灵芝菌体液态深层发酵条件的优化

灵芝菌体液态深层发酵条件的优化
毛健1,2，马海乐1,*
【摘要】研究摇瓶灵芝菌体液态深层发酵温度和初始pH值，在此基础上进行5L发酵罐批次培养，研究发酵过程pH值控制、溶氧控制对灵芝菌体生长和灵芝胞外多糖的影响。

结果表明：发酵温度30℃，初始pH值为6.0；过程pH 值控制策略：菌体生长前期(0～40h)控制pH值为5.5，40～48h控制pH 5.0，48h后至发酵结束控制pH4.5；溶氧控制策略为：搅拌转速160r/min，通风量0.75vvm。

优化后的验证实验结果：灵芝菌体生物量最高达到19.7g/L，胞外多糖最高达到3.23g/L，较优化前灵芝菌体生物量12.8g/L和灵芝胞外多糖2.39g/L分别提高了53.9%和35.1%。

【期刊名称】食品科学
【年(卷),期】2009(030)023
【总页数】6
【关键词】灵芝胞外多糖；液态深层发酵；pH值；溶氧；条件优化
灵芝(Ganoderma lucidum)为担子菌纲、多孔菌科属高等真菌，是一种珍贵的药用真菌，具有调节免疫[1-2]，抗肿瘤活性[3-4]，延缓衰老[5]等作用。

灵芝多糖一般是从灵芝菌的子实体、菌丝体、发酵液中分离出的、由10个以上单糖单元构成的高分子聚合物[6]，胞外多糖和胞内多糖主要利用深层培养技术大规模生产灵芝菌丝体并从中获取灵芝胞外多糖等有效成分，较传统子实体培养，具有周期短、成本低、产量大、操作方便的特点，已成为当前真菌多糖开发的热点之一。

影响灵芝液态深层培养的因素很多，如发酵培养基组成[7-8]、接种量[9]、发酵
培养温度[10]、pH值[11]和溶氧[12]。

其中，pH值对灵芝生长和胞外多糖合成影响很大，pH值可影响代谢途径中各种酶系的活性，发酵过程中pH值的优化控制能够较大幅度提高菌丝体和胞外多糖的产量，而这类研究目前不多，且其中大部分研究停留在初始pH值的控制上，发酵过程未加以控制。

溶氧也是重要的影响因素之一，深层培养供养状况对菌体生长和胞外多糖积累有重要意义。

通气和搅拌可以保证氧气的溶解性，充分和细胞接触，以便更好的吸收液体中的氧气，有利于微生物的代谢[13]。

真菌液态深层培养对搅拌速度要求很高，过高的转速不但能耗增大，而且会损伤菌体，造成菌丝过细，还可引起菌体自溶或减产等，而且剧烈的搅拌还会造成泡沫的增加，影响发酵体积，从整体上影响发酵产量。

因此，一般采用较低的搅拌速度来降低剪切力。

对发酵液中的溶氧来说，搅拌与通气是相辅相成、相互作用的。

低搅拌速度不能满足菌体对氧气的需要，需要同时提供必要的通气量[14-15]，来满足菌体生长的氧需求。

因此为了满足在培养过程中菌球能紧密生长，提高传质常数，有必要对灵芝菌体液态发酵过程的操作条件进行优化。

本实验在前期工作的基础上，利用摇瓶实验确定灵芝发酵温度、时间和初始pH值，在此基础上进行5L发酵罐批次培养，着重研究过程pH值控制、溶氧控制对灵芝菌体生长和胞外多糖的影响。

1 材料与方法
1.1 材料与试剂
灵芝(Ganoderma lucidum GL0811)为本实验室保藏菌种，每两月传代一次，4℃保藏。

PDA培养基：马铃薯200g/L、葡萄糖20g/L、蛋白胨2g/L、KH2PO42g/L、
MgSO4·7H2O 1g/L、琼脂20g/L。

种子培养基：葡萄糖20g/L、蛋白胨2g/L、KH2PO42g/L、MgSO4·7H2O 1g/L、玉米浆15g/L、pH自然。

发酵培养基：葡萄糖47.4g/L、蛋白胨 4.39g/L、KH2PO43.76g/L、MgSO4·7H2O 1g/L和玉米浆 15g/L，pH值依据实验而定。

1.2 仪器与设备
HYG-11型回转式恒温调速摇柜上海新星自动化控制设备；超净工作台苏州净化设备厂；LS-B50型立式圆形压力蒸汽灭菌上海医用核子仪器厂；101-2型电热鼓风干燥箱上海IKA仪器公司；隔水式电热恒温培养箱上海市跃进医疗器械一厂；BUCHI R-200真空浓缩仪瑞士Buchi公司；HITACHI CR22G高速离心机日本Hitachi公司；SIGMA高速离心机美国Sigma公司；Biostat C10-3型5 L搅拌式发酵罐德国博朗公司。

