蛋白质印迹法WesternBlot技术
westernblot原理及步骤
蛋白质印迹法(免疫印迹试验)即Western Blot。
它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品进行着色。
通过分析着色的位置和着色深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
原理：
与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
步骤：
Western Blot与Southern印迹杂交或Northern印迹杂交方法类似，Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品(跑PAGE 胶的原理你懂吧~~~)，转移到固相载体（硝酸纤维素膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保
持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变（这个过程就是转膜）。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
蛋白免疫印迹杂交（WesternBlot）技术手册
蛋白免疫印迹杂交 Western Blot 技术手册蛋白免疫印迹杂交 Western Blot WB 是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离 再转移到杂交膜blot 上 然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。
本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析 有助于成功完成WB。
A 蛋白样本提取制备1 细胞或组织裂解2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂3 蛋白定量4 电泳上样样品的准备B 电泳 1 PAGE胶的制备2蛋白分子量Marker 3 阳性对照4 内参对照5 上样与电泳 C 转膜与显色Western Blot 1 胶中蛋白的检测2 蛋白转膜3 膜上蛋白的检测 丽春红4膜的封闭 5 一抗的孵育6 二抗的孵育7 显色 D 常见问题分析与解决方案附录1 WB实验试剂配制方法附录2 SDS-PAGE胶的配制2WB概述: 检测原理: 3A 蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步 更是决定WB成败的关键步骤 总体原则和注意事项 1 尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白 通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品 2 保持蛋白的处于溶解状态 通过裂解液的PH 盐浓度表面活性剂、还原剂等的选择 3 提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等 低温操作 加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 尽量去除核酸 多糖 脂类等干扰分子 通过加入核酸酶或采取不同提取策略 5 样品分装 长期于-80℃中保存 避免反复冻融。
A-1 细胞或组织裂解A-1-1 细胞裂解裂解液Lysis buffer或商品化蛋白抽提试剂盒的选择目的蛋白分布定位推荐裂解液Lysis buffe 推荐试剂盒全细胞NP-40 or RIPA 附录1 全蛋白抽提试剂盒细胞质 可溶蛋白 Tris-HCl 附录1 胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质 细胞骨架等不溶蛋白Tris-Triton 附录1 蛋白分级抽提试剂盒细胞质 磷酸化蛋白 磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA 附录1 膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA 附录1 核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA 附录1 线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法 1 培养的细胞经预冷的PBS漂洗2次 裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制剂 种类与量见本节2 2 吸净PBS 加入预冷的裂解液 1 ml per 107 cells/100mm dish/150cm2 flask 0.5ml per 5x106 cells/60mm dish/75cm2 flask. 