标准操作规程(SOP)——禽流感病毒H5N1 NASBA检测

一、目的
确保H5N1禽流感疑似病例标本得到有效的检测，为禽流感H5N1感染提供可靠的实验室诊断依据。

国家流感中心实验室按照规定方法对疑似H5N1禽流感感染病例的标本进行处理和检测，使疑似禽流感病例标本的处理和检测得到有效的控制。

保证检测结果的快速性和可靠性，同时确保样本不被污染和污染环境。

二、范围
适用中国国家流感中心操作人员进行疑似H5N1禽流感病例标本的检测。

三、定义
核酸序列依赖性扩增（Nuclear acid sequence-based amplification ，NASBA ）检测技术是一项快速等温核酸扩增并能实时观测结果的检测技术，该技术的检测反应有赖于AMV 逆转录酶、噬菌体T7 RNA 多聚酶、核糖核酸酶H 、两种特别设计的特异性寡核苷酸引物和分子信标探针共同协作而完成。

如下是在检测结果分析中涉及到的几个概念：
1．样品检测信号值（WT signal ）：在扩增过程中分子信标探针与靶基因发生特异性结合后，产生荧光信号的荧光信号被收集经软件转换后的强度值，即WT signal 。

2．阈值（threshold ）：在NASBA 反应过程中会产生荧光信号，阈值是判断阴性或阳性结果的荧光信号界线值，样本荧光信号≥阈值者为阳性，反之为阴性。

图1：NASBA 检测标准曲线
Time WT Signal
标准操作规程（SOP H5N1 NASBA
四、背景
本SOP是为了疑似H5N1禽流感感染的诊断而制定，确保禽流感病例诊断的快速性和可靠性，同时要求实验操作过程中标本不被污染或污染环境。

五、程序
（一）生物安全要求
标本裂解在BLS-3实验室，其余操作部分在具有规范分区（体系配制区、核酸提取区和检测分析区）的BSL-2级实验室进行并遵守相应生物安全规定。

详细生物安全防护参见“生物安全个人防护SOP”。

（二）材料及仪器
1．梅里埃公司 Nulisens EasyQ 检测分析系统。

2．孵育器
3．离心机
4．移液器：规格分别为0.5~10μL、20~200μL和100~1000μL各一支。

5．振荡器
6．核酸提取Kit：QIAGEN公司 RNeasy Mini Kit， Cat No.74104。

7．梅里埃公司 NucliSense Basic Kit，Cat No.70087135B。

8．梅里埃公司 H5N1 Reagent ，Cat No.70051176。

9．梅里埃公司 Nulisens EasyQ 检测分析系统。

10．其他：RNase-free 1.5mL eppendorf管，RNase-free 0.2mL PCR管、一次性无粉乳胶手套、工作服、N-95口罩、一次性防护眼镜、帽子、一次性
鞋套、一次性隔离服、10μL规格滴头、200μL规格滴头、1000μL规格
滴头，β-巯基乙醇、70%乙醇。

（三）实验步骤
1．病毒核酸提取：同RT-PCR。

2．反应体系配制
（1）质控设置：
1）阴性对照：核酸提取时，同标本同时提取无菌水。

2）阳性对照：H5N1病毒核酸或试剂盒提供的体外转录RNA。

3）空白对照：RNase-free Water。

（2）准备工作：进入反应配制区工作间，换戴一次性无粉乳胶手套，将NucliSense Basic Kit和特异性引物及探针放于室温直至溶解。

（3）酶（Enzyme mix）的稀释：每个酶球共可检测8个样品，按照45μL/酶球的酶稀释液（Enzdil buffer），用手指轻弹混匀（不可用Votex剧烈振荡），室温放置待其溶解成无色透明液体。

（4）反应体系配制：取两支1.5mL Eppendorf管，分别标记H5和N1，依次按照下表分别将试剂加入其中，震荡混匀并完全溶解后，短暂离心。

试剂名称体积/数量（8个反应量）体积/数量（16个反应量）
Reagdil 64μL 128μL
Water 11μL 22μL
KCl 13μL 26μL
Primer/probe mix 8μL 18μL
Reagent 1颗2颗
（5）反应液分管：按照待检样本的数量取8联PCR管,将上述反应液以10μL 每管加入管底，将用作H5或N1检测的反应液分别做好标记放置管架上。

（6）酶分管：将上述稀释的酶以5μL每个反应加至8联管的管盖上，放置管架上。

3．加反应模板
将上述反应液和酶拿入核酸提取区，在生物安全柜内以5μL/管依次加入空白对照、阴性对照、待检样品和阳性对照模板RNA，并用移液器吹打混匀，将加有酶稀释液的管盖轻轻盖上以避免酶落入反应液中。

做好标记或相应标本名称。

4．反应检测（检测分析区）
（1）准备工作：
1）将孵育器电源打开预热10min；
2）先后打开NucliSens EasyQ检测分析仪和电脑电源预热10min。

（2）上样预处理：将上述反应管放孵育器上先后经65℃和41℃加热各2min 后，将8联管短暂离心，让管盖上的酶稀释液进入管内，轻弹混匀，再次短暂离心。

（3）上样检测：将预处理的反应管放入NucliSens EasyQ 分析检测仪上样板对应孔上，在连机电脑上按照下图程序：①打开操作程序；②输入样品号；③设置检测时间；④41℃下进行反应90min 。

图2：上样检测及结果软件操作程序
5．结果分析
反应结束后，按照上图“⑤” 所示打开分析软件，根据检测的样本信号值（WT Signal ）判断结果，以1.2倍的阴性对照荧光信号值作为阴性判断的阈值，首先是质控系统判断，即阳性对照WT Signal 必须要大于阈值，NucliSens EasyQ Analysis Software.lnk ③ 在“Run ”栏设置时间 ④ 点击“Start ”开始检测 NucliSens EasyQ Data Analyzer.xls.lnk ⑤打开进行结果分析
空白样本小于阈值，否则系统检测无效。

当系统检测是有效时，判断待检样本结果，待检样本的WT Signal≥阈值判断为阳性样本，＜Threshold WT 时判断为阴性样本。

6．注意事项
（1）为了避免实验中的交叉污染，在加模板的过程中，应首先加空白和阴性对照，其次加待检样本，最后加阳性对照。

（2）本SOP实验过程都应使用无粉手套。