1.3 方法
1.3.1 培养方法
种子培养：将斜面菌种分割成蚕豆粒大小的小块接种2～3块到液体种子培养基中，250ml三角瓶装液量50ml，置于旋转式摇床上，160r/min、30℃培养3～4d供各种实验用。

摇瓶培养基本条件：培养好的种子液以接种量10%～15%(V/V)接种于500ml 摇瓶，装液量150ml，160r/min，发酵培养基、时间、温度及初始pH值需要摇瓶实验确定。

5L发酵罐培养基本条件：5L搅拌式微生物发酵罐，装料系数为0.7，接种量为10%，以摇瓶培养温度、初始pH值作为发酵罐培养温度和初始pH值，通气
量和搅拌转速需要实验确定。

在发酵过程中，每隔8h取样，观察菌体形态，测定菌体生物量、胞外多糖含量。

1.3.2 灵芝菌丝体生物量的测定
采用干重法。

取发酵液100ml，在4℃以10000r/min高速离心10min，收集沉淀物，将分离后的沉淀于100目尼龙网上用蒸馏水洗涤多次，然后置于干燥箱中在70℃条件下干燥至恒重为止。

各测定指标测定两次，取其均值。

1.3.3 灵芝胞外多糖的测定
发酵液离心后所得滤液进0.45μm滤膜过滤，浓缩后，加入3倍体积无水乙醇，剧烈搅拌，4℃过夜沉淀，高速离心醇沉液，收集沉淀，置于干燥箱70℃烘至恒重，所得即为胞外多糖含量。

各测定指标测定两次，取其均值。

1.3.4 葡萄糖的测定
3, 5- 二硝基水杨酸比色定糖法(DNS法)[16]。

2 结果与分析
2.1 灵芝胞外多糖摇瓶发酵培养条件优化
2.1.1 摇瓶液体发酵温度对发酵的影响
将已发酵好的二级摇瓶种子转接到盛有200ml发酵培养液的500ml三角瓶中, 接种量10%，在160r/min 摇床上分别于26、28、30及32℃发酵培养5d，测定菌体生物量和胞外多糖含量。

选取25、28、30、32及35℃进行试验，结果见图1。

由图1可知，温度对灵芝胞外多糖发酵影响较大，在低于28℃或高于32℃时，无论是菌体生长还是胞外多糖生成都下降较大，而且发酵时间延长，因此选择灵芝胞外多糖深层发酵的适宜温度为30℃。

2.1.2 摇瓶液体发酵初始pH值对发酵的影响
将液体发酵培养基的初始pH分别调节为3、4、5、6、7，按照摇瓶基本条件，进行摇瓶培养，测菌体生物量和胞外多糖含量，结果见图2。

菌丝体生长、胞外多糖分泌与pH值紧密相关，在pH6.0时胞外多糖最高，为1.8g/L，菌体生物量为8.1g/L。

同时，作者还发现灵芝菌株在初始pH5.0～6.0发酵培养基中，菌体生长迟滞期相对较短，综合考虑，选择最佳初始pH值为6.0。

2.2 灵芝胞外多糖分批发酵条件优化
参考上述灵芝胞外多糖摇瓶发酵数据，应用到灵芝胞外多糖分批发酵实验。

进行分批发酵的目的在于探索实验菌株在发酵罐条件下的生理学特性与发酵动力学参数，为灵芝胞外多糖的高密度发酵的代谢调控奠定基础。

2.2.1灵芝胞外多糖分批发酵培养pH值控制策略
2.2.1.1 在未控制pH值条件下，利用发酵罐生产灵芝胞外多糖
依据摇瓶实验数据确定5L发酵罐培养初始pH 6.0，发酵过程不控制pH值，采用5L自控发酵罐进行液态深层分批发酵，装料系数为0.7，接种量为10%，以摇瓶培养温度30℃、作为发酵罐培养温度。

