猪繁殖与呼吸综合征病毒兰州分离株ORF3基因的克隆及杆状病毒载体的构建

西北农业学报 2009,18(3):1 5A cta A gr icultur ae Bor eali occidental is Sinica猪繁殖与呼吸综合征病毒兰州分离株ORF3基因的克隆及杆状病毒载体的构建赵 娜1,2,田 宏1,祁燕蓉2,满自萍1,2,吴锦艳1,尚佑军1,何生虎2,刘湘涛1*(1.中国农业科学院兰州兽医研究所,国家口蹄疫参考实验室,家畜疫病病原生物学国家重点实验室,农业部畜禽病毒学重点开放实验室,甘肃兰州 730046;2.宁夏大学农学院,宁夏银川 750021)摘 要:根据猪繁殖与呼吸综合症病毒已知序列(ch 1a,AY032626)设计包含完整O RF3序列的1对引物,采用RT P CR方法扩增P RRSV甘肃L anzhou株的ORF3基因,将其克隆到杆状病毒载体pFastBacHT A上,经酶切鉴定、P CR鉴定筛选出阳性重组转移载体pFastBacH T A OR F3,并对阳性质粒进行测序及序列分析;将pF ast BacHT A O RF3转化到DH10Bac感受态细胞中,与Bacmid发生位点特异性转座作用,获得重组转座子rBacmid O RF3。

成功构建了PR RSV Lanzho u株ORF3基因的杆状病毒载体,为基因工程疫苗的研制奠定了基础。

关键词:猪繁殖与呼吸综合征病毒;OR F3基因;克隆;杆状病毒表达载体中图分类号:S858.28 文献标识码:A 文章编号:1004 1389(2009)03 0001 05Cloning of ORF3Gene of PRRS Virus and Constructionof Its Baculovirus Epression VectorZHA O N a1,2,TIAN Hong1,QI Yanrong2,M AN Ziping1,2,WU Jinyan1,SH ANG Youjun1,HE Shenghu2and LIU Xiangt ao1*(1.Key Laboratory of Anim al Virology of M inis try of Agriculture,State Key Laboratory of Veterinary EtiologicalBiology,Lanzhou Veterinary Res earch Institute of Ch ines e Academy of Agricu ltural S cien ces,Lanz hou Gansu 730046,China; 2.Agriculture College of Ningx ia University,Yin chuan Ningxia 750021,China)Abstract:According to the published g enom e sequences o f PRRSV(ch 1a),one pair of specific prim ers w ere designed to amplify ORF3g ene o f Lanzhou str ain of Gansu pro vince by RT PCR.T he amplified frag ment w as cloned into pFastBacH T A donor plasmid.T he recom binant pFastBacH TA w as identified by dig estio n w ith endonuclease enzym e,PCR amplification and sequencing.T hen the purified plasm id w as transformed into DH10Bac host cells,producing specific transposition w ith Bacmid to y ield the re combinant shuttle vehicles,rBacm id ORF3.The baculovirus epression vector w as successfully con structed,w hich wo uld be useful fo r productio n of gene vaccination in futur e.Key words:Porcine reproductive and respir ator y syndrome virus;ORF3g ene;Cloning;Baculov irus epressio n vector猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductiv e and Respiratory Syndrom e Virus,PRRSV)引发的一种新的有高度传染性的猪病,主要表现为妊娠母猪早期流产、死胎、木乃伊胎、及产弱仔等繁殖障碍以及各年龄猪发生呼吸道症状和仔猪死亡率高、感染猪出现*收稿日期:2008 10 17 修回日期:2008 12 03基金项目:国家 十一五高技术研究发展计划(863)项目(2006AA10A207);国家 十一五科技支撑计划课题(2006BAD06A11)。

作者简介:赵 娜(1982-),女,河北石家庄人,在读硕士,研究方向:临床兽医学。

E mail:zhaona19822002@ *通讯作者:刘湘涛。

E mail:hnxiangtao@h 免疫抑制等特征[1 3]。

该病最早于1987年在美国南部报道,1990年欧洲等国也证实本病的发生[1 2]。

中国于1996年分离到PRRSV病毒[4]。

至此全球主要养猪国家和地区大都未能幸免。

值得重视的是,自2006年5月份以来,国内从江西开始发病,后波及到浙江、江苏、安徽、湖南、山东、河南,甘肃等省。

初步估算,至2007年初,国内发病地区生猪存栏量已锐减近三分之一,造成极大经济损失,也给许多生猪养殖场(户)带来毁灭性打击。

PRRSV属于动脉炎病毒科,为一种有囊膜的单股正链RNA病毒,基因组全长约15kb,含有9个开放阅读框[5],可编码6种结构蛋白和2种非结构蛋白,其中由ORF3编码的GP3蛋白是PRRSV的次要结构蛋白,是一种糖基化蛋白,在病毒的致病性、病毒复制、病毒装配、病毒变异和保护性反应等方面可能具有重要意义[6 7],而GP3蛋白的这些功能是由其基因序列决定的[8]。