3 用细胞刮子刮取贴壁细胞 将细胞及裂解液温和地转移至预冷的微量离心管中 4 4℃摇动30 min 5 4℃离心12000 rpm 20 min 根椐细胞种类不同调整离心力 6 轻轻吸取上清 转移至新预冷的微量离心管中置于冰上 即为蛋白样本 弃沉淀. A-1-2 组织裂解 1 用灭菌的预冷的工具分离目的组织 尽量置于冰上以防蛋白酶水解 2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf管中 加入液氮冻结组织于冰上均质研磨 长期可保存于-80°C 3 每约5 mg加入约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer 冰浴匀浆后置于4℃摇动2小时 裂解液体积与组织样本量有适当比例 最终的蛋白浓度至少达到0.1 mg/ml 理想的蛋白浓度应为1-5 mg/ml. 4 4℃离心12000 rpm 20 min 轻轻吸取上清 转移至新预冷的微量离心管中置于冰上 即为蛋白样本 弃沉淀A-2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4 推荐购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL 或按下表配制 备注 其中Sodium orthovanadate 配制活化方法如下 所有步聚均需在通风橱中进行 1. 用双蒸水配制100 mM 正矾酸钠溶液. 2. 用盐酸HCl 调至pH 9.0 3. 煮沸至溶液无色尽量减少水分挥发. 4. 冷却至室温 5. 再调pH 至9.0 6. 再煮沸至无色7. 重复上述过程直至溶液煮沸冷却后达pH 9.0 8. 用水定容至原体积9. 分装保存于- 20°C. 溶液变黄则弃之不用. A-3 蛋白定量Bradford 法Lowry 法或BCA 法 均有商品化试剂盒可选择 操作简单、需分光光度计或酶标仪 小牛血清白蛋白BSA 作为标准曲线。
western blotting(蛋白免疫印迹)
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蛋白样品的制备
① SDS是一种很强的阴离子表面活性剂，它可以断开分子内和分
子间的氢键,破坏蛋白质分子的二级和三级结构。
② 强还原剂巯基乙醇（或二硫苏糖醇，DTT）可以断开 二硫键，破坏蛋白质的四级结构。使蛋白质分子被解 聚成肽链形成单链分子。解聚后的侧链与SDS充分结 合形成带负电荷的蛋白质-SDS 胶束。 ③ 蛋白质的电泳迁移率主要决定于亚基的相对分子质量 ，而与其形状及所带电荷的性质无关。
电泳缓冲液：pH8.3 Tris- 甘氨酸系统
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PAGE：聚丙烯酰胺凝胶电泳
聚丙烯酰胺凝胶(polyacrylamide gel，简称PAG): 单体 丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr) 交联剂 N,N-甲叉双丙烯酰胺 加速剂 N,N,N,N-四甲基乙二胺(TEMED) 催化剂 过硫酸铵 三维网状结构的凝胶，该凝胶化学惰性强，具有 一定的机械强度和透明度，是良好的电泳介质， 以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电 泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称 PAGE)。
对 策
5. 抗体浓度过高
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Thanks！
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压太高。转膜过程注意降温
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四、SDS-PAGE常见问题
背景太高
原因
1. 2. 3. 4. 膜没有均匀浸湿 膜或者缓冲液污染 封闭不充分 抗体与封闭剂出现交叉 反应
1. 转膜前用100%甲醇将膜完 全浸湿 2. 拿取膜与吸水纸时要戴手 套，更换新鲜转膜缓冲液 3. 检测一抗、二抗与封闭剂 是否有交叉反应 4. 杂交前检测一抗、二抗的 工作浓度
蛋白质免疫印迹技术详解
1
主要内容
一、Western Blot 简介 二、Western Blot 一般流程
western blot 蛋白印迹法
Western blot 蛋白印迹法原理：固相载体（硝酸纤维素膜）吸附蛋白质作为抗原，相应的一抗结合上蛋白质，再与同位素或荧光标记的二抗结合，经过底物显色或放射性自显影的方法，以检测电泳分离的目的蛋白。
既可定性，也可半定量检测蛋白质。
一、提取蛋白1、细胞数107，1*PBS洗涤细胞2遍（1500rmp 5min），转移到1.5ml EP管2、冰上操作，加入裂解液50-100ul混匀。
（蛋白裂解液：蛋白酶抑制剂=100：1）3、插入冰盒30min，每10分钟震荡混匀一次4、最高速离心，移上清至新的EP管中，记录液体体积数5、取2ul 4液体至58ul的PBS中，稀释30倍，Eppendorf biophotometer plus（爱普多夫核酸蛋白测量仪）测量蛋白浓度。
6、在4中加入1/4体积的5* loading buffer，混匀后99°C水浴变性10min（使之成为线性结构，暴露抗原），放-40度保存二、配胶1、玻璃板洗净：洗衣粉—自来水—双蒸水—烘箱烤干—齐、准、正向、上架子2、配胶加入TEMED充分混合后立即灌胶（边灌边摇晃枪头液体不要加完，防止进入空气）注意事项：灌分离胶时用1ml枪吸胶沿玻璃板放出，待胶面到绿带中间线高度即可（齿梳下缘1cm）处，封胶用水要慢，避免冲破胶。
30min，水胶分界清楚后胶凝。
胶凝后滤纸吸出水层，上浓缩胶，上胶后立即上梳子，梳子平行插入，避免产生气泡。
浓缩胶凝固后，将梳子竖直向上轻轻拔出（关键步骤，齿孔齐平！！）梳子两边加少量胶液，防止第一空变形。
3、用水冲洗浓缩胶，洗去孔内碎胶，将其放入电泳槽中。
加足够电泳液后准备上样（电泳液要浸没玻璃钢，外侧加到1/3）4、根据蛋白浓度，每孔蛋白30—100ug，上样约4—7ul，将枪头入孔加样，marker3—5ul。
