Westernblotting protocol 蛋白质印迹
westernblotting蛋白质印迹实验的流程
实用标准文案细胞总蛋白的提取（1）离心后，弃去上清液，将收集的细胞用手指轻弹重悬于剩余的少量上清液中，转移至1.5ml 离心管内，用1×PBS溶液洗涤2次，每次加入1mL PBS溶液，1000r/min，4℃离心5min，弃上层液体。
洗涤两次后，将上清液完全去除，用手指轻弹细胞团，使其分散重悬（若不分散，则无法与裂解液充分混匀）。
（2）每管加入细胞团等体积的含蛋白酶抑制剂cocktail的RIPA细胞裂解液；如需检测磷酸化蛋白，则需另加入磷酸酶抑制剂。
使细胞裂解液与细胞充分混匀，冰上裂解30min。
如暂不提取蛋白，也可在洗涤细胞2次后加入含蛋白酶抑制剂cocktail和磷酸酶抑制剂的1×PBS约100μL，1000r/min，4℃离心5min后，完全弃上层液体，置于-80℃冰箱保存备用。
（3）冰上超声处理细胞，每次超声2s，间隔3s，约10-20次。
（4）13000r/min，4℃离心15min，收集上清溶液至另一干净并预冷的1.5mL离心管中，于-80℃冰箱保存备用。
2. BCA法测定蛋白质浓度（1）配制工作液根据标准品及待测样品的个数，按BCA试剂A和试剂B体积比为50:1配制足量BCA工作液，充分混匀，置于常温备用。
（2）配制标准品取原标准品BSA（2mg/mL）约100μL，取出50μL，用ddH2O按对数法稀释成如下浓度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25 mg/mL、0.125 mg/mL、0.0625 mg/mL；设置96孔板第一横排第一孔为空白孔，第二横排第一、二孔加入20μL 1×PBS，从第三横排起，精彩文档．实用标准文案按浓度梯度由低到高依次取20μL标准品至96孔板中，每一浓度做2个平行孔。
（3）稀释待测样品取5μl待测蛋白样品，用ddH2O稀释到50μL，分别取20μL至96孔板中，每一浓度做2个平行孔；（4）分别加入200μL BCA工作液到蛋白标准品及待测样品中，轻轻混匀，并去掉每孔中的气泡，置于温箱37℃孵育30min。
蛋白质印迹法westernblot
蛋白质印迹法蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋白免疫印迹(Western Blot )是将电泳分离后的细胞或组织总蛋白质从凝胶转移到固相支持物NC膜或PVDF膜上，然后用特异性抗体检测某特定抗原的一种蛋白质检测技术，现已广泛应用于基因在蛋白水平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个方面。
中文名蛋白质印迹法外文名Western Blot蛋白免疫印迹Western Blot类似方法1 Southern Blot 杂交方法类似方法2 Northern Blot 杂交方法使用材料聚丙烯酰氨凝胶电泳⑴原理与Southern Blot 或Northern Blot 杂交方法类似，但Western Blot法采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体,“显色”用标记的二抗。
经过PAG（聚丙烯酰胺凝胶电泳）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
⑴分类Western Blot 显色的方法主要有以下几种:i. 放射自显影ii. 底物化学发光ECLiii. 底物荧光ECFiv. 底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下(二抗用HRP标记)：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRR 即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
western blotting(蛋白免疫印迹)
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
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PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
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Thanks！
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压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
1