在发酵过程中，每隔8h取样，测定pH、菌体生物量和胞外多糖含量。

在未控制pH值条件下，发酵罐培养96h，结果如图3所示。

0～16h为延滞期，16～48h为对数期，48～80h为稳定期，而从80h开始进入衰亡期。

在48h时，灵芝菌体生物量达到最高12.8g/L；而胞外多糖合成明显滞后于菌体生长，多糖合成高峰期出现在40～80h，72h时，灵芝胞外多糖为最高2.39g/L。

从图3还可以发现，菌丝体的生长和胞外多糖生产的最适pH值并不一致，发酵液pH值在5.0～6.0，适合菌体生长；而发酵液pH值在4.0～4.5
更利于灵芝胞外多糖的产生，因此，可以考虑发酵前期追求高生物量，中后期追求高胞外多糖量的策略。

2.2.1.2 分段控制pH值，利用发酵罐生产灵芝胞外多糖
设计分段控制pH值，用5mol/L NaOH或HCl溶液调节pH值，菌体生长前期(0～40h)控制pH值为5.5，40～48h控制pH5.0，48h后至发酵结束控制pH值为4.5，其他条件不变，结果如图4所示。

由图4可知，菌丝体生物量在56h达到最高为15.1 g/L，胞外多糖含量在80h 达到最高为2.76g/L，与未控制pH值发酵所得灵芝菌体生物量和胞外多糖分别提高了17.9%和15.5%。

2.2.2 灵芝胞外多糖分批发酵培养溶氧控制策略
灵芝菌是好氧微生物，它的生长代谢过程需要氧气的参与，溶解氧浓度对菌体的生长和产物生成的影响很大。

在真菌发酵过程中，保证氧的供给，满足生产菌对氧的需求是提高发酵产量的重要因素。

2.2.2.1 搅拌转速对灵芝菌体生长和胞外多糖生成的影响
灵芝菌丝体的新陈代谢需要吸收氧气。

搅拌的目的是保证最好的氧溶解性，并和细胞接触，以便更好地吸收液体中的氧气，还可除去二氧化碳和代谢产物。

设定120、160、200r/min 3种不同转速，其他条件固定，温度为30℃，恒定pH5.0(用5mol/L KOH或HCl溶液调节)，考察不同转速对灵芝菌体生长和胞外多糖生成的影响。

从图5可知，相同的通风量下，搅拌转速在120～160r/min内，随着搅拌速度的增加菌丝体量不断提高。

其中搅拌转速为160r/min时，灵芝菌丝体量增长最快，并且产率最高，发酵到第3d菌丝体生物量达到16.2g/L。

但搅拌转速继续提高(200r/min)后，菌丝体生物量有所下
降，可能是由于高搅拌转速条件下，剪切作用力较大，菌丝体易被打断，造成细胞损伤，不利于菌体生长。

类似的生长趋势也表现在灵芝胞外多糖的得率上(图5)，灵芝经过近3d的培养适应期，开始大量分泌胞外多糖，在转速160r/min下培养4d，灵芝胞外多糖得率达到最大2.86 g/L，而其他转速(120，200r/min)条件下，胞外多糖的最大产率分别为2.21g/L和2.46g/L，灵芝胞外多糖的积累并未随着搅拌速度的提高而增加。

发酵过程中各转速条件下，溶氧的消耗规律基本相似，发酵前期，灵芝生长处于迟滞期，溶氧变化小，进入快速生长期溶氧下降迅速，表明此时细胞的摄氧速率明显高于发酵液中的供氧速率。

进入稳定期后，相对溶氧值一直保持在较低的水平(小于20%)。

发酵过程中培养基中还原糖的浓度是伴随着生物量的增加而降低的。

图5中可以看到发酵液中还原糖消耗的趋势，在转速为160r/min时，还原糖的消耗速度最快，这也跟灵芝菌丝体生物量增值相对应。

不同转速条件下，灵芝发酵动力学参数如表1所示，在160r/min和200r/min下取得菌丝体平均生长速率，分别为0.14375h-1和0.12292h-1，而对于胞外多糖，则在160r/min时过程平均比增加得率最大，达到0.02833h-1。

