荧光分析法测定水中的氨氮的含量

实验二荧光分析法测定水中氨氮的含量
1.实验目的
通过本实验课程的学习和操作，了解荧光分析法的测定原理，掌握水样中氨氮含量的测定方法和原理；并熟练掌握荧光分光光度计的实验操作步骤。

2.实验原理
2.1方法原理
水中的氨氮与邻苯二甲醛（o-Phthaldehyde, OPA）、亚硫酸钠在碱性介质中反应，生成具有荧光性的异吲哚衍生物。

当其吸收了外界能量后，能发射出一定波长和强度的光称为荧光。

外界提供能量的方式有多种，通过光照射激发产生的荧光称为光致荧光。

由于不同的物质其组成与结构不同，所吸收光的波长和发射光的波长也不同，利用这两个特性参数可以进行物质的定性鉴别。

一定的条件下，如果物质的浓度不同，它所发射的荧光强度就不同，两者之间的定量关系可用下式表示:
I F=KC
式中: I--能发荧光物质的荧光强度;
C--能发荧光物质的浓度;
K--定条件下的常数。

当激发光强度、波长、所用溶剂及温度等条件固定时，物质在一定浓度范围内，其发射荧光强度与溶液中该物质的浓度成正比，测量物质的荧光强度可对其进行定量分析。

荧光分析法就是利用物质的荧光特征和强度，对物质进行定性和定量分析的方法。

2.2仪器原理
利用荧光进行物质定性定量分析的仪器有荧光计和荧光分光光度计,本次实验所用的是荧光分光光度计，其基本原理是:采用氙灯作光源，通过狭缝经光栅分光后照射到被测物质上，发射的荧光用光电倍增管检测，经放大后由数据采集系统记录结果。

该仪器由四个基本部分组成田，即激光光源、样品池、用于选.
择激发波长和荧光波长的单色器或滤光片、检测器。

3.仪器与试剂
3.1仪器
F97pro荧光分光光度计（配1 cm试样池），移液管，比色管，烧杯，废液缸3.2试剂
氨氮标准使用液（100.00 μmol/L），亚硫酸钠溶液（10 .00mmol/L），四硼酸钠溶液（10.00 g/L），OPA溶液（25.00 mmol/L），超纯水，未知水样2。

4.实验步骤
4.1 标准工作曲线的配制
4.1.1取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00mL氨氮标准使用液标样于比色管中，用超纯水定容至2
5.00 mL。

4.1.2分别加入四硼酸钠溶液、亚硫酸钠溶液和OPA溶液，各1.00mL，混匀后静置30min。

4.1.3 在波长423.00nm条件下测定标准样品的荧光值，绘制标准工作曲线（计算中忽略加入衍生试剂的体积）。

4.2 待测样品浓度的测定：取1.00mL待测样品稀释到2
5.00 mL，衍生处理与上述步骤相同（每个样品做两个平行样）。

4.3根据标准工作曲线计算待测水样中氨氮的含量。

5.数据与结果
5.1标准工作曲线
在波长423.00nm条件下对不同浓度的水样溶液进行荧光值测定，得到标准工作曲线的测定结果和回归方程分别如图1和表一所示：
图1标准工作曲线
Fig.1 Standard work curve
表 1标准工作曲线的测定结果
Tab. 1 Determination of standard working curve
水样2体积/mL氨氮浓度/μmol/L荧光值
0.00 0.00 53.74
1.00 0.02 206.59
2.00 0.04 417.19
3.00 0.06 730.10
4.00 0.08 920.20
氨氮浓度的计算过程：根据公式C1×V1=C2×V2V1——加入氨氮溶液体积
V2——25.00 mL
C1——100 μmol/L
C2——待计算
5.3样品测定
取1.00 mL待测样品稀释到25.00 mL,衍生处理与上述步骤相同，每个样品
做两个平行样，测定结果如表2所示：
表2水样测定结果
Tab.2The results of Water sample determination
序号荧光值
1 199.50
2 217.30
根据线性回归方程，y=11282x+14.278（y为荧光值，x为氨氮的浓度）得，所测水样浓度C1,C2：
C1=(y-14.278)/11282=(199.50-14.278)/11282=1.64*10-2μmol/L;
C2=(y-14.278)/11282=(217.30-14.278)/11282=1.80*10-2μmol/L;
C=(C1+C2)/2=1.72*10-2μmol/L
因为被测溶液是由V1=1.00 ml稀释成V2=25.00 mL而得到的，根据公式：
C3/V2=⎺C/V1,即C3=⎺C*V2/V1=0.02*25/1=0.43 μmol/L
因此水样中的氨氮的浓度为0.43μmol/L 。