主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
蛋白印记WesternBlotprotocol
蛋白印记WesternBlotprotocolWestern blot for PAR-2一、试剂的配制1. PMSF(100 mM)的配制:0.1742 g PMSF → 10 ml异丙醇（－20℃保存）2. 裂解液的准备:购自碧云天公司，分强，中，弱三种（三个小瓶,各50 ml）.在提取总蛋白之前3－5min，将分装裂解液（强）融化置于冰上,每个肌条300－500ul裂解液不要超过450ul,(1ml加入100 mM的PMSF10 μl（使PMSF 的终浓度为1 mM），置于冰上。
(－20℃保存）3.2X Sample Buffer(要用才配或配好后置于-80℃)1倍DTT加上9倍的2X Laemmli Buffer(1). DTT (Di-dithiothreitol) 1M1.542 g DTT →10 ml的10 mM Sodium acetate(醋酸钠)（pH=5.2）中10 mM Sodium acetate(醋酸钠)：0.082 g 无水醋酸钠→ 100 ml dH2O(2). 2X Laemmli Buffer (100 ml) (置于－20°C，经常使用时置于4°C)Glycerol （甘油）20 mlβ-mercaptoethanol （β-me，β-巯基乙醇） 5 ml （恶臭，注意安全）20﹪SDS （十二烷基硫酸钠）10 mlBromophenol Blue（溴酚蓝）20 mg1.5M Tris-Cl（三羟甲基氨基甲烷）pH=6.820 ml (90.855 g Tris→420 ml dH2O,浓盐酸滴定至pH=6.8，定容至500 ml ) dH2O 45 ml4.30％ A+B溶液29．2 g Acrilamide (丙烯酰胺)0．8 g Bis－acrilamide (甲叉双丙烯酰胺)Add dH2O dilute to 100 mL and filter 避光4°C储存注意：该两种药品有毒，配药时注意安全PS. Acrylamide 及Bisacrylamide 是neurotoxin会穿过皮肤，配药时要穿实验衣及戴口罩。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质印迹(Western blotting)
蛋白质印迹(Western blotting)一、实验目的：免疫印迹主要用于蛋白质的结构和活性检测等方面，学生掌握与免疫印迹相关的原理和方法，如电泳技术，转膜技术等。
二、实验原理：蛋白质印迹(Western blotting)是将蛋白质转移并固定在化学合成膜的支撑物上，然后以特定的亲和反应、免疫反应或结合反应及显色系统分析此印迹。
蛋白质印迹(免疫印迹)的实验包括5个步骤：1)固定(immobilization)：蛋白质进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，强度比较差，需要从胶上转移到硝酸纤维素膜上。
2)封闭(blocked)：保持膜上没有特殊抗体结合的场所，使场所处于饱和状态，用以保护特异性抗体结合到膜上,并与蛋白质反应。
3)初级抗体(第一抗体)是特异性的。
4)第二抗体或配体试剂对于初级抗体是特异性结合并作为指示物。
5)适当保温后的酶标记蛋白质区带，产生可见的、不溶解状态的颜色反应。
三、试剂与器材：试剂:(1)人IgG免疫兔的抗血清；(2)辣根过氧化酶一羊抗兔IgG；(3)PBS缓冲液：NaCl 8 g，KCl 0.2 g，KH2P04 O．24 g，Na2HP04·12H20 2.9 g，加蒸馏水至1000 ml，pH值为7.4；(4)PBS-T缓冲液：PBS缓冲液加O.05 9／6 Tween-20；(5)封闭液：0.5％(质量分数)BSA(用PBS缓冲液配制)；(6)底物溶液：A液：溶解30 mg CN在5 ml甲醇中；B液：溶解10 mg DAB在5 ml甲醇中；C液：分别搅拌A液和B液10～15 rain，直到完全溶解，然后将A液和B液混合，加PBS至50 ml，分成10 ml 一份，不用的可冷冻(一20~C)(下次直接化冻运用)；D液：取10 ml C液，运用时加10 ml 30％(体积分数)H202；(7)转移缓冲液：0.025 mol／L Tris，O．192 mol／L甘氨酸(glycine)，20％(体积分数)甲醇(methan01)，pH值为8.3。
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot)图示
B 电泳
