质量手册_白血病融合基因分型

阴性细胞呈现两个黄色融合信号；阳性细胞呈现两红两绿四个荧光信号，或有一个黄色融合信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
9
MYC断裂点探针
MYC原癌基因的易位分别会导致MYC在t（8；14），t(8；22）和t（2；8)与IgH，IgL和IgK融合，主要发生在B细胞ALL核非霍杰金白血病(NHL），特别是Burkitt淋巴瘤。t(8；14）易位存在于75-85%患者，t(2；8）易位存在于5%患者，剩下的10%患者为t(8；22）易位。MYC易位重排的患者预后差，但这些易位对强力化疗反应好，可增加患者生存率。
5）取出后去除上清液，再加入新鲜固定液10~15ml，吹打混匀，静止10分钟后离心
6）小心去除上清液，加入5~10 ml固定液吹打混匀后离心
7）去除上清液加固定液离心（重复6~7次直到细胞成分洗干净为止）
（2）玻片准备
1）滴制备好的细胞样本到载玻片上（用显微镜观察细胞分布情况）
2）在2×SSC（pH 7.0）液中浸泡2分钟
附表：各个相关探针检测的临床意义及诊断标准
序号
探针
临床意义
诊断标准
1
BCR/ABL双标融合探针
Ph染色体为9号染色体和22号染色体发生易位融合而成，在95%以上慢性粒细胞白血病（CML）患者，3-5%的儿童急性淋巴细胞白血病（ALL）和25%成人ALL患者h会出现，BCR/ABL是t（9:22）（q34:q11）染色体易位产物，监测点该基因对慢性和细胞白血病及ALL的诊断，鉴别诊断及预后具有重要意义，在儿童ALL中检测到改融合暗示预后较差。
阴性细胞呈现两个黄色融合信号；阳性细胞呈现两红两绿四个荧光信号，或有一个黄色融合信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
10
TEL/AML1双融合探针
TEL/AML1探针检测染色体t(12；21）（p12;q22）易位，在15-35%的儿童B细胞ALL中可见，也是该型白血病中最常见的易位。在成人和幼儿很罕见，主要为儿童，男性和女性同等发生率，检测到TEL/AML1预示预后良好。
（4）固定液需要新鲜配制
（5）注明的试剂需将pH值调到7.0
（6）变性时间应准确控制为2分钟
临床意义：
（1）白血病基因诊断
（2)微小残留病检测
（3）供受体性别不同造血干细胞植入检测
（4）白血病的治疗及疗效观察
拟写人：张式鸿
批准人：姜傥
批准日期：2008年.7月30日
修改人：张式鸿
批准人：姜傥
修改日期：2008-7-30
3）依次在70%、85%、100%的乙醇中浸泡2分钟，脱水
（3）预变性
1）将探针从-20℃的冰箱中拿出，留至室温
2）探针溶液用加样枪吸吹使其充分混匀
3）将10ul探针液滴到标本玻片上，小心盖上盖玻片，用封片胶完全封片
（4）变性
1）将封好的玻片放在75℃（+/- 1℃）的热台上变性2分钟
（5）杂交
1）将玻片置于避光潮湿（加入湿纱布或海绵）的盒子中，放入37℃（+/- 1℃）培
BCR基因标记为绿色，ABL1标记为红色。
阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号；阳性细胞呈现两个黄色的融合信号。不正常细胞可能会出现单融合现象。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
2
P53缺失探针
位于17p13上P53缺失，在慢性粒细胞白血病患者中频繁出现，并且是慢性粒细胞白血病中排在第二位的染色体异常。在10%的病例单独出现或者伴随另外的染色体异常，p53缺失与慢性粒细胞白血病高比率的急性变为急性非淋巴细胞白血病（ANLL）相关。在7-8%的CLL病例中，可发现P53缺失，P53缺失相对于其他染色体异常如11q缺失，12q三体，13q缺失，在无治疗间期疾病进展最快，生存率最差。另外P53缺失也是对化疗耐药的一个分子标记。
P16基因标记为红色，质控探针为9号染色体探针，标记为D9Z3，为绿色。
正常细胞呈现两红两绿四个荧光信号；缺失细胞只有一个红色信号和两个绿色荧光信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
13q14.3基因标记为红色，13号染色体端粒标记为绿色。
阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号；阳性细胞11缺失一个或两个红色红色信号。阴性或阳性细胞都会出现两个绿色荧光信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
