蛋白质印迹(Western blotting)方法原理和优化
蛋白免疫印迹的原理
蛋白免疫印迹的原理
蛋白免疫印迹（western blotting）是一种常用的生物化学实验
技术，用于检测和分析特定蛋白质在复杂混合物中的表达水平和特异性。
其原理基于蛋白质的电泳分离、膜转移和特异性抗体结合。
首先，通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将待测蛋白样
品按照分子量大小进行分离。
然后，将分离出的蛋白质在电泳胶上通过膜转移（blotting）的方式转移到固相材料（通常是
聚乙烯二醇涂层的聚丙烯酰胺膜或硝酸纤维素膜）上。
转移完成后，膜上的蛋白质被非特异性蛋白质结合，为了防止进一步非特异性结合，可以使用一种无效蛋白质，如牛血清白蛋白（BSA）或非脂母细胞肿瘤中抗原（NFSA）来封闭非特
异结合位点。
紧接着，膜上的蛋白质与针对特定蛋白的抗体发生特异性结合。
这些抗体可以是直接标记的（如荧光染料或酶联物质），或者是需要进一步与辅助抗体结合才能被检测到。
特异性抗体与膜上蛋白质结合后，通过洗涤步骤去除非特异性抗体。
最后，通过添加染色剂（如酶底物）或者使用荧光扫描仪，可以可视化结合在膜上的抗体。
蛋白免疫印迹的结果可以用于定量分析蛋白质的表达水平、鉴定特定蛋白的存在以及研究蛋白质的功能和相互作用。
免疫印迹的原理和应用
免疫印迹的原理和应用1. 原理免疫印迹（Western Blotting），也称为蛋白质印迹或蛋白免疫印迹，是一种用于检测特定蛋白质的方法。
它基于免疫学技术，通过将样品中的蛋白质分离并转移到固相载体上，然后使用特异性抗体与目标蛋白质结合，最后使用化学发光或染色方法进行可视化。
免疫印迹的原理主要包括以下几个步骤：1.1 蛋白质分离首先，样品中的蛋白质需要被分离开来，常用的方法有聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和聚丙烯酰胺凝胶二维电泳等。
这些方法能够根据蛋白质的大小、电荷等物理性质将蛋白质分离成不同的带状图案。
1.2 转膜将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相载体上，一般使用聚乙烯二烯基氟乙烯膜（PVDF）或硝酸纤维素膜（NC）等。
转膜的方法有湿式转膜和半干式转膜等，其中湿式转膜常用于蛋白质较大的情况，半干式转膜则适用于蛋白质较小的情况。
1.3 结合抗体将转膜后的蛋白质与特异性的抗体结合。
抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，通过特异性结合目标蛋白质来实现分析和检测。
1.4 可视化最后，通过化学发光或染色等方法将目标蛋白质可视化。
其中，化学发光方法常用于检测蛋白质的表达水平，而染色方法则常用于定性分析。
2. 应用免疫印迹技术在科研和临床诊断中有着广泛的应用。
下面是一些免疫印迹技术常见的应用领域：2.1 研究蛋白质表达和功能免疫印迹技术可用于研究蛋白质的表达和功能。
通过对不同组织或细胞中特定蛋白质的印迹分析，可以了解蛋白质的表达模式以及在细胞功能中的作用。
2.2 肿瘤标志物检测在临床诊断中，免疫印迹技术常用于肿瘤标志物的检测。
例如，可以利用免疫印迹技术检测血清中的癌胚抗原（CEA）和前列腺特异性抗原（PSA）等肿瘤标志物，以辅助肿瘤的早期诊断和疾病监测。
2.3 蛋白质-蛋白质相互作用研究免疫印迹技术还可用于研究蛋白质-蛋白质相互作用。
通过对蛋白质的印迹分析，可以了解不同蛋白质之间的相互作用关系，有助于揭示蛋白质通路和信号转导网络的机制。
western-blotting(蛋白免疫印迹)PPT课件
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膜的选择
1. PVDF膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹 法中常用的一种固相支持物。
2. PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔 径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 大于20KD的蛋白选用0.45um的膜，小于20KD的 蛋白选用0.2um的膜。
1.含HRP的抗体； 2.发光试剂； 3.反应的杂质;
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洗脱抗体
一抗洗脱 二抗洗脱 一抗种属来源不同时，strip二抗即可
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三、显色
暗室曝光 Tanon 5200 全自动化学发光图像分析系统
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Tanon 5200---性能特点
适用于高分辨率和高灵 敏度的图像拍摄；
可设定连续采样的次数、 起始及终止曝光时间， 进行动态连续拍摄，拍 摄得高质量的图片；
在裂解液中加入合适的蛋白酶抑制剂，避免蛋白降解，从而保证检测的准
确性！ .