B-1 PAGE 胶的制备 聚丙酰胺凝胶 PAGE 电泳根椐蛋白分子量进行分离蛋白，PAGE 胶是由两种化合物聚合 而成的，即丙烯酰胺（acr）和 N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)，聚合需加入过硫酸铵及 DMAP 或 TEMED，凝胶为 中性、水溶性、三维网 状结构。 不同分子量的蛋白选择不同的凝胶浓度（参考下表》，原则上高分子量蛋白用低浓度胶，低分子量蛋白用高 浓度胶分离。
浸泡甲醇中 1-2 分钟，再孵育于冰冷的电转缓冲液中 5 分钟，胶也需在冰冷的电转缓冲液中平衡 3-5 分 钟， 否则转膜时会导致条带变形。
C-3 膜上蛋白的检测：丽春红为检测转膜是否成功，可用丽春红染色， 丽春红染色工作液：2%的丽春红贮备液 1：10 稀释，即加 9 倍的 ddH2O 染色方法： 将膜放入 TBST 洗一次，再置于丽春红染色工作液中,在室温下摇动染色 5 分钟，大量的水洗膜直至水变
B-2 蛋白分子量 Marker 预染或非预染各种分子量的蛋白，用于标示电泳中蛋白的大小和示踪
实验七蛋白质免疫印迹实验WesternBlotting
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
三 操作步骤
2显色反应 首先进行分子量标记的氨基黑染色。切
下转有分子量标记的硝酸纤维素薄膜， 用含有0.3%吐温20的PBS缓冲液漂洗三 次后（每次15分钟），再将其浸入氨基 黑染液中，室温染色5分钟，然后置于 氨基黑脱色液中脱去背景，水中漂洗后 景干备用。
三 操作步骤
转有样品的硝酸纤维素薄膜用含有5%脱脂牛奶的PBS 缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST 第一抗体，平缓摇动，室温保温1小时。然后用PBS缓 冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次 30分钟。将辣 根过氧分物酶标记的羊抗兔免疫球蛋白第二抗 体用封 闭液稀释50倍后，加入吐温20至终浓度为0.05%，然 后与上述漂洗的硝酸纤维素薄膜进行反应，将膜浸于 其中，平放在平缓摇动的摇床平台上，室温温育 1小 时后，用PBS缓冲液将硝酸纤维素薄膜漂洗4次，每次 5 分 钟 ， 再 加 入 4- 氯 萘 酚 显 色 液 ， 加 入 5μ1 的 30%H2O2，将硝酸纤维素薄膜置于其中缓慢摇动，待 所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝酸纤维素 薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出硝酸纤维素 薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
western blot protocol
Western Blot protocolSDS-PAGE：SDS-PolyAcrylamide Gel Electrophoresis【原理】Western Blot又称免疫印迹，是指将蛋白样品转移到固相载体上，而后利用相应的抗体来检测目的蛋白的一种方法。
是检测混合样品中单一特定蛋白的常用技术。
Western Blot间接法基本原理：首先利用SDS-PAGE对蛋白质样品进行分离，然后转移到固相载体（例如PVDF膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的PVDF膜就称为一个印迹（blot）,用于对蛋白质的进一步检测。
印迹首先用蛋白溶液（如5%的BSA 或脱脂奶粉溶液）处理以封闭PVDF膜上剩余的疏水结合位点，而后用所要研究的蛋白质的抗体（一抗）处理，印迹中只有待研究的蛋白质与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，而其它的蛋白质不能与一抗结合，这样清洗除去未结合的一抗后，印迹中只有待研究的蛋白质的位置上结合着一抗。
处理过的印迹进一步用适当标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。
处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
目前有结合各种标记物的抗特定IgG 的抗体可以直接购买作为二抗，最常用的一种是酶连的二抗，印迹用酶连二抗处理后，再用适当的底物溶液处理，当酶催化底物生成有颜色的产物时，就会产生可见的区带，指示所要研究的蛋白质位置。
该技术广泛应用于检测蛋白水平的表达。
在Western Blot实验中，还有另一种方法，就是直接标记一抗，再用底物显色，这种方法叫直接法。
与用二抗的间接法相比有诸多不足，标记二抗可用于很多种不同特异性的一抗，避免了标记很多一抗的需要，同时因为一抗结合不止一个二抗分子，所以二抗可以增强信号。
所以一般情况下都釆用间接法进行检测。