5、接电源，80v起，蛋白跑到分离胶以后用100v 1h或90min，一直到溴酚蓝跑出胶即可终止电泳。
蛋白质印迹法WesternBlot技术
电泳步骤： 1.清洗玻璃板 2.灌胶与上样 （1）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂 直卡在架子上准备灌胶 （2）配置10%的分离胶，加入TEMED后立 即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2／ 3处即可，然后胶上加一层水，液封后的胶 凝的更快（30min）。
（3）当水与胶之间有一条明显的折射线时， 说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒 去上层水，并用吸水纸将水吸干。 （4）按方法配置5%的浓缩胶，加入TEMED 后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓 缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，待浓缩 胶凝过后，两手分别捏住梳子的两端竖直 向上轻轻将其拔出（一般20分钟时最好 拔）。 (5将装置放入电泳槽中，加入足量的电泳液 后开始准备上样（电泳液至少漫过小玻璃 板内侧）
（1）25mg/mL BSA的配制: 取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白 标 准(20mg BSA)中，充分溶解后配制 25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用， 也以-20℃长期保存。 （2）1mg/mL BSA的配制: 取BSA贮备液25mg/mL（0.1mL），用 1×loading buffer（2.4mL）稀释至2.5mL， 按0.5mL分装成5个包装，标记放入-20℃。 （3）60% TCA工作液的配制: 取2.2g TCA（三氯醋酸）溶于3.67mL双蒸水 中，即为60% TCA工作液，使用前配制。 （4）配制BSA标准系列和样品 如表格：
封闭
用5%的脱脂奶粉封闭液 （2.5g脱脂奶粉， 50mlPBST缓冲液）封闭， 在摇床上封闭一小时。
一抗杂交
一抗稀释液：一抗，10ml PBST，0.1g脱脂 奶粉，30ul叠氮钠。用PBST稀释一抗至适当 浓度（一抗使用前要3000r／min离心3min）。 将一抗稀释液倒入保鲜膜袋内，从封闭液中 取出膜用滤纸吸干残留液体，将膜放入一抗 稀释液中，膜蛋白面与抗体液面接触。室温 下脱色摇床20min,4℃过夜。次日用PBST缓 冲液室温脱色摇床上洗三次，每次10min。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质印迹法westernblot应用介绍
定量Western Blot技术
定量Western Blot技术能够准确定量蛋白质的表达水平，为比较不同样品之间的蛋白质表达差异提供 了可靠的工具。
该技术采用了同位素标记、荧光染料标记等方法，通过与标准品进行比较，计算出蛋白质的相对表达量。
该技术的应用范围广泛，包括药物靶点筛选、疾病标志物 发现、蛋白质相互作用研究等领域。
Western Blot与其他蛋白质分析技术的联用
Western Blot可以与其他蛋白质分析技术联用，如质 谱技术、免疫共沉淀等，以获得更全面的蛋白质信息。
通过将Western Blot与质谱技术联用，可以获得蛋白 质的氨基酸序列和修饰信息，有助于深入了解蛋白质
缺点
操作繁琐、耗时长、成本较高、对实验条件和操作技能要求较高。
02 Western Blot在科研中 的应用
验证抗体特异性
抗体特异性验证
通过Western Blot，可以验证抗体的 特异性，确保抗体只针对目标蛋白进 行反应，而不与其他非目标蛋白发生 交叉反应。
抗体稀释度测试
通过Western Blot，可以测试抗体的最 佳稀释度，以获得最佳的检测效果。
定量Western Blot技术的应用范围广泛，包括生物标志物发现、药物作用机制研究、疾病发病机制研究 等领域。
蛋白质组学与Western Blot的结合应用
蛋白质组学与Western Blot的结合应用能够实现大规模蛋 白质组学研究与特异性蛋白质检测的有机结合。
通过将Western Blot技术与蛋白质组学技术相结合，可以 同时获得蛋白质的特异性和丰度信息，为深入了解蛋白质 的功能和作用机制提供有力支持。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
蛋白免疫印迹杂交(WesternBlot)技术手册
蛋白免疫印迹杂交〔Western Blot〕技术手册A蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting 的第一步，更是打算WB 成败的关键步骤，总体原则和留意事项：1：尽可能提取完全或降低样本简洁度只集中于提取目的蛋白〔通过承受不同提取方法或选择不同的试剂盒产品〕2：保持蛋白的处于溶解状态〔通过裂解液的PH 盐浓度外表活性剂、复原剂等的选择〕3：提取过程防止蛋白降解、聚拢、沉淀、修饰等，〔低温操作，参与适宜的蛋白酶和磷酸酶抑制剂〕4：尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子〔通过参与核酸酶或实行不同提取策略〕5：样品分装，长期于-80℃中保存，避开反复冻融。