7
蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分 子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开二 硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解聚 成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结合形 成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。
对
电转仪长期使用导致海绵变薄，
策
“三明治”结构不紧凑导致。
确保膜和胶块之间没有气泡
缓冲液中离子浓度太低，电流或电
压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 膜没有均匀浸湿 2. 膜或者缓冲液污染 3. 封闭不充分 4. 抗体与封闭剂出现交叉
western blotting(蛋白免疫印迹)
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蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
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PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
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Thanks！
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压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
1
主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
蛋白质印迹法的应用及其技术发展
蛋白质印迹法的应用及其技术发展随着生物技术的快速发展和应用，人们对于生物分子表达与功能研究的需求也越来越高。
而蛋白质分子作为生物体中最为基础的机能分子，其研究的重要性也愈加凸显出来。
蛋白质印迹法便是一种应用广泛、有效的手段，用于检测、鉴定和定位目标蛋白质，其在基础研究、医学诊断和药物研发等领域都发挥着重要作用。
一、蛋白质印迹法的工作原理蛋白质印迹法，又称蛋白质免疫印迹法（Western Blotting），是一种广泛应用于蛋白质分子研究中的方法。
它利用特异反应性抗体对于蛋白质分子的亲和作用，将其快速、准确、可靠地检测出来。
现代的蛋白质印迹技术主要包括以下步骤：（1）蛋白质的电泳分离：将目标蛋白标本经SDS-PAGE电泳分离成不同的蛋白质带。
（2）蛋白质的转移：将分离好的蛋白质带通过电泳转移到聚丙烯酰胺薄膜或硝酸纤维素膜上。
（3）膜上目标蛋白的检测：利用与目标蛋白质对应的一抗（Primary Antibody）与膜上相应位置的目标蛋白质发生特异性结合，去除多余抗体，然后利用与一抗对应的二抗（Secondary Antibody）介导的标记物发出染色信号，并用显微摄影的方法记录下来。
二、蛋白质印迹法的应用蛋白质印迹法是一种高度特异性、灵敏度极强的检测手段，其应用在基础研究中具有以下优点：（1）蛋白质的定量和质量鉴定：蛋白质印迹法可以通过“Western blot quantification”等算法，精确地测量样本中目标蛋白的相对含量和质量，同时可以检测出多种不同大小的蛋白。
（2）蛋白质亚细胞定位：蛋白质印迹法结合细胞学分析，可以确定目标蛋白是否定位于细胞膜、细胞核或细胞质内部，同时还能对不同的亚细胞结构进行精确定位，为深入研究细胞内基本过程提供了重要的工具。
（3）蛋白质-蛋白质相互作用：蛋白质印迹法可以通过检测蛋白质-蛋白质之间的相互作用，实现蛋白质复合物结构的解析和对分子交互作用的研究。
三、蛋白质印迹技术的发展趋势随着蛋白质印迹技术的应用范围不断扩大，传统的蛋白质印迹技术也不断创新和改进。
蛋白质印迹(Western blotting)技术总结
蛋白质印迹技术一、故事：关于蛋白质免疫印迹的那些事1981 年美国斯坦福大学的乔治·斯塔克(George Stark)发明了蛋白质印迹( western blot)。
在尼尔·伯奈特（Neal Burnette）于1981年所著的《分析生物化学》（Analytical Biochemistry）中首次被称为Western Blot。
二、解释：蛋白质免疫印迹（Western Blot）名词蛋白质在电泳之后也可以从胶中转移并固定到模型材料上，再与溶液中相应的蛋白质分子相互结合，其中最常用的是用抗体来检测，因此被称为免疫印迹（immunoblotting）。
相对应于DNA的Southern blotting和RNA的Northern blotting，蛋白质免疫印迹也被称为Western blotting。
三、Western Blotting 技术原理[1][2]：被测蛋白只能与标记的特异性抗体相结合，而这种结合不改变该蛋白在凝胶电泳中的相对分子质量。
四、Western Blotting 技术特点：高效、简便、灵敏等五、Western Blotting 技术显色的方法●放射自显影●底物化学发光ECL●底物荧光ECF●底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，发表文章通常是用底物化学发光ECL。