【实验耗材】•PVDF膜[MILLIPORE (IPVH00010)]•NC膜•滤纸[BIO-RAD (1703967)]【实验仪器】•PowerPac Basic电泳仪[BIO-RAD (041BR89156)]•Trans-Blot Turbo System 半干转转膜仪[BIO-RAD (690BR006827)]自制胶通常使用Bio-rad半干转转膜仪•iBlot Dry Blotting System 干转转膜仪[Invitrogen (25-0912)]需用Invitrogen 预制转印包•Chemi Doc XRS+显影仪[BIO-RAD (721BR04128)]【试剂】••5×量取100mL of 5×电泳液至500mL量筒中，加超纯水至500mL刻度线，配好后的电泳液在1个月内使用。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项实验方法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基乙醇ddH2O甘氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素膜匀浆器剪刀移液枪刮棒实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO41.44g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰0.2 g；甲醇80 ml；乙酸 2 ml；ddH2O118 ml。
WB：WesternBlot-蛋白质印迹法
WB：WesternBlot-蛋⽩质印迹法「源」是格源致善对在个性化肿瘤疫苗研究领域内有重⼤突出贡献的⼈物或创新性的事件进⾏报道的专题。
⼀、蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot，简称WB。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
Western blot的发明者⼀般认为是美国斯坦福⼤学的乔治·斯塔克（GeorgeStark）。
在尼尔·伯奈特（NealBurnette）于1981年所著的《分析⽣物化学》（AnalyticalBiochemistry）中⾸次被称为WesternBlot。
WB的基本原理：在电场的作⽤下将电泳分离的多肽从聚丙烯酰胺凝胶转移⾄⼀种固相⽀持体，然后⽤这种多肽的特异抗体来检测，经常⽤于⽬的蛋⽩的表达特性分析、组织定位、表达量分析及与其他蛋⽩的互作。
依其原理，可分为直接法和间接法两种⽅法，两种⽅法的⽐较如表1表1 WB直接法和间接法的⽐较⼆、WB实验步骤Western Blot的内容主要包括以下⼏个步骤：1）制样：裂解缓冲液或者超声处理。
（使⽤RIPA裂解液是需按照100:1加⼊蛋⽩酶抑制剂）2）电泳：根据蛋⽩⼤⼩确定合适的PAGE胶浓度，推荐上样量为20-30ug总蛋⽩。
3）转膜：湿转和半⼲转都可。
但在待检测蛋⽩分⼦量较⼤或低内源⽔平湿转移⽅法更佳。
4）洗膜：10min/次*3次。
5）封闭：含5%脱脂奶粉的TBST中封闭1h。
6）洗膜：TBST中洗涤10min。
7）孵育⼀抗：⼀抗应在含5% BSA 或5% 脱脂⽜奶的 TBST 缓冲液中稀释，参考产品说明书选择合适的⼀抗稀释⽐例。
5%推荐使⽤脱脂奶粉的TBST缓冲液，背景相对较低。
⼀抗4℃孵育过夜更好。
8）洗膜：10min/次*3次。
9）孵育⼆抗：建议在含5%脱脂⽜奶TBST中稀释⼆抗.参考⽣产商建议选择合适的⼆抗稀释⽐例。
10）洗膜：10min/次*3次。
蛋白质印迹分析(WesternBlotAnalysis)
蛋白质印迹分析(Western Blot Analysis)【实验目的】了解蛋白质印迹法的基本原理及其操作和应用。
【实验原理】蛋白质印迹法又称为免疫印迹法，这是一种可以检测固定在固相载体上蛋白质的免疫化学技术方法。
待测蛋白既可以是粗提物也可以经过一定的分离和纯化,另外这项技术的应用需要利用待测蛋白的单克隆或多克隆抗体进行识别。
如图所示，可溶性抗原，也就是待测蛋白首先要根据其性质，如分子量，分子大小，电荷以及其等电点等采用不同的电泳方法进行分离；通过电流将凝胶中的蛋白质转移到聚偏二氟乙烯膜上；利用抗体（一抗）与抗原发生特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取目的蛋白。
值得注意的是在加入一抗前应首先加入非特异性蛋白，如牛血清白蛋白对膜进行“封阻”而防止抗体与膜的非特异性结合。
经电泳分离后的蛋白往往需再利用电泳方法将蛋白质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常用的两种电转移方法分别为: 1.半干法: 凝胶和固相载体被夹在用缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。