A-1细胞或组织裂解A-1-1细胞裂解裂解液Lysis buffer 或商品化蛋白抽提试剂盒的选择*目的蛋白分布定位推举裂解液Lysis buffe 推举试剂盒全细胞NP-40 or RIPA〔附录1〕全蛋白抽提试剂盒细胞质〔可溶蛋白〕Tris-HCl〔附录1〕胞浆蛋白和核蛋白抽提试剂盒线粒体蛋白提取试剂盒细胞质〔细胞骨架等不溶蛋白〕Tris-Triton〔附录1〕蛋白分级抽提试剂盒细胞质〔磷酸化蛋白〕磷酸化蛋白抽提试剂盒细胞膜NP-40 or RIPA〔附录1〕膜蛋白抽提试剂盒蛋白分级抽提试剂盒细胞核RIPA〔附录1〕核蛋白抽提试剂盒线粒体RIPA〔附录1〕线粒体蛋白抽提试剂盒亚细胞定位蛋白抽提试剂盒细胞裂解操作方法：1培育的细胞经预冷的PBS 漂洗2 次，裂解液中参与蛋白酶和磷酸酶抑制剂〔种类与量见本节2〕2吸净PBS，参与预冷的裂解液，〔(1 ml per 107cells/100mm dish/150cm2flask; 0.5ml per 5x106cells/60mm dish/75cm2flask).3用细胞刮子刮取贴壁细胞，将细胞及裂解液温存地转移至预冷的微量离心管中，44℃摇动30 min54℃离心12,000 rpm，20 min〔根椐细胞种类不同调整离心力〕6轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀.A-1-2组织裂解1 用灭菌的预冷的工具分别目的组织，尽量置于冰上以防蛋白酶水解，2 将组织块放在圆底的微量离心管或Eppendorf 管中，参与液氮冻结组织于冰上均质研磨，长期可保存于-80°C，3每约5 mg 参与约300 μl 预冷的裂解液lysis buffer，冰浴匀浆后置于4℃摇动2 小时，裂解液体积与组织样本量有适当比例，〔最终的蛋白浓度至少到达0.1 mg/ml, 抱负的蛋白浓度应为1-5 mg/ml).44℃离心12,000 rpm，20 min，轻轻吸取上清，转移至预冷的微量离心管中置于冰上，即为蛋白样本，弃沉淀,A-2蛋白酶和磷酸酶抑制剂推举购商品化蛋白酶和磷酸酶抑制剂复合试剂盒或COOKTAIL。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot（免疫印迹）是一种常用的实验技术，用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论：通过Western blot实验可以得出以下结论：1. 确定蛋白质的表达水平：Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平，比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调，通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定：Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否，通过与已知目标蛋白的分子量进行比较，可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态：一些蛋白质在翻译后会发生修饰，如磷酸化、糖基化等，这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态，并进一步探究其功能。
注意事项：在进行Western blot实验时，有一些注意事项需要遵守，以保证实验的准确性和可靠性：1. 样品制备：样品的制备至关重要，要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等，避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离：Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳，要注意合理选择电泳条件和胶液浓度，以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀，可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件：Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方，需要根据蛋白质的大小和性质进行优化，以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择：选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测，主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化，以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择：Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物（如HRP）的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术，其基本原理是蛋白质的印迹技术，即把蛋白质从复杂的样品中分离出来，并转移到固相支持物上，再与特异性抗体结合，通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理：首先，需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质，可以采用不同的提取方法，如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳：将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中，通