只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下二抗用HRP标记：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
六、Western Blotting 技术步骤：●蛋白样品的制备●SDS-PAGE电泳分离样品●将已分离的蛋白质转移到尼龙或其他膜上，转移后首先将膜上未反应的位点封闭起来以抑制抗体的非特异性吸附●用固定在膜上的蛋白质作为抗原，与对应的非标记抗体（一抗）结合●洗去未结合的一抗，加入酶偶联或放射性同位素标记的二抗，通过显色或放射自显影法检测凝胶中的蛋白成分。
蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法（Western Blot）是一种常用于检测蛋白质的方法。
其原理基于蛋白质电泳分离和特定抗体与目标蛋白质的特异性结合。
1. 样品制备：首先，待检样品经过蛋白质提取，然后经过电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）将样品中的蛋白质根据其分子量大小分离。
2. 蛋白转膜：随后，将分离得到的蛋白质通过电泳转印到聚合物（如聚偏氟乙烯）膜上，形成蛋白质膜。
3. 阻断：将膜置于含有蛋白质阻断剂（如牛血清白蛋白）的缓冲液中，阻止非特异性结合。
4. 抗体结合：将膜与特异性抗体一起孵育，抗体与目标蛋白质特异性结合。
这些抗体通常是经过免疫动物制备，针对目标蛋白质的特定抗原位点。
5. 靶蛋白检测：使用荧光标记或酶标记的二抗（即与第一抗体结合的抗体）与第一抗体结合。
这些二抗能够使特定结合的蛋白质与检测标记发生反应。
6. 信号检测：使用荧光标记物或底物，通过荧光检测或发色反应检测结合的蛋白质。
常用方法是使用化学发光底物，比如辣根过氧化物酶和酮硫磺胺基碳酸红等底物。
通过这个原理，蛋白质免疫印迹法可以提供关于特定蛋白质的存在、相对丰度以及蛋白质分子量等信息。
它在分子生物学和生物医学研究中被广泛应用于蛋白质分析和诊断。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot，WB）实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋⽩质转移到膜上，然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩，可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似，但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋⽩质，“探针”是抗体，“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应，经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基⼄醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：⽢氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；⼄酸2 ml；ddH2O118 ml。
Western-Blotting实验报告
Western-Blotting实验报告Western Blotting本次试验的⽬的是使同学们掌握Western Blotting法鉴定⽬标蛋⽩的原理和熟悉Western Blotting的⽅法，并了解抗原抗体结合反应的影响因素。
Western Blotting的blotting译为印迹法，是指将样品转移到固相载体上，⽽后利⽤相应的探测反应来检测样品的⼀种⽅法。
1975年，Southern建⽴了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利⽤DNA－RNA杂交检测特定的DNA⽚段的⽅法，称为Southern印迹法。
⽽后⼈们⽤类似的⽅法，对RNA和蛋⽩质进⾏印迹分析，对RNA的印迹分析称为Northern印迹法，对单向电泳后的蛋⽩质分⼦的印迹分析称为Western印迹法，对双向电泳后蛋⽩质分⼦的印迹分析称为Eastern印迹法。
Western既可以定性，⼜可以半定量，是初步鉴定蛋⽩质最⽅便也是最通⽤的⽅法。
它通常分为两种⽅法：同时Western⼜具有多种识别蛋⽩质的显⾊⽅法，主要有以下⼏种：i. 放射⾃显影ii. 底物化学发光ECL iii. 底物荧光ECF iv. 底物DAB呈⾊现常⽤的有底物化学发光ECL和底物DAB呈⾊。
⼀、实验原理Western Blotting（蛋⽩质免疫印迹法）是将经聚丙烯酰胺凝胶电泳奋⼒的蛋⽩质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质，且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质为抗原，与之对应的第⼀抗体发⽣免疫结合反应，⼀抗再与酶或同位素标记的第⼆抗体发⽣免疫结合反应，经过底物显⾊活放射⾃显影以检查电泳分离的提议⽬的蛋⽩成分。
蛋⽩质印迹技术结合了凝胶电泳分辨⼒⾼和固相免疫测定特异性⾼、敏感等诸多优点，能从复杂混合物中对特定抗原进⾏鉴别和定量检测。
聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(Acr)、N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis)和催化剂(AP)、加速剂(TEMED聚合成的三维⽹孔结构(凝胶）。
western实验操作原理及方法
蛋白免疫印迹（Western blotting）实验操作原理及方法一、实验目的：通过本实验，可以特异性的检测蛋白的表达水平。
二、实验原理：1、蛋白浓度测定：考马斯亮蓝（Coomassie Brilliant Blue）存在两种不同的颜色形式：红色和蓝色。
它和蛋白质通过范德华力结合，结合后燃料演的有红变蓝，最大光吸收由465 nm变成595 nm。
通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
此反应大约2 min即可完成，并可稳定1小时。
2、SDS凝胶：丙烯酰胺（Acr）和甲叉丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵（ammonium persulfate, (NH4)2S2O8, APS）或核黄素（ribofavin, VB2）和加速剂N, N, N’,N’-四甲基乙二胺（N, N, N’,N’-ytetramethyl ethylenediamine, TEMED）的作用下，聚合成三维网状结构。
* Acr和Bis之比可以决定胶的孔径等因素。
浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。
3、SDS-PAGE电泳：SDS是阴离子去垢剂，由于其带有大量负电荷，当与蛋白结合时，所带电荷大大超过了天然蛋白原有的负电荷，因而消除了蛋白之间原有的电荷差异，则电泳迁移率主要依赖于分子量，而与所带净电荷和形状无关。
三、实验方法及步骤：样品预处理：1、将细胞从平皿上刮下，离心后，用1 X PBS冲洗，12000rpm 1min离心，弃上清，细胞沉淀保存于-80℃。
2、把细胞沉淀取出，加M-PER或T-PER（Thermo，约为细胞体积的2~3倍），悬浮细胞。
10 mL M-PER或T-PER+50μL 200 mM Na3VO4+50μL 200 mM PMSF+1片IN（Roche，酶抑制剂复合物）3、将装有细胞悬液的Doff管固定在4℃层析柜中的脱色摇床上，max speed，剧烈摇1小时。
4、冰上，超声破碎（注意先用纯水清洗探头），AmL=35%超声10s，停顿5s，反复10次（探头不能碰到管壁，且始终保持在液面以下，尽量不要产生气泡）5、重新固定在脱色摇床上，4℃，1 h，max speed。
优化蛋白质免疫印迹Western Blot精品PPT课件
Western Blot
2.转移膜的选择
（1）最常用于Western Blot的转移膜主要是硝酸纤维素 （Nitrocellulose，NC）膜和聚偏二氟乙烯 （Polyvinylidene Fluoride, PVDF）膜，此外也有用尼龙膜、DEAE纤维素膜 做蛋白印迹。尼龙膜和NC膜的特点相似,主要用于核酸杂交。
挡板底部有气泡，或者两边聚合不完全。
③拖尾
样品溶解不好
④纹理（纵向条纹）样品中含有不溶性颗粒。
⑤条带偏斜
电极不平衡或者加样位置偏斜。
⑥条带两边扩散 加样量过多
需要注意：
Western Blot
（1）凝胶聚合不均匀，灌胶时候尽量混合均匀， 动作轻缓，放置加样孔出现不平。
（2）拔梳子要迅速，清洗加样孔要小心，以免把 上样带扭曲。
凝胶浓度与蛋白分离范围
凝胶浓度（％） 15 10 7.5 5.0
线性分离范围（KD) 12-43 16-68 36-94 57-212
Western Blot
（2）避免电泳中出现以下情况
①条带呈笑脸状 凝胶不均匀冷却，中间冷却不好或电泳系统温
度偏高。
②条带呈皱眉状 可能是由于装置不合适，特别是 凝胶和玻璃
Western Blot
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot 一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
Western Blot
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
Western Blot（间接）一般流程:
三种膜的比较
Western Blot
Western blot 实验原理和实验步骤
3 Western blot 流程图
Western Blot一般流程
1
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 洗膜 二抗杂交 洗膜 底物显色
蛋白样品的制备
2
1、细胞的处理：1、细胞计数，取5*10^4/well，500g离心5min。加入200ul PBS混匀，500g离心5min。去掉废液加入15ul PBS 再加入5ul 5Xloading buffer， 100C煮沸10min，冰上放置5min，稍离心。
第三步：是用自特异性的抗体检测出已经印迹在膜上的所要研究的相应抗原。免疫检测 的方法可以是直接的和间接的。现在多用间接免疫酶标的方法，在用特异性的第一抗体杂 交结合后，再用酶标的第二抗体（碱性磷酸酶（知AP）或辣根过氧化物酶（HRP）标记的 抗第一抗体的抗体）杂交结合，再加酶的底物显色或者通过膜上的颜色或 X 光底片上暴光 的条带来道显示抗原的存在。该技术被广泛应用于蛋白表达水平的检测中。
