是否含有目标 DNA, 即 真菌 DNA。 真菌核糖体( Ribosomal ) DNA 的 ITS 区域( Inter nal transcribed spacers 内转录间隔区 ) 是 一个非常重 要的目标 区域, 用真菌 特异性 引物进 行的 PCR 扩 增, 可以用作真菌的定性、 真菌的生物多样性、 分子 生态学和真菌系统学等方面的 研究 。本文 用到的一对特异性引物是 ITS1 和 ITS4[ 10, 11] 。 PCR 反应体系 40 l, 最终浓度为 : 0 2 mmol L- 1 dNTP, 0 5 mmol L ITS1 和 ITS4 引物 , 2 mmol L MgCl2 , 75 mmol L - 1 Tris HCl ( pH 8 5 ) , 0 1 g L- 1 Tween 20, 20 mmol L- 1 ( NH 4) 2 SO4 , 1U Taq 酶, 加 1 40 DNA 样品。PCR 循环 : 85 下热启动 , 94 预变性 3 min; 94 变 性 1 min, 55 退 火 1 min, 72 延 伸 2 min( 共 35 个循环) ; 72 再延伸10 min。 1 5% 琼脂糖凝胶电泳 PCR 反应产物, 结 果见 图 2, 表明从真菌 rDNA ITS 区域扩增所得的 PCR 产 物大小范围是 850~ 950 bp, 是真菌的目标 rDNA 片 段。 1 3 T RFLP 及其基本原理 土壤 细 菌的 16S 核糖 体 DNA 和 真 菌核 糖 体
三羟 甲 基 氨基 甲 烷 , pH 8 0) , 混 合 5
min, 再 加 入 500 mg PVPP ( 聚 乙 烯 吡 咯 烷 酮 ) , 100 l 50 mg ml- 1 溶菌酶 ( Lysozyme) 和 100 l 100~ 250 mg ml- 1 glucanase( 葡聚糖酶 ) , 混合后放置冰 上 2 h。( 2) 加入细胞溶解提取液( 3 8 ml 4% SDS, 100 m mol L- 1 EDTA, 50 g ml- 1 k 蛋白酶和 50 mmol L- 1 Tris pH 8 0) , 混合后放置冰上 16 h 。( 3) 离心 8 min ( 4 , 5 000g, Beckman, J2 Mc centrifuge) , 上清液 转到 30 ml 新 管中 ; 加入 2 ml 洗液 ( 50 mmol L Tris 和 100 mmol L- 1EDTA ) , 充分混合后离心 ; 再用 洗液 重 复 一 次。 ( 4) 集 中 全 部 的 上 清 液 , 加 入 3 mol L KOAc ( 醋酸钾 ) 调整浓度至 0 5 mol L , 置冰上 2 h, 离心 12 min( 4 , 15 000 g) 。( 5) 留上清 液, 加入两倍体积的 100% 乙醇, 放置 16 h( - 20 ) 。 离心 12 min( 4 , 15 000 g) , 将沉淀的 DNA 溶于 300 l TE 缓冲液 ( 10 mmol L- 1 Tris, 1 mmol L- 1 EDTA, pH 8 0) 。 1 2 2 DNA 纯 化 由 于 粗 DNA 样 品 中 含有 RNA、 蛋白 质、 糖类以 及腐殖 质等 , 会 影响 PCR 反 应, 本文采用 CsCl ( 氯 化铯) 和 KOAc( 醋酸 钾) 法来 纯化粗 DNA[ 2, 14] 。 ( 1) 300 l DNA 加入 0 3 g CsCl, 混合后放置3 h, 离心 20 min( 14 000 g, 室温) 。 ( 2) 收集上清液 , 加入 无菌水和冰异丙醇, V上清液 V水 V冰异丙醇 = 1 4 3, 混 合后放置 15 min, 再离心 15 min, 沉淀的 DNA 溶于 500 l TE 缓冲液。( 3) 加入 100 l 8 mol L- 1 KOAc 溶液 , 放置 15 min, 离心 15 min( 14 000 g, 室温) , 收 集上清液, 加入 0 6 体积冰异丙醇, 轻轻混合后置于 冰上 10~ 20 min。离心 10 min, 沉淀的 DNA 用 70% 乙醇冲洗后, 溶于 500 l 的 TE 缓冲液( pH 8 0) 。
作者简介 : 马万里 ( 1963~ ) , 男 , 汉族 , 内蒙古集宁市人 , 博士 , 教授 , 硕士生导师。研究方 向生态学 , 目前主 要从事生态学 和植物学 的教学 或科研工作。 E mail: wanli ma@ hotmail com 收稿日期 : 2002- 10- 21; 收到修改稿日期 : 2003- 05- 10
第 41 卷 第 1 期 2004 年 1 月
土
壤
学
报
Vol 41, No 1 Jan. , 2004
ACTA PEDOLOGICA SINICA
土壤微生物多样性研究的新方法
马 万
Josquin Tibbits
里
010022)
( 内蒙古师范大学生物系 , 生物多样性保护研究中心 , 呼和浩特
Mark Adams
1
1 1
பைடு நூலகம்
材料和方法
土壤样品 两种土壤样品, 一种采于澳大利亚 Creswick 的
松树林 , 另一种采于澳大利亚 Ash 山的桉树林。取 5~ 15 cm 层的土样, 置于冰盒内待测。 1 2 方法 1 2 1 DNA 提取程序 ( 1) 1 g 土壤样品中加入 - 1 6 ml 提取 液 ( 0 5 mol L 葡 糖 醇, 15% 聚 乙 二醇 6 000, 2% 焦 碳 酸 二 乙 脂, 100 mmol L50 mmol L
[ 7, 8] [ 1~ 3]
物的种群结构及其与环境的关系。只要各种微生物 的靶核酸序列 ( 即 DNA) 存在 , 即使含量低 , 或者存 在于复杂的混合物 ( 如土壤中各类微生物的细胞提 取液 ) 中, 通过 PCR 技术也能够把它们 扩增和检测 出来。目前涌现出许多用于研究土壤微生物多样性 和生态学的技 术, 比如: ARDRA ( Amplified ribosomal DNA restriction analysis) , SSCP ( Single Strand Confor mat ion Polymorphism) , RFLP ( Restriction fragment length polymorphism) , Sequencing , DGGE ( Denaturing gradient gel electrophoresis) 和 T RFLP ( T erminal restriction frag ment length polymorphism) 等。这些技术和方法 的采 用, 使得在土壤微生物多样性、 微生物种群的结构和 功能、 土壤微生物的系统发生和分类、 土壤微生物与 污染土壤的相互作用及影响等多领域的研究上得以 突破 , 发挥了传统方法所不能替代的作用[ 3~ 7] 。 但是 , 这些方法成功的首要问题是能否获得高 质量和高纯度的 DNA、 提取的 DNA 能否更好地代表 土壤微生物群落的真实性和异质性 , 而尽可能包含 有大多数微生物的 DNA 。所以, 一个能直接从土壤 中提取微生物 DNA 的快速而高效的方法是迫切需 要的。 本文采用的 DNA 提取方法是在文献 [ 1, 10, 11] 的基础上 , 经改进后 , 用于澳大利亚 Pine 森林和 Eu calyptus 森林土壤真菌 DNA 的提取和纯化。在对土