2.湿法：凝胶和固相载体夹心浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进行。
由于湿法的使用弹性更大并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这里只描述湿法的基本操作过程。
对于目的蛋白的识别需要采用能够识别一抗的第二抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利用辣根过氧化物酶所催化的一个比色反应，该反应的产物有特定的颜色且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对二抗的识别而识别一抗，进而判断出目标蛋白所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。
【实验操作】⒈.蛋白质的分离根据目的蛋白的性质，利用电泳方法将其进行分离。
为提高电转移的效率，通常采用SDS/PAGE技术。
分离实验结束后，首先将样品墙的上边缘用小刀去除，然后在胶板的右上角切一个小口以便定位，小心放入转移缓冲溶液中待用。
蛋白质的印迹分析Westernblotting
一、分子杂交与印迹技术的原理
核酸分子杂交 (nucleic acid hybridization ) 在 DNA 复性过程中，如果把不同 DNA 单链
分子放在同一溶液中，或把 DNA 与 RNA 放在一
起，只要在 DNA 或 RNA 的单链分子之间有一定
的碱基配对关系，就可以在不同的分子之间形
成杂化双链(heteroduplex) 。
（一）DNA印迹技术 (Southern blotting) 用于基因组DNA、重组质粒和噬菌体的 分析。 （二）RNA印迹技术 (Northern blotting) 用于RNA的定性定量分析。 （三）蛋白质的印迹分析 (Western blotting) 用于蛋白质定性定量及相互作用研究。
斑点印迹 Dot blotting
同位素、生物素或荧光染料对它的末端 或全链进行进行标记，称为“探针”然 后用于分子杂交，杂交后通过放射自显 影、荧光检测或显色技术，使杂交区带 显现出来
二、印渍技术的类别及应用
DNA印迹技术
Southern blotting RNA印迹技术 Northern blotting 蛋白质印迹技术 Western blotting 斑点印迹 Dot blotting 原位杂交 in situ hybridization DNA点阵 DNA array DNA芯片技术 DNA chip
Southern Blotting
无水乙醇 离心 酚/氯仿 蛋白酶K SDS
tissue
Paper Towels
（二）RNA印渍技术 Northern blotting
又称为Northern杂交，即RNA-DNA杂交分析。
是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维 素膜上的方法。 主要用于检测某一组织或细胞中已知的特异 mRNA的表达水平以及比较不同组织和细胞的 同一基因的表达情况。
蛋白质印迹(western-blot)
蛋白质印迹(western-blot)实验原理印迹法一般由凝胶电泳；样品的印迹和固定化；各种灵敏的检测手段如抗体、抗原反应等三大实验部分组成。
1.生物大分子凝胶电泳分离蛋白质印迹法的第一步一般是将蛋白质进行SDS聚丙烯酰胺平板凝胶电泳，使待测蛋白质在电泳中按相对分子质量大小在板状胶上排列。
2.分子区带的转移和固定第二步就是反凝胶电泳已分离的分子区带转移并固定到一种特殊的载体上，使之形成稳定的、经得起各种处理并容易检出的，即容易和各自的特异性配体结合的固定化生物大分子。
3.特异性谱带的检出印迹在载体上的特异抗原的检出依赖于抗体、抗原的亲合反应。
即将酶、荧光素或同位素标记的特异蛋白分别偶联在此特异抗体的二抗上，再分别用底物直接显色，测荧光，放射自显影等方法检测出我们感兴趣的抗原，考虑到如果无合适抗体用来检测抗原时，可用一般的蛋白染料，如丽春红，检测转移到膜上的蛋白，验证转移是否成功。
实验步骤I SDS－PAGE电泳分离蛋白II 电转移1.戴手套将硝酸纤维素纸裁成和需印迹凝胶相似而略大的小块。
2.将SDS－PAGE后准备印迹的凝胶块和硝酸纤维素纸分别放入装有印迹缓冲液的小塑料盒里漂洗10 min。
3.将滤纸裁成比凝胶和硝酸纤维素纸略大的小块，并做成“三明治”状，放入转移夹中。
4.印迹槽中倒入印迹液，将印迹夹放入，胶朝负极，NC膜朝正极，印迹时电流从负极到正极，即将膜上的蛋白质印迹到NC膜上。
5.电印迹：接通电源，使电流达300 mA，同时通冷凝水，印迹2小时后，切断电源。
III 特异性谱带的检出（当无特异抗体时可用此方法）NC膜的染色和脱色：1.印迹完毕，用镊子小心取出NC纸，放置于塑料盒中。