12
MLL断裂点探针
MLL基因位于11q23，MLL的易位重排涉及到至少10%的各种类型急性白血病，包括ALL，ANLL,治疗相关性白血病等。染色体的易位导致一个融合基因的形成，该融合基因由MLL基因的5’-端和另外一个基因的3’-端构成。MLL基因易位重排的检测通常与预后较差相关，因此对MLL基因的检测可明确11q23的易位重排，具有重要临床价值。
阴性细胞呈两个黄色融合信号；阳性细胞呈现两红两绿四个荧光信号，或有一个黄色融合信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
13
P16缺失探针
P16探针位于9p21区，包含有多个遗传位点如D9S1749，D9S1747，p16（INK4A), p14(ARF),D9S1748,p15(INK4B)，and D9S1752。对P16探针的检测可以明确9p21区的缺失。大约10%的儿童ALL和10%的成人ALL-可发现9p21缺失重排，导致P16，P15抑癌基因的缺失。
ATM探针标记为红色，探针还包含11号着丝粒质控探针，标记为绿色。
阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号。阳性细胞缺失一个或两个红色信号。阴性或阳性细胞都会出现两个绿色荧光信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
7
CBFβ/MYH11双融合探针
融合基因CBFβ/MYH11由inv(16)(p13q22)倒位产生，可见于20% AML M4型患者，特别是嗜红细胞增多症患者，罕见于无嗜红细胞增多症得M2，M5和M4型患者。总体在5-10% AML中可见16q22异常。此型染色体异常具有较高的完全缓解率，预后比大多数涉及染色体异常的AML患者要好。
ETO基因标记为绿色，AML1标记为红色。
阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号；阳性细胞呈现两个黄色的融合信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
5
PML-RARa双融合探针
PML-RARa探针检测的是染色体t（15:17）（q22:q21)易位，最常出现在AML, M3型患者，M3型在成人AML患者中发病率为10%。检测到PML-RARa易位融合基因的早期死亡率为15-20%，联合维甲酸化疗可以显著延长生存时间。
4）2×SSC：1：10稀释20×SSC
5）0.4×SSC：1：5稀释2×SSC
6）0.4×SSC/0.3% NP-40：0.4×SSC中加入0.3% NP-40
7）2×SSC/0.1% NP-40：2×SSC中加入0.1% NP-40
8）2×SSC，0.05% Tween-20可用2×SSC/0.1% NP-40代替
6）用荧光显微镜观察
6.结果报告
由审核者将结果输入LIS，并核对审核单、标本号及患者姓名，确认无误后，打印检验报告，并签名发出
7.注意事项：
（1）新鲜标本取得后，常用肝素钠抗凝。
（2）新鲜标本取得后，必需三天内完成细胞前处理步骤
（3）在制备好片后用显微镜观察细胞分布情况，保证细胞分布均匀，尽量没有细胞重叠
AML1基因标记为绿色，ETV6标记为红色。
阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号；阳性细胞呈现两个黄色的融合信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
11
13q14.3缺失探针
染色体13q缺失可在多种血液性肿瘤发现，包括B细胞CLL，NHL和多发性骨髓瘤等。在ALL中，大约2%的成人和儿童可检测到13q染色体缺失，在13q缺失的ALL患者中有更高一些的复发率。在全部ALL患者中大约10-15%的患者可发现13q缺失，相对于典型CLL，13q缺失非典型CLL患者可能有更高的侵袭性，在多发性骨髓瘤中，FISH可检测到20-30% 13q14.3缺失，是一个独立的预后因素，对传统化疗反应铭心啊降低，生存率缩短。
质量手册
第章
第1页共1页
课题：白血病融合基因分型
第A版第0次修订
颁布日期：2008年7月31日
目的：白血病诊断，治疗监测、预后估计和微小残留检测等。
原理：
（1）显微镜检查