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应：将膜上的蛋白质与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应：通过化学反应，使抗原-抗体复合物显色，便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察：对于较小的样品，可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理：提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度，避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳：分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行，以确保蛋白质能够完全分离。
同时，应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数，避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应：应注意抗体滴度的选择，确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时，应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应：应注意显色试剂盒的质量和操作步骤，确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时，应注意显色颜色的稳定性，避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察：应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护，确保电子显微镜能够正确成像。
同时，应注意样品的制备和处理，确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件：实验过程中应注意调整实验条件，如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等，以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性：在进行Westernblot实验时，应注意重复性实验的开展，以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之，Westernblot技术虽然复杂，但只要掌握了其原理和方法，并注意以上注意事项，就能够获得准确可靠的结果。
蛋白印迹实验方法的原理和步骤
蛋白印迹实验，又被称为Western blot，是一种用于检测特定蛋白质的方法。
通过这种实验方法，研究人员可以确定样品中是否含有特定蛋白质，以及其相对浓度。
这一方法在生物医学研究中被广泛应用，对于研究蛋白质结构、功能和相互作用具有重要意义。
本文将介绍蛋白印迹实验的原理和步骤，希望能够帮助读者对这一实验方法有更深入的了解。
一、蛋白印迹实验的原理蛋白印迹实验的原理基于蛋白质的分子量及电荷特性。
当蛋白质被电泳分离后，可以通过膜转移和特异性抗体结合的方式来检测目标蛋白。
其基本步骤包括蛋白电泳分离、膜转移、抗体结合和信号检测。
1. 蛋白电泳分离蛋白印迹实验首先需要对样品中的蛋白进行电泳分离。
这一步骤通过SDS-PAGE或其他电泳方法进行，将蛋白质按照分子量大小进行分离。
分离过程中，蛋白质会在凝胶中形成不同的泳动带，便于后续的检测和分析。
2. 膜转移分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这一步骤通常通过湿式膜转移或半干式膜转移进行，目的是将蛋白质牢固地转移到膜上，并保持其原有的位置关系和相对分子量大小。
3. 抗体结合蛋白转移至膜上后，需要与特异性抗体结合。
这些抗体通常是针对特定蛋白的，并且标记有辅酶或发光物质，便于检测和定量分析。
抗体结合过程需要严格控制条件，确保特异性和灵敏度。
4. 信号检测最后一步是通过染色、荧光或化学发光的方式来检测抗体和蛋白的结合情况。
根据信号的强度和位置，可以确定目标蛋白的存在与否以及其相对浓度。
以上就是蛋白印迹实验的基本原理，下面将介绍蛋白印迹实验的具体步骤。
二、蛋白印迹实验的步骤1. 样品处理首先需要将研究样品进行处理，常见的处理方法包括蛋白溶解、沉淀和浓缩。
处理完毕后，样品中的蛋白质将变得易于电泳分离和检测。
2. 蛋白电泳将处理好的样品加载到SDS-PAGE凝胶上，进行蛋白电泳分离。
这一过程需要严格控制电场强度和时间，以确保蛋白质能够按照分子量大小进行有效分离。
3. 膜转移电泳分离完毕后，需要将凝胶上的蛋白转移到膜上。
蛋白质印迹法
中文名称：蛋白质印迹法英文名称：Western blotting;immunoblotting其他名称：免疫印迹法;Western印迹法;免疫印迹法 (immunoblotting)定义1：一种分析和鉴定特定蛋白质的技术。
即将混杂的蛋白质经聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，转移至固相膜上，再用标记的抗体或二抗与之反应，以显示膜上特定的蛋白条带。
所属学科：免疫学（一级学科）；应用免疫（二级学科）；免疫学检测和诊断（三级学科）定义2：将经过凝胶电泳分离的蛋白质转移到膜(如硝酸纤维素膜、尼龙膜等)上，再对转移膜上的蛋白质进行检测的技术。
转移可用电泳法等。
检测常用与特定蛋白结合的标记抗体或配体。