Western blot 实验原理和实验步骤
为什么要做蛋白质印迹实验？
研究一些体外的蛋白质分子，寻找目的蛋白是否存在样品当中 蛋白质的表达情况，上调或下调表达，在不同的样品中，样品之间的表达差异性。
目录
1
Western blot 基本原理
2
蛋白免疫印迹的组成
3
Western blot 一般流程
洗膜 用 TBST摇动洗三次，每次10min。 洗涤是为了洗去一抗与抗原的非特异性结合，洗涤的效果直接影响结 果背景的深浅。
二抗杂交
13
1、将PVDF膜放在密闭的自封袋或抗体盒中，加入稀释好的荧光二抗， 孵育 RT 0.5小时。（ 一般采用HRP标记的二抗，稀释比例参照说明书） 注：二抗的稀释比例不能太低，否则容易导致非特异性的结合。
Western blotting(蛋白质印迹)方法原理和优化-1
Western blotting（蛋白质印迹）方法原理和优化-1
抽滤
抽滤是一种直接将蛋白质转移到膜上的方法。
利用真空使溶解的样品滤过膜，蛋白质吸附到膜上，同时样品中其它成分被真空抽走。
另外，也可直接将样品点在膜表面使之干燥。
随后可对固定在膜上的蛋白质进行分析。
点印记和狭缝印记是抽滤方法的两种变型，用多支管装置将样品加到膜上成点状或狭缝图样。
这些方法可用于快速定性筛选大量样品或定量分析类似样品，尤其是测试复杂分析中实验参数的适用性。
另一种抽滤方法的变型是格栅免疫印迹，这种方法适用于高度平行的样品分析，当样品量及其优先并且不能用常规方法如ELISA进行分析时使用。
格栅免疫印迹可用于表征变态反应原-特异性抗体应答，只需最小量的病人血清。
当准备抽滤印迹膜时，要考虑以下方面：。
蛋白质免疫印迹实验(Western-BlotPPT课件
蛋白质免疫印迹实验
（Western Blotting）
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1
一 实验原理
Western Blotting 是用来检测蛋白质的一种技术。
首先将含有待测蛋白的蛋白质混合物进行凝胶电泳分离， 然后将已经分离的蛋白质通过电泳技术从凝胶转移到固 体支持物上，这一固体支持物目前常为硝酸纤维素薄膜。 随后以待测蛋白质上抗原决定簇特异性的抗体（称为第 一抗体）为探针，与固体支持物上的蛋白质进行免疫反 应，最后用偶联有辣根过氧化物酶或碱性磷酸酯酶的抗 第一抗体的抗体（第二抗体）与第一抗体进行免疫反应， 只有与第一抗体特异性结合的待测蛋白才能与第二抗体 发生免疫反应。在有辣根过氧化物酶的底物用显色剂存 在时就会出现颜色反应，结合有第一抗体、第二抗体的 待测蛋白，通过颜色反应即能显现出来。
缓冲液在室温下封闭2小时，同时1：100加入兔抗GST
western blotting原理及步骤
western blotting原理及步骤
Western blotting，也称为蛋白质印迹，是一种用于检测样品中特异性蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等的技术。
其原理基于抗原-抗体的特异性结合反应，通过将样品中的蛋白质进行电泳分离，然后转移到固相载体上，再与特异性抗体进行孵育，最后通过显色反应检测目标蛋白质的存在和位置。
Western blotting的步骤一般包括以下几步：
1. 样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，并进行浓度测定和保存。
2. 电泳分离：将样品中的蛋白质进行电泳分离，根据其分子量和电荷的不同，将蛋白质分开。
3. 转膜：将电泳分离后的蛋白质转移到固相载体上，常用的载体有硝酸纤维素膜、PVDF膜等。
4. 封闭：用特定的封闭液将膜封闭，以减少非特异性结合。
5. 孵育：将特异性抗体与膜孵育，使抗体与目标蛋白质结合。
6. 洗膜：用洗涤液将未结合的抗体洗去，减少背景干扰。
7. 显色：加入显色液，使抗体-抗原结合部位显色，从而检测到目标蛋白质的存在和位置。
8. 数据分析：对显色结果进行定量和定性分析，以获得目标蛋白质的表达情况和相互作用信息。
Western blotting具有较高的灵敏度和特异性，可以检测低浓度的蛋白质，并且可以半定量分析蛋白质的表达水平。
同时，Western blotting也可以用于研究蛋白质分子的相互作用。
然而，由于其步骤繁琐且易受干扰，Western blotting 的操作需要严格的质量控制和技术培训。
1。
蛋白印迹实验方法的原理和步骤
蛋白印迹实验，又被称为Western blot，是一种用于检测特定蛋白质的方法。
通过这种实验方法，研究人员可以确定样品中是否含有特定蛋白质，以及其相对浓度。
这一方法在生物医学研究中被广泛应用，对于研究蛋白质结构、功能和相互作用具有重要意义。
本文将介绍蛋白印迹实验的原理和步骤，希望能够帮助读者对这一实验方法有更深入的了解。
一、蛋白印迹实验的原理蛋白印迹实验的原理基于蛋白质的分子量及电荷特性。
当蛋白质被电泳分离后，可以通过膜转移和特异性抗体结合的方式来检测目标蛋白。
其基本步骤包括蛋白电泳分离、膜转移、抗体结合和信号检测。
1. 蛋白电泳分离蛋白印迹实验首先需要对样品中的蛋白进行电泳分离。
这一步骤通过SDS-PAGE或其他电泳方法进行，将蛋白质按照分子量大小进行分离。
分离过程中，蛋白质会在凝胶中形成不同的泳动带，便于后续的检测和分析。