2.用丽春红染色5分钟，用水轻轻漂洗数次至背景红色消失。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
蛋白质印迹的原理
蛋白质印迹的原理今天来聊聊蛋白质印迹的原理。
你知道吗？咱们平常生活中有很多类似于蛋白质印迹的事儿。
就好比警察要在一大堆人里找出一个有特定特征的人，先得有个标准，然后把这些人的特征拉出来对比。
蛋白质印迹就有点这个意思呢。
蛋白质印迹呀，也叫Western Blot。
这个技术呢，简单来说，就是检测蛋白质的一种特别的方法。
首先得从细胞或者组织样本里把蛋白质提取出来，这就好比从一个大杂烩里把咱们想要的食材（蛋白质）挑出来。
然后呢，要用一种叫电泳的技术把这些蛋白质根据它们的大小或者电荷分一分，想象一下，这就像是开运动会，按个头（大小）或者跑得快慢（电荷）把运动员（蛋白质）们分个赛道。
跑完电泳，就把这些分开的蛋白质，像从赛道上把运动员转移到一张特殊的“照片”（膜，一般是PVDF 膜或者硝酸纤维素膜）上，这一步叫转膜。
这时候，蛋白质就在膜上老老实实呆着啦。
接着就开始找我们想要的特定的蛋白质啦。
就好比我们要在衣服堆（膜上的众多蛋白质）里找一件带特殊标记的衣服。
怎么找呢？我们会用特异性的抗体，这个抗体就像是那个带记号的追踪器，它只会和我们要找的那种蛋白质结合。
这就像是狗循着特定的气味找人一样，抗体只会找它对应的那种蛋白质。
但是这个抗体还不能自己发光或者显色呢，所以又要用另外一种带着显色或者发光标记的二抗去结合一抗。
给二抗打个比方吧，二抗就像是个自带手电筒的小助手，二抗结合到一抗上后，通过它带的这个标记，比如说化学发光，我们就能看到膜上出现一条带，这就代表找到了我们想要的蛋白质。
说到这里，你可能会问，要是有别的蛋白质也和一抗结合了怎么办？这就是这个技术需要很严谨的地方。
在刚开始提取蛋白质的时候就要尽量保证特异性，在选择一抗的时候也要特别小心，要选择特异性特别高的一抗，就像找侦探得找最厉害、眼睛最毒的那种。
老实说，我一开始也不明白为啥非得用一抗二抗这么麻烦。
后来才知道，这就像是一个层层放大信号的过程。
直接用能给蛋白质标记显色的物质不容易做到特异性结合，如果直接标记蛋白质本身也很可能会破坏它的活性，这样就没法检测到有活性的蛋白质了。
Western Blot实验(蛋白质印迹法)
时间：2016-05-07
一：蛋白定量（实验前处理）
• 组织：到手的组织状态：冰袋快递：组织腐烂，蛋白含量减少 干冰快递：基本无影响 甲醛处理：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒 需用匀浆器，液氮等方法加入1*PBS充分研磨 裂解液量：组织（g）：裂解液（ml）=1:10 细胞：一般为细胞悬液实验前需确定细胞大概浓度 裂解液量： 107数量细胞加入1ml裂解液
五：封闭（过程）
• 丽春红染色漂洗完成后。 • 清洗干净的膜放入盛有5%BSA的容器中，室温 封闭60-90min，或者4度过夜。
• 5%BSA：秤取2gBSA
加40ml 1xPBS(或TBST)
六：一抗孵育（查询抗体）
决定二抗属性 条带大小
适用实验
一抗稀释比例
六：一抗孵育（过程）
• 封闭完成前，参照说明书将一抗用5%BSA稀释到足够实验 需求的量（无特殊要求，一抗稀释液用封闭液）。 • 封闭完成后，从膜上剪下宽度为1.5cm左右相应蛋白大小 条带，倒掉封闭液，加入稀释好的一抗溶液，摇床上平缓 摇动，室温孵育120min或4℃孵育过夜。 • 一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液（有回收要求的抗体，回 收一抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，第一次漂洗 主要漂洗BSA，冲刷后便可倒去，TBST可以加至膜漂浮在 液体中，每次10min。
• 分离胶
分离胶浓度 试剂 6% 分子量（kDa) 去离子水（ml） 30％丙烯酰胺（ml） 1.5MTris－HCl （PH8.8）（ml） 10％SDS（ml） 10％AP（ml） TEMED（ul） 总体积（ml） ≥94 5.3 2 2.5 0.1 0.1 0.008 8% 70-94 4.6 2.7 2.5 0.1 0.1 0.006 10% 55-70 4.0 3.3 2.5 0.1 0.1 0.004 12% 20-55 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 15% 10-20 2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.004 18% ≤10 1.3 6.0 2.5 0.1 0.1 0.004