（2）FISH试验：荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridizationFISH）的基本原理是用已知的标记单恋核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行特异性结合，形成可倍检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以将探针直接与染色进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位。与传统的放射性标记原位杂交相比，荧光原位杂交具有快速、检测信号强、杂交特性高和可以多重染色等特点。
以上试剂均需将pH值调到7.0
9）固定液要新鲜配制：甲醇/乙酸3: 1
10）0.075%KCL溶液
4.方法：
（1）实验前细胞处理
1）取肝素钠抗凝外周血（骨髓）2~3ml放入离心管离心，去除上清液留取细胞沉淀
2）加入5~10 ml 0.075%KCL，用吸管吹打混匀
3）放入37℃水浴箱中低渗30分钟
4）取出后加入1ml新鲜固定液，吹打混匀，静止10分钟后离心
3.仪器与试剂：
（1）相关仪器
1）37℃的水浴箱
2）75℃的水浴箱
3）变性热台
4）37℃恒温培养箱
5）离心机
6）荧光显微镜
7）FISH分析软件
8）钻石笔
9）微量微液器
（2）相关试剂
1）探针（已含DAPI antifade）
2）20×SSC：175.3g NaCl + 88.2g柠檬酸
3）4×SSC：1：5稀释20×）小心去掉盖玻片和封片胶
2）在72℃（+/- 1℃）的水浴箱中，把玻片浸泡在0.4×SSC/NP-40（pH7.0）液中2分钟
3）然后在2×SSC，0.05% Tween-20（pH7.0）的溶液中浸泡30秒
4）晾干，加10ul的DAPI antifade到玻片上
5）盖上盖玻片，在黑暗的环境中放置10分钟
RARa基因标记为绿色，PML标记为红色。
阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号；阳性细胞呈现两个黄色的融合信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
6
ATM缺失探针
FISH技术在11-18%的慢性淋巴细胞白血病（CLL）病例中可以检测到11q22-q23缺失，ATM基因位于该缺失区域，ATM基因缺失的检测标志着淋巴结病和预后较差。
MYH11基因标记为绿色，CBFβ标记为红色。
阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号；阳性细胞呈现两个黄色融合信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
8
MYH11新裂点探针
MYH11探针针对Inv(16)(p13q22)和t(16,16)(p13,q22),在10%新发生的AML患者可见，最常见于M4型，约占20%患者，治疗有很高的完全缓解率，在新发的成人AML中作为很好的预后因子，比大多数的其他ANLL预后更好，中位生存时间为5年。
CHIC2位点标记为红色，探针还包含4号端粒质控探针，标记为绿色。
阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号；阳性细胞缺失一个或两个红色信号。阴性或阳性细胞都会出现两个绿色荧光信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
4
AML1-ETO双融合探针
AML1-ETO探针检测的是染色体t(s：21）（q22；q22)易位，此种易位最常出现在急性粒细胞白血病（啊、AML）M2患者，少见于M1或者M4型，在AML中发生率为10%，占M2型AML的40%，最常出现在儿童AML患者。
P53探针标记为红色，探针还包含17号着丝粒质控探针，标记为绿色。
阴性细胞呈现两红两绿四个荧光信号；阳性细胞缺失一个或两个红色信号。阴性或阳性细胞都会出现两个绿色荧光信号。
计数200个细胞，阳性细胞比例占10%左右可报告结果呈阳性。
3
CHIC2缺失探针
CHIC2位点位于4q12，该位点在FIP1L1基因和PDGFRa基因发生融合时出现缺失，而FIP1L1基因和PDGFRa基因融合会产生一个新的酪氨酸激酶，这个酪氨酸激酶是格列卫（Gleeve)药物的治疗靶点，因此CHIC2缺失的检测可以预测格列卫治疗反应。