2. 膜转移分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这一步骤通常通过湿式膜转移或半干式膜转移进行，目的是将蛋白质牢固地转移到膜上，并保持其原有的位置关系和相对分子量大小。
3. 抗体结合蛋白转移至膜上后，需要与特异性抗体结合。
这些抗体通常是针对特定蛋白的，并且标记有辅酶或发光物质，便于检测和定量分析。
抗体结合过程需要严格控制条件，确保特异性和灵敏度。
4. 信号检测最后一步是通过染色、荧光或化学发光的方式来检测抗体和蛋白的结合情况。
根据信号的强度和位置，可以确定目标蛋白的存在与否以及其相对浓度。
以上就是蛋白印迹实验的基本原理，下面将介绍蛋白印迹实验的具体步骤。
二、蛋白印迹实验的步骤1. 样品处理首先需要将研究样品进行处理，常见的处理方法包括蛋白溶解、沉淀和浓缩。
处理完毕后，样品中的蛋白质将变得易于电泳分离和检测。
2. 蛋白电泳将处理好的样品加载到SDS-PAGE凝胶上，进行蛋白电泳分离。
这一过程需要严格控制电场强度和时间，以确保蛋白质能够按照分子量大小进行有效分离。
3. 膜转移电泳分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白转移到膜上。
western-blot的原理及应用
Western Blot的原理及应用1. Western Blot的简介Western Blot，又称蛋白印迹法，是一种常用的蛋白质检测技术。
通过将待检的蛋白质样品分离、转移至膜上、以特定抗体探针探测目标蛋白质，然后用染色剂标记抗体来可视化目标蛋白。
2. Western Blot的原理Western Blot技术主要分为以下几个步骤：2.1 电泳分离将待检样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据蛋白质大小和电荷来确定聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型（SDS-PAGE、Native-PAGE等）。
2.2 转移将电泳分离出的蛋白质从凝胶转移到膜上，常用的转移方式包括湿式转移、半湿式转移和干式转移。
2.3 阻断使用适当的缓冲液对膜进行阻断，如牛奶、BSA等，用于防止非特异性结合。
2.4 探测抗体加入特异性一抗，与目标蛋白质结合。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以选择根据实验需求选择。
2.5 二抗探针加入与一抗来源不同动物的二抗探针，例如兔子抗鼠二抗或羊抗兔子二抗等，二抗探针会与一抗结合。
2.6 可视化通过染色剂等方法来可视化目标蛋白质，常用的方法有辣根过氧化物酶（HRP）标记的次级抗体与发光底物反应产生发光，或使用染色剂如染蓝等。
3. Western Blot的应用Western Blot技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括：3.1 蛋白质鉴定与定量Western Blot技术可以快速鉴定蛋白质的存在与纯度，通过与已知标准蛋白质比较可以进行定量分析。
3.2 抗体检测和验证通过Western Blot可以检测抗体的特异性和亲和力，验证抗体的质量和功能。
3.3 蛋白质翻译后修饰的研究Western Blot可以用于检测蛋白质的磷酸化、甲基化、酰化等翻译后修饰，帮助我们了解蛋白质功能的调控机制。
3.4 疾病诊断和治疗研究Western Blot在临床疾病的诊断和治疗研究中起着重要作用，如肿瘤标志物的检测、药物疗效的评估等。
蛋白质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项
蛋⽩质免疫印迹（WesternBlot）实验步骤和原理及注意事项蛋⽩质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋⽩样品(Protein sample preparation)可以使⽤适当的裂解液。
收集完蛋⽩样品后，为确保每个蛋⽩样品的上样量⼀致，需要测定每个蛋⽩样品的蛋⽩浓度。
根据所使⽤的裂解液的不同，需要采⽤适当的蛋⽩浓度测定⽅法。
因为不同的蛋⽩浓度测定⽅法对于⼀些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很⼤。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋⽩样品中加⼊适量浓缩的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液。
使⽤5X的SDS-PAGE蛋⽩上样缓冲液可以减⼩上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋⽩样品。
100℃或沸⽔浴加热3-5分钟，以充分变性蛋⽩（根据蛋⽩分⼦的⼤⼩，煮沸时间可适当变化，⼀般不低于5min。
煮沸只是变性蛋⽩，⽽不是分解，⼀般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋⽩质的⽴体⼆级结构,伸展为⼀维线性结构,所以⼀般来讲⼆聚体都会解体,才能完全按照分⼦量跑电泳,加的蛋⽩Marker才有指⽰分⼦量的意义。
蛋⽩样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋⽩呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离⼼5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另⼀管,4度可以放⼀周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：⼀只⼿扣紧玻璃板，另⼀只⼿蘸点洗⾐粉轻轻擦洗。