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WJQ 2014.6Western Blotting1.以70%的ethanol擦拭glasses2.Glasses（大、小）置于固定架中、调整水平、lock、置支撑架、lock3.Add ddH2O to check glasses 是否有漏（Filter paper吸干水）齿梳用70%EtOH喷洗，纸巾擦干（桌面铺上纸巾）4.视Sample的大小决定Separating gel的浓度（一片约3-4ml所以配5ml）5.Formula10% saparating加1ml 2-propand／片压平，从中间加，向两边移动Seperating gel 凝固后（要充分一些≥1h）倒掉2-propand，用蒸馏水冲洗干净，滤纸吸干6.protein sample 95~100℃煮沸3~5min，冰置7.取一定数量（20~60ul)protein, loading,同时需loading Marker作对照8.Run at 60~80v(浓缩胶)，then换成100~120v（分离胶）9.准备正好大小的滤纸和膜（NC或PDVF膜）用转印buffer浸透10.分开玻璃板，取出gel，将浓缩胶弃掉，用蒸馏水漂洗gel准备三明治：11.恒流260mA 70min 冰浴12.结束后，取出膜用G250漂洗5秒钟，蒸馏水脱色，看是否有气泡13.Blocking （10ml blocking buffer：5% milk 用1xTBST配制） RT shake 1h14.Discard blocking buffer，add 10ml 一抗 4℃作用1h（亦可RT shake1h） PBS（或5% milk）10ml加10ul一抗（稀释1000倍）15.Discard一抗，ddH2O wash，Add TBST wash 10min 3 times（shake）16.Add 10ml二抗RT shake 1h10 ml blocking buffer加2ul二抗（稀释5000倍）17.Discard 二抗 TBST wash 10min 3 times（shake）18.2ml／membrane的ECL substrate（1mlA+1mlB)染色1-2min19.将membrane以袋子夹，贴上Marker20.压片10s 30s 1min 2min一、蛋白质的样品制备：1.取贴壁培养的细胞，弃培养基；2.用预冷的PBS洗2遍，吸净PBS；3.每按照300uL/10-cm dish加入预冷的含蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液，用细胞刮收集细胞到干净EP管中；(裂解液用量根据细胞数调整)4.快速振荡10-20s，冰上放置10 分钟，重复2-3次；5.12000×g，4℃离心10分钟，将上清转移到新的干净EP管中，即为蛋白样品溶液；6.Bradford法（595nm）或BCA法（562nm）对蛋白样品进行定量。
7.将样品稀释成相同浓度，如3ug/ul，加入1/6体积6×loading dye，沸水浴煮沸5分钟，5000rpm离心5min，准备上样。
具体步骤请参考试剂盒的说明书。
样品制备是关键步骤，要求尽可能获得所有蛋白质，应注意以下问题:在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。
选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多肽的溶液。
尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰（加入合适的蛋白酶抑制剂）。
样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后于-20°或-80℃中长期保存，但不要反复冻融，否则会使蛋白的抗原特性发生改变。
提取过程中应尽量避免发生明显的蛋白降解。
此外，切莫使用不新鲜的上样缓冲液，并注意将样品与loading buffer混合均匀。
二、蛋白质定量Stock BSA：10 mg/mL：用ddH2O 稀释8倍，成1.25 μg/μL 工作液；Dye solution (Bio-rad)：用ddH2O稀释5倍（1:4）。
Procedure：1)Dye dilution: 1000 μL 998μL 996μL 994μL 992μL samle: 998μLBSA工作液: 0 2.0 μL 4.0 μL 6.0 μL 8.0 μL 2.0μL考虑到此处要求不是非常精确，直接用Dye dilution（1:4）1mL亦可。
2)RT, Incubate >5分钟(no more than 1 hour)3)Measure at 595 nm.BCA要求检测波长为562nm，Bradford为595nm。
可先把lysis buffer加入BCA工作液或考马G250混合看是否产生颜色以排除假阳性结果。