因此，综合考虑搅拌转速选择160r/min。

2.2.2.2 通气量对灵芝菌体生长和灵芝胞外多糖生成的影响
在好氧培养过程中，溶氧浓度是一个非常关键的控制参数，通气可以使底物、代谢产物、副产物和氧气得到更好的传递以及使有关的微生物细胞发挥更好的作用，特别是对丝状真菌发酵的影响尤为明显，其中通气量对发酵醪的溶氧浓度起到直接的作用。

在温度30℃，转速160r/min的条件下，不同的通气量对
灵芝生长的影响如图6所示。

由图6可知，在通气量为0.5、0.75、1.0vvm时，最大菌丝体量分别为为12.8、14.1和16.3g/L，较高的通气量比较有利于菌丝体的生长。

通气还有利于代谢过程中产生的废气的去除和细胞内微环境的副产品代谢。

空气供给有利于细胞生长所需O2的供给，它对高生物量浓度的形成是非常重要的(图6)。

在通气量为0.5、0.75、1.0vvm时，最大胞外多糖得率为2.24、2.82、2.69g/L，图6结果表明获得最大胞外多糖得率的最适通气量为0.75vvm，胞外多糖量达1.394g/L。

从图6中可以看出，当通气量为0.5vvm时，不足量的O2供给明显地使灵芝胞外多糖产量降低，最大值为2.24g/L，可能是因为在此供氧条件下，只有局部环境下的细胞能够在满足维持自身正常代谢的条件下进行活性物质的生产与转化，而较多的细胞只能勉强维持自身的生存；但是在
1.0vvm的通气量下，过量的O2供给也导致灵芝胞外多糖产量的降低
(2.69g/L)，可以看出较高或较低的通气量均不利于胞外多糖的分泌。

对于还原糖的消耗以及发酵过程溶氧的变化，基本与搅拌转速的影响趋势相一致，通气量加大，发酵液中还原糖消耗的更为彻底，与灵芝菌丝体及胞外多糖得率的增加相对应。

灵芝菌发酵进入稳定期后，通气量在0.5vvm时相对溶氧维持在较低水平(小于10%)，不能满足菌体生长和胞外多糖生成所需氧量；而通气量在0.75vvm和1.0vvm时相对溶氧控制在10%～20%之间，基本满足菌体生长和胞外多糖的合成。

不同通气量条件下，灵芝发酵动力学参数如表2所示，在1.0vvm下取得菌丝体平均生长速率最大为0.14375h-1，而对于胞外多糖，则在0.75vvm时过程平均比增加得率最大，达到0.02096h-1。

因此，综合考虑选择通气量为
0.75vvm。

2.2.3 灵芝胞外多糖分批发酵条件优化验证实验
参考试验菌株的生理学特性和分批发酵的有关数据，通过补料分批发酵的方式进行了灵芝胞外多糖的高密度发酵。

整体发酵的思路是：发酵前期追求高生物量，中后期追求高胞外多糖量。

具体策略：5L自控发酵罐进行液态深层分批发酵，以响应面试验确定的培养基作为发酵培养基，装料系数为0.7，接种量为10% ，培养温度30℃，用5mol/L NaOH或HCl溶液调节pH值(菌体生长前期(0～40h)控制pH值为5.5，40～48h控制pH 5.0，48h后至发酵结束控制pH为4.5)，搅拌转速160r/min，通气量为0.75vvm。

发酵条件优化对补料分批发酵灵芝生长和胞外多糖生成的影响如图7所示。

由图7可知，发酵条件优化后对灵芝菌体生物量和胞外多糖的产量较优化前(图3)有了显著的提高，优化后的灵芝菌体生物量最高达到19.7g/L，胞外多糖最高达到3.23g/L，较优化前灵芝菌体生物量12.8g/L和灵芝胞外多糖2.39g/L 分别提高了53.9%和35.1%。

3 结论
本实验通过摇瓶实验，确定灵芝菌液态深层发酵温度30℃，初始pH值为6.0；通过批次发酵实验确定5L发酵罐pH值控制策略：用5 mol/L NaOH或HCl 溶液调节pH值，菌体生长前期(0～40h)控制pH5.5，40～48h控制pH5.0，48h后至发酵结束控制pH4.5；溶氧控制策略为：搅拌转速160r/min，通风量0.75vvm。