两⾯都擦洗过后⽤⾃来⽔冲，再⽤蒸馏⽔冲洗⼲净后⽴在筐⾥晾⼲。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放⼊夹中卡紧。
然后垂直卡在架⼦上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加⼊TEMED后⽴即摇匀即可灌胶。
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蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化已有2975 次阅读2008-6-19 10:43 |个人分类:生活点滴蛋白质印迹（Western blotting）方法原理和优化抽滤抽滤是一种直接将蛋白质转移到膜上的方法。
利用真空使溶解的样品滤过膜，蛋白质吸附到膜上，同时样品中其它成分被真空抽走。
另外，也可直接将样品点在膜表面使之干燥。
随后可对固定在膜上的蛋白质进行分析。
点印记和狭缝印记是抽滤方法的两种变型，用多支管装置将样品加到膜上成点状或狭缝图样。
这些方法可用于快速定性筛选大量样品或定量分析类似样品，尤其是测试复杂分析中实验参数的适用性。
另一种抽滤方法的变型是格栅免疫印迹，这种方法适用于高度平行的样品分析，当样品量及其优先并且不能用常规方法如ELISA进行分析时使用。
格栅免疫印迹可用于表征变态反应原-特异性抗体应答，只需最小量的病人血清。
当准备抽滤印迹膜时，要考虑以下方面：去污剂可以抑制蛋白吸附到膜上。
用于样品溶解和漂洗的缓冲液所含去污剂不应超过0.05%，并且仅当必要时才能加入。
样品体积应足以覆盖每个孔中的膜面积，但所含蛋白量不应超过膜的结合能力。
含较多颗粒的样品可能堵塞膜孔，而高黏度样品将降低流速。
所以在结合前先通过预过滤或离心除去颗粒，只将上清加到膜上。
而粘性样品要用缓冲液稀释。
Western印迹Western印迹含一系列步骤，包括：用聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白样品。
将胶上的蛋白转移到膜上。
鉴定膜上特定蛋白。
下面将从理论和实践方面讨论Western印迹方法。
用1-D或2-D凝胶分离复杂蛋白质混合物印迹前分离复杂蛋白质混合物的最常见方法是一维（1-D）SDS-PAGE电泳，它根据蛋白质的分子量进行分离。
有时用非变性电泳分离天然蛋白质。
尽管这种方法通常缺乏变性电泳的分辨率，但当蛋白须保留生物活性时非常有用。
二维（2-D）凝胶电泳用于分析细胞、组织、和体液蛋白质的组成，是现代蛋白质组学的关键技术。
2-D免疫印迹可提供分子量和等电点信息，并可用于区分翻译后修饰产生的不同蛋白质形式。
有些情况下只进行1-D电泳分离也可用免疫印迹对蛋白分型。
分子量标准在凝胶中加入分子量标准或标记物可以在电泳分离后估计感兴趣蛋白质的大小。
有两种类型的分子量标准：未染色和预染色。
未染色分子量标准通常由天然或重组的纯化蛋白混合物组成。
在凝胶或膜上显示其位置需要染色步骤。
预染标准允许在电泳过程中监测蛋白分离，也可以在随后的印迹步骤中指示转移效率。
然而，它们比较昂贵且加入染料会影响蛋白迁移率。
预染标准在确定分子量时可能不够精确，并且蛋白质上附加的染料在转移时会影响它们吸附到膜上的能力。
聚丙烯酰胺浓度凝胶中聚丙烯酰胺浓度可以是均一浓度或是梯度浓度。
最常见的聚丙烯酰胺浓度为10%，最适合分离10-150KD范围内的蛋白质。
若要分析未知蛋白或许要更宽的分离范围，推荐使用梯度胶。
例如：4-12%Tris-glycine凝胶适合于30-200KD蛋白质的分离，而10-20%凝胶则能成功地分离6-15KD的蛋白质。
SDS-PAGE凝胶通常为1.0到1.5mm厚；但蛋白转印最好使用更薄的胶。
凝胶电泳缓冲液最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris-甘氨酸或Tris-tricine组成。
缓冲液可以包含0.1%去污剂，通常是SDS。
Tris-甘氨酸凝胶可用于分离很宽分子量范围（6-200KD）的蛋白质，并可与变性或非变性条件相容。
Tris-tricine最适于分离小分子蛋白质（<10KD）,加样之前还需要还原变性。
两种缓冲系统都与蛋白质转印PVDF膜兼容。
Tris-乙酸缓冲液有时被用来分离大分子蛋白。
将蛋白质从凝胶转移到膜蛋白质从凝胶转移到膜上的过程中同时保持它们的相对位置和分辨率，这被称为印迹。
印迹可以以三种不同的方式实现：简单扩散：将膜放在凝胶上，同时放一沓干滤纸在膜上，并在滤纸上放置重物以加快扩散过程。
这种方法可用于将蛋白质从一块凝胶上转移到多个膜上，同一凝胶可得到几个印迹膜。
扩散法的主要缺点是不能定量转移，与电转比较只能转移25-50%的蛋白质。
真空辅助溶剂流动：用泵的吸力将分离的蛋白质从凝胶转移到膜上，高低分子量的蛋白质都可以用这种方法转移；然而，分子量小于14KD的蛋白质需要用较小孔径的膜（0.2um），因为它们不易被0.45um膜吸附。
很少从聚丙烯酰胺凝胶中真空转印蛋白质，而从琼脂糖中转移核酸则常用此法。
电洗脱或电转移：最常用的转移方法，与扩散或真空印迹相比，其主要优点是速度和转移更完全。