一般8cm宽的迷你胶每个泳道最大能承载的蛋白质量为150ug。
建议使用等体积上样，即先把各个样品稀释到某一固定浓度，然后等体积等质量上样，计算上样体积时需包含loading buffer的体积。
加样孔的最大限度约为30ul。
上样前要将样品在沸水中煮3~5分钟使蛋白充分变性。
也可以使用PCR仪95°加热5分钟。
之后样品可以在4℃冰箱短时间保存，也可在-20°冰箱保存数月，但是反复冻融会使蛋白质的抗原特性改变。
三、SDS－PAGE电泳1. 清洗玻璃板：取少许洗洁精轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
若不继续使用，需用75%乙醇擦拭后晾干后妥善收起来，玻璃板之间垫玻璃纸隔开。
梳子应用水洗干净，临用前用75%乙醇擦拭晾干。
2. 灌胶与上样①玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶（可先往玻璃板间灌水试漏）。
②按配胶试剂盒说明书选择合适的分离胶浓度配置，最后加入TEMED，之后摇匀即可灌胶。
配制凝胶时要充分混匀，此外应保证试剂的新鲜，特别是过硫酸铵。
灌胶时掌握好速度，避免气泡产生（注意浓度越小的胶含水越多，凝固后胶体积缩小越多）。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变形）。
未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性，操作时应该戴手套防护。
梳子插入浓缩胶时，应确保没有气泡。
注意给积层胶留出足够的空间（分子克隆推荐为插入的梳齿长再加1cm）。
③当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
倒去上层水并用吸水纸吸干。
聚合时间由AP以及TEMED决定，通常在30分钟左右，AP不新鲜或气温较低会导致聚合变慢，但通常不会超过1h。
必要时可适当增加AP以及TEMED的量，由于TEMED催化APS释放相关化学基团，再由APS释放的基团催化Acr/Bis聚合，所以推荐APS每周新鲜配置。
④按说明书配积层胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固前最好在两边补胶至刚刚冒顶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
⑤等待积层胶聚合期间，取适量蛋白样品（含1X SDS loading buffer，最好预先分装好），95~100°加热5分钟，若有沉淀可用稍低温度，比如45~55°加热1h达到变性的目的。
可分装50ul到PCR管里，先和loading buffer混合好，临用前用PCR仪加热95°C 5分钟，效果不错。
⑥胶做好后连同玻璃板一起安装到电泳槽上，加入电泳缓冲液后准备上样（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板，电泳槽下面不用倒太多电泳液）。
加样前可用加样器或5ml注射器冲洗一下加样孔。
用微量加样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
目前我们做的胶上有10个上样孔，一般在头尾孔内加入两种不同的预染marker，中间8个孔加样品。
加样前样品应先离心，尤其是长时间放置的样品。
在未加样的孔中应加入等量的样品缓冲液。
上样时，小心不要使样品溢出而污染相临加样孔。
也可使用10ul的枪头，比用微量加样器快很多，用枪头时注意不要插得太深，容易把玻璃板撑开，样品就落到胶和玻璃板之间的空隙了。
3. 电泳电泳槽内加入电泳缓冲液冲洗清除黏附在凝胶底部的气泡和未聚合的丙烯酰胺，有方案建议通过低电压短时间预电泳清除凝胶内杂质、疏通凝胶孔径，但《分子克隆》却反对这种做法，理由是会破坏缓冲系统pH的不连续性。
电泳时间和电压按照各实验室的惯例或者电泳槽的使用说明来操作。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
为减少蛋白质条带的扩散，上样后应尽快进行电泳，电泳结束后也应直接转印。
四、电转印1、将滤纸和NC膜切成与凝胶尺寸大小，置于转印缓冲液中平衡5分钟；2、转移：按照正极-海绵-滤纸-Nc膜-凝胶-滤纸-海绵-负极的顺序装好转印夹，260mA恒流转移60~70 min。
五、杂交1、取下Nc膜，做好标记（用油笔重新标记Marker，以防在后续步骤中被洗掉），去离子水冲洗，干净滤纸吸干；2、将Nc膜放于5%脱脂奶粉溶液中封闭1小时；3、PBST洗三次，每次5-10分钟；4、加入适当稀释浓度的一抗，4℃过夜；5、PBST洗三次，每次5-10分钟；6、加入二抗1:5000~10000，室温反应1小时。
7、PBST洗三次，每次5-10分钟。