Pla na等报道用杆状病毒表达的ORF3的基因产物免疫母猪,对怀孕母猪可以提供68.4%的保护率[9]。

本试验首次克隆获得LZH PRRSV的ORF3基因序列并进行序列分析,而且使用目前广泛应用的杆状病毒Bac to Bac表达系统,成功构建了ORF3基因的杆状病毒表达载体,为进一步研究该基因的变异与功能奠定了基础。

1 材料与方法1.1 病料和载体PRRSV Lanzhou株系农业部畜禽病毒学重点开放实验室从兰州某发病猪场无菌采集的病料,由该实验室分离保存。

杆状病毒Bac to Bac 表达系统(包括转座质粒pFastBacH T A、E.coli DH10Bac受体菌)购自invitrog en公司;E.coli JM109感受态、PMD18 T载体均购自大连宝生物工程有限公司。

1.2 工具酶及试剂RNA提取试剂盒购自QIA GEN公司;各种限制性内切酶、AMV反转录酶、Ex Taq DNA 酶、T4DNA连接酶、DNA Marker、DNA胶回收纯化试剂盒、小量质粒提取试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司。

1.3 引物的设计与合成根据GenBank上发表的PRRSV序列(ch 1a,AY032626)设计ORF3基因的引物,在上下游引物的5!端分别添加BamH I和H ind∀酶切位点(引物中划线部分)。

引物由大连宝生物工程有限公司合成。

通用引物M13F/M13R参照Bac to Bac杆状病毒表达系统由上海生工生物技术公司合成。

P3F:5! CGGGAT CCATGCCT AAT A GCGGT ACA 3!;P3R:5! CCAAGCT TCT A TCGCCGT GCGGCAGT 3!。

1.4 PRRSV基因组RNA的提取PRRSV基因组RNA的提取按QIAGEN RNeasy Mini Kit说明书进行操作。

1.5 ORF3基因的RT PC R扩增以提取的病毒RN A为模版进行反转录合成cDNA。

以引物P3F、P3R进行PCR扩增,反应条件为94#预变性5min;94#变性50s,60#退火40s,72#延伸1min,共30个循环;72#再延伸10min,4#5min。

PCR产物于1%的琼脂糖凝胶中进行电泳鉴定。

1.6 PCR产物的克隆及序列分析PCR产物用T aKaRa公司的胶回收试剂盒回收,将目的基因的RT PCR产物连接入pM D18 T载体中,转化大肠杆菌感受态细胞JM109感受态细胞,涂布于含100 g/L氨苄青霉素的LB平板上,37#培养12~16h。

经蓝白斑筛选后,用质粒(小量)提取试剂盒提取质粒,将PCR、酶切初步鉴定为阳性的质粒命名T ORF3,并送大连宝生物工程有限公司测序。

用分子生物学软件DNAStar进行序列分析并建立系统进化树。

1.7 重组转座载体的构建将回收的PCR产物与杆状病毒转移载体pFastBacH TA同时分别经限制性内切酶Bam H ∃、H ind∀双酶切,回收目的基因ORF3和pFastBacH TA表达载体片段,用T4DNA连接酶4#连接过夜后,转化工程菌JM109感受态细胞。

经蓝白斑及抗性筛选,提取质粒,用引物P3F/P3R进行PCR鉴定,同时用BamH∃、H ind∀进行双酶切鉴定。

将鉴定为阳性的重组质粒命名为pFastBacH TA ORF3,送大连宝生物公司测序。

1.8 穿梭载体的构建参考Invitrogen公司的Bac to Bac Baculov ir us Ex pression System使用说明,将阳性重组质粒pFastBacH T A ORF3转化DH10Bac感受态细胞,涂布含三抗(庆大霉素、卡那霉素和四环素)、X Gal、IPT G的平板,经抗性筛选及蓝白斑%2%西 北 农 业 学 报 18卷筛选,挑取白色菌落在新的含三抗、X Gal 、IPTG 的平板上划线,37#避光培养48h,挑取仍为白色的菌落在含三抗的LB 溶液震摇培养增菌,提取质粒。

用特异引物P3F/P3R 进行PCR 扩增,扩增条件同上,并用通用引物M 13F/M13R 进行PCR 鉴定,扩增条件如下:93#预变性3min;94#变性45s,55#退火45s,72#延伸5m in,30个循环;72#再延伸7m in 。