电转移方法两种常用的电转移方法是湿转和半干转。
两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和施加电场的机械装置不同。
湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然后加电压。
这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲液且只能用一种缓冲液。
另外用这种方法转移2-D电泳中常规使用的大胶比较困难。
湿转系统一般在恒压条件下进行，转移过程中混合缓冲液保持电流相对恒定。
半干转移，用浸透缓冲液的多层滤纸代替缓冲液槽。
因为电极板直接与滤纸接触，使凝胶中电场强度尽可能大以快速高效转移。
与湿转相比，这种方法又快（15-45分钟）又好。
多数半干转移方法使用一种以上的缓冲系统，可以同时高效转移大小不同的蛋白。
然而，半干印迹系统因缓冲液较少不适于较长时间转移。
对于大2-D胶的印迹，半干转移是理想选择。
半干印迹仪一般使用恒流条件，转移过程中电压逐渐增加。
半干转移系统中，滤纸和膜切成和凝胶相同大小，这样电流必须通过凝胶，否则，在凝胶边缘处滤纸重叠将导致电流短路。
两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝胶和膜之间的任何地方存在气泡。
气泡阻碍转移并在印迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。
转移缓冲液转移缓冲液提供电极之间的电连接，必须能够导电。
同时它也提供一种化学环境保证蛋白溶解，而不需担心蛋白质在转移过程中不能吸附到膜上。
常规配方可满足多数蛋白样品的需要。
多数缓冲液在转移过程中产生热量。
针对此原因，很多湿转装置配备嵌入式冷却线圈。
湿转也可在冷室中进行，缓冲液使用前可预冷。
半干转移中电极板起到散热器功能。
但它们的散热能力有限，一般半干转移不能进行太长时间。
传统转移缓冲液由缓冲系统和甲醇组成。
Towbin缓冲液，一种Tris-甘氨酸缓冲液，常用于湿转系统。
该缓冲液PH为8.3，比大多数蛋白质的等电点（pI）要高。
蛋白质带净负电荷并向阳极迁移。
因为缓冲液在槽中混合，转移过程中离子分布相对稳定。
半干系统使用三缓冲液系统。
使用三种缓冲液是因为转移是等速电泳过程，蛋白质在前导离子和尾随离子之间迁移。
三种缓冲液是：阳极缓冲液Ⅰ：0.3M Tris, PH 10.4阳极缓冲液Ⅱ：25mM Tris, PH 10.4阴极缓冲液：25mM Tris, 40mM ε-氨基乙酸，PH 9.4阳极缓冲液Ⅰ中和阳极板表面产生的过量质子。
阳极缓冲液Ⅱ含与阳极缓冲液Ⅰ相同的PH,但Tris浓度降低到25mM。
阴极缓冲液含ε-氨基乙酸，转移过程中作为尾随离子，随着蛋白穿透凝胶迁移到阳极不断被消耗掉。
通常不推荐用单缓冲液代替三缓冲液系统。
单缓冲系统中整个凝胶转移有不一致的趋势，且经常转移不彻底。
尽管上述缓冲液系统适用于大多数蛋白转移，文献中还有很多适于不同应用的变化类型。
最明显的变化之一是推荐10mM CAPS缓冲液（PH 11）用于蛋白质测序。
在使用Edman化学法进行自动蛋白质测序时，Towbin缓冲液以及凝胶电泳缓冲液中的甘氨酸会引起高背景。
改变缓冲液成分可以显著降低这种影响。
对缓冲强度和组成的任何修饰都应非常注意，确保转移装置不会过热。
准备蛋白质鉴定膜干燥转移完成以后，在继续染色或免疫检测程序之前应将PVDF膜完全干燥。
干燥可提高蛋白吸附到PVDF聚合物上的能力，有助于降低随后分析过程中的解吸。
印迹膜干燥后就变得不透明了，这种光学变化是一种表面现象，可以掩盖截留在深部孔中的水分，应按照推荐时间干燥印迹膜，以确保所有液体从膜的孔结构中蒸发出来。
蛋白转移后干燥的PVDF膜可长时间保存，这对膜没有不利影响（4℃可保存2周，-20℃可保存2个月，-70℃可保存更长时间）。
然而，在非控制条件下长期保存可能使有些蛋白对化学变化（如氧化、脱酰胺、水解）敏感。
推荐在低温下长期保存。
一旦干燥后，在进行任何分析之前，应将膜在100%甲醇中浸泡润湿。
蛋白质显像染色染色是显示印迹膜上蛋白质的一种简单方法。
染色可用于：验证蛋白质已经转移到膜上，确定各泳道加样量是否相等评价整体转移效率，尤其是使用新缓冲液系统或蛋白样品时。
有多种染料可以使用，如有机染料（丽春红、酰胺黑、坚牢绿、考马斯亮蓝），荧光染料（荧光胺、香豆素）和胶体微粒（金、银、铜、铁或印度黑墨汁）。
这些染料可分为可逆和不可逆染料。
通常不可逆染料的灵敏度最佳，但它干扰或无法对蛋白进行进一步分析。
不可逆染料的实例有酰胺黑和考马斯亮蓝。
可逆染料尽管灵敏度较低，但它允许评估印迹膜后从膜上将其洗除。
最常用的可逆蛋白染料是立春红。
如果靶蛋白丰度太低，则无法用染色法检测到，但对于较高丰度蛋白，染色法通常可以体现蛋白的转移情况。
用于印迹膜的新荧光染料高度灵敏且可与下游免疫检测、Edman测序和质谱相容。
在用显色、荧光或化学发光法进行免疫检测之前，可使用Sypro Ruby和Sypro Rose蛋白印迹染料(分子探针)，它们的灵敏度可达约12ng/带。
下表列出检测Western印迹膜上蛋白时最常用的染料：透视透视是一种专用于PVDF膜的显像方法，它首先应用于Immobilon-P转印膜。
该方法基于一种假设，即转移蛋白覆盖的PVDF膜部分能在20%甲醇中润湿，而周围未结合蛋白的PVDF 膜区域则不能。
PVDF膜润湿的部分变得可透光，可用背光显示蛋白带并拍照存档。