6.思考问题
6.1荧光分析法与紫外-可见分光光度法同样可以对水体中的氨氮进行测定，本实验选择荧光法分析的优点在哪里？
答：①分子荧光分析法是光与物质分子作用, 荧光分析法属于发光分析（只有在特定的条件下物质才会发出荧光）；而紫外-可见吸收光谱分析法是光与物质分子外层价电子作用,紫外-可见吸收光谱分析法属于吸光分析（很多物质都可以对光产生吸收）;②荧光分析法是在入射光的直角方向测定荧光强度,即在黑背景下进行检测,因此可以通过入射光强度或者增大荧光信号的放大倍数来提高灵敏度；而紫外-可见法中测定的参数是吸光度,该值与入射光强度和透射光强度的比值相关,入射强度增大,透射光强度也随之增大,增大检测器的放大倍数也同时影响入射光和透射光的检测,因而限制了灵敏度的提高。

6.2 在实验过程中，有同学建议将本实验的操作方法改为“加入1.00 mL的氨氮
使用液后用超纯水稀释至20 mL左右，再加入衍生试剂，最后用超纯水定容至终点体积25.00 mL”，请探讨此建议的合理性及适用范围。

答：氨氮使用液与衍生试剂发生的反应是在水样中加入邻苯二甲醛后，氨氮与邻苯二甲醛在碱性条件下发生配位反应，生成的异吲哚配位衍生物具有荧光特性，可以被分子荧光仪检测到荧光信号。

其主要反应OPA溶液作为显色剂，四硼酸钠溶液为缓冲剂提供碱性环境，亚硫酸钠溶液为增稳增敏剂。

加入1.00 mL 的氨氮使用液后用超纯水稀释至20 mL左右时，再加入衍生试剂，一定程度上有利于氨氮与邻苯二甲醛充分反应。

但是，氨氮浓度随稀释下降，且不利于四硼酸钠溶液为缓冲剂提供碱性环境也对实验存在影响。

我认为此方法下，应该考虑碱性环境（pH=10），并考虑氨氮使用液的浓度。

7.讨论
7.1误差分析
实验过程中对标准溶液及待测样品进行了分析，pH、OPA溶液用量、亚硫酸钠溶液用量、静置时间、反应温度对检测结果都有一定影响。

结果表明，衍生物浓度与荧光强度的线性关系一般，回归方程为y=11282x+14.278，相关系数为0.9873。

可能存在的原因有：①偶然误差与系统误差，移液管的精度和人为操作引起的误差，会造成体积存在偏差。

②温度及pH值衍生反应的影响,比色管在使用前存放与酸性溶液中，在进行实验时未清洗干净，也会对后面的反应造成影响。

③温度，由于大多数荧光物质随着温度的升高，其荧光效率和荧光强度降低，这是因为在较高温度下，分子内部能量有发生转换的倾向，且溶质分子与溶剂分子的碰撞几率增大，使发生振动弛豫和外转换的概率增加，所以温度不同会使测量结果发生改变。

7.2改进方法
（1）将移液管换成移液枪，不仅可以提升实验的操作速度，也可以将偶然误差降到最小。

（2）比色管在使用前，多花时间用超纯水清洗干净。