优化后的验证实验结果：灵芝菌体生物量最高达到19.7g/L，胞外多糖最高达到3.23g/L，较优化前灵芝菌体生物量12.8g/L和灵芝胞外多糖
2.39g/L分别提高了5
3.9%和35.1%。

参考文献：
[1]ZHANG J, TANG Q, MARTIN Z K, et al. Activation of B lymphocytes by GLIS. a bioactive proteoglycan from Ganoderma lucidum[J]. Life Sciences, 2002, 71(6): 623-638.
[2]WANG Y, KHOO K, CHEN S, et al. Studies on the immuno-Modulating and antitumor activities of Ganoderma lucidum (Reishi) polysaccharides: functional and proteomic analyscs of a fucose-Containing glycoprotein fraction responsible for the activities[J]. Bioorganic & Chemistry Medicinal, 2002, 10(4): 1057-1054.
[3]BACK S, KIM Y, YONG H, et al. Antitumor activities of the proteoglycans from the mycelium of Ganoderma lucidum IY009[J]. Yakhak Hoechi, 2001, 45(6): 641-649.
[4]LEE S, LEE P, CHEN C, et al. Antitumor effects of polysaccharides of (Curt.:Fr) P.Karst.(Ling Zhi, Reishi mushroom)(Aphyllophoromycetideae) [J]. International Journal of Medicinal Mushroom, 2003, 5(1): 1-16. [5]BAO X F, WANG X S, DONG Q, et al. Structural features of immunologically active polysaccharides from Ganoderma luncidum[J]. Phytochemistry, 2002: 59(2): 175-181.
[6]郝瑞芳, 景浩. 真菌多糖的研究进展[J]. 中国食物与营养, 2008(4): 19-22．
[7]TANG Y J, ZHANG J J. Fed-batch fermentation of Ganoderma lucidum for hyperproduction of polysaccharide and ganoderic acid[J]. Enzyme
and Microbial Technology, 2002, 31: 20-28.
[8]FANG Q H, ZHONG J J. Submerged fermentation of higher fungus Ganoderma lucidum for production of valuable bioactive metabolitesganoderic acid and polysaccharide[J]. Biochemical Engineering Journal, 2002, 10: 61-65.
[9]FANG Q H, TANG Y J, ZHONG J J. Significance of inoculation density control in production of polysaccharide and ganoderic acid by submerged culture of Ganoderma lucidum[J]. Process Biochemistry, 2002, 37: 1375-1379.
[10]LEE H Y, SONG M K, HWANG S H. Optimizing bioconversion of deproteinated cheese whey to mycelia of Ganoderma lucidum[J]. Process Biochemistry, 2003, 38(12): 1685-1693.
[11]LEE K M, LEE S Y, LEE H Y. Bistage Control of pH for improving exopolysaccharide production from mycelia of Ganodema lucidum in an air-lift fermentor [J]. Journal of Bioengineering, 1999, 88(6): 646-650. [12]TANG Y J, ZHONG J J. Role of oxygen supply in submerged fermentation of Ganoderma lucidum for production of Ganoderma polysaccharide and ganoderic acid[J]. Enzyme and Microbial T echnology, 2003,32: 478-484.
[13]CUI Y Q, VANDER L R G J, LUYBEN K C. Effects of dissolved oxygen tension and mechanical forces on fungal morphology in submerged fermentation[J]. Biotech Bioeng, 1998, 57(4): 745-790.
[14]MARIA P. Fungal morphology and metabolite production in submerged mycelial processes[J]. Biotech Adv, 2004, 22: 189-259. [15]FENG Y Y, HE Z M, ONG S L, et al. Optimization of agitation, aeration, and temperature conditions for maximumβ-mannanase production[J]. Enzyme Microb Tech,2003, 32: 282-289.
[16]李巧枝, 董淑丽. 生物化学实验技术[M]. 北京: 气象出版社, 2002: 51-52.
基金项目：国家“863”计划项目(2007AA10Z346)
*通讯作者：马海乐(1963-)，男，教授，博士，主要从事食品功能因子与食品生物技术研究。

E-mail：mhl@。