由此可判断特定蛋白质的存在与否和分子量大小等。
所属学科：生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）定义3：总蛋白进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，后将蛋白质转至尼龙膜，用特定蛋白质抗体进行免疫反应，显色后可显示该特定蛋白的存在与表达量。
用来检测在不均一的蛋白质样品中是否存在目标蛋白的一种方法。
所属学科：细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）定义4：蛋白质分子从电泳凝胶转移到固相介质，然后用抗体进行免疫检测。
所属学科：遗传学（一级学科）；分子遗传学（二级学科）western免疫印记Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
westernblot原理
westernblot原理
Western Blot（西方印迹法）是一种鉴定蛋白质的细胞生物学实验技术。
它利用电泳
技术将感兴趣的蛋白质从细胞内及外的复杂的混合物环境中分离出来，然后在一特殊条件
下将其用抗体、特异性反应连接物或其他特定标记检测方法检测出来。
Western blot技术的基本原理与免疫学原理一致，即检测抗原的特异性抗体的特性。
例如，当抗原蛋白质混合物中存在特异性的抗原性基因片段时，检测抗原蛋白质的抗体将
特异性地结合到抗原基因片段上，而检测抗原蛋白质混合物中不存在的或者很少存在的其
他抗原性基因片段，则不会被特异性抗体结合，而是被特定标记检测方法检测出来。
Western blot实验技术步骤包括：1）将抗原性蛋白质混合物经过抗体特异性抗原基
因片段的凝集形成蛋白质复合体；2）利用电泳技术将能够形成蛋白质复合体的蛋白质物
质从细胞内和外的复杂环境中分离出来；3）在一定条件下用抗体或其他特定标记检测方
法将这些分离出来的蛋白质物质检测出来，根据检测结果判断各个抗原之间的关系。
Western blot实验技术的优点在于它能够快速、简单的检测抗原性蛋白质的特异性，它也可以检测在细胞内外复杂环境中出现的相对较少的蛋白质物质，尽管抗体的能力有限，受到环境的影响，但仍可以达到较高的检测精度。
由于西方印迹法可分离复杂混合物中不
同的蛋白质，因此它是生物学实验研究中必不可少的一部分，广泛应用于细胞学、分子生
物学和分子遗传学等领域。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
western-blot的原理及应用
Western Blot的原理及应用1. Western Blot的简介Western Blot，又称蛋白印迹法，是一种常用的蛋白质检测技术。
通过将待检的蛋白质样品分离、转移至膜上、以特定抗体探针探测目标蛋白质，然后用染色剂标记抗体来可视化目标蛋白。
2. Western Blot的原理Western Blot技术主要分为以下几个步骤：2.1 电泳分离将待检样品通过聚丙烯酰胺凝胶电泳进行分离，根据蛋白质大小和电荷来确定聚丙烯酰胺凝胶电泳的类型（SDS-PAGE、Native-PAGE等）。
2.2 转移将电泳分离出的蛋白质从凝胶转移到膜上，常用的转移方式包括湿式转移、半湿式转移和干式转移。
2.3 阻断使用适当的缓冲液对膜进行阻断，如牛奶、BSA等，用于防止非特异性结合。
2.4 探测抗体加入特异性一抗，与目标蛋白质结合。
一抗可以是多克隆抗体或单克隆抗体，可以选择根据实验需求选择。
2.5 二抗探针加入与一抗来源不同动物的二抗探针，例如兔子抗鼠二抗或羊抗兔子二抗等，二抗探针会与一抗结合。
2.6 可视化通过染色剂等方法来可视化目标蛋白质，常用的方法有辣根过氧化物酶（HRP）标记的次级抗体与发光底物反应产生发光，或使用染色剂如染蓝等。
3. Western Blot的应用Western Blot技术在生命科学领域有着广泛的应用，包括：3.1 蛋白质鉴定与定量Western Blot技术可以快速鉴定蛋白质的存在与纯度，通过与已知标准蛋白质比较可以进行定量分析。
3.2 抗体检测和验证通过Western Blot可以检测抗体的特异性和亲和力，验证抗体的质量和功能。
3.3 蛋白质翻译后修饰的研究Western Blot可以用于检测蛋白质的磷酸化、甲基化、酰化等翻译后修饰，帮助我们了解蛋白质功能的调控机制。
3.4 疾病诊断和治疗研究Western Blot在临床疾病的诊断和治疗研究中起着重要作用，如肿瘤标志物的检测、药物疗效的评估等。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
western blot 原理
western blot 原理Western blot 原理。
Western blot（蛋白免疫印迹）是一种常用的蛋白质分析技术，它通过检测蛋白质的存在、大小和相对丰度，帮助科研人员了解特定蛋白质在生物样本中的表达情况。
本文将介绍Western blot的原理及其在科研领域中的应用。
首先，我们来了解Western blot的原理。
Western blot的步骤主要包括蛋白质提取、SDS-PAGE电泳分离、蛋白转印、免疫检测和成像分析。
在蛋白质提取阶段，样本组织或细胞经过裂解后，蛋白质被提取出来。
接下来，蛋白质经过SDS-PAGE电泳分离，根据其大小被分离成不同的条带。
然后，将分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺膜上，这一步骤称为蛋白转印。
转印完成后，膜上的蛋白质被用特定抗体进行免疫检测，最后通过成像系统获取蛋白质的信号。
Western blot的原理基于蛋白质的特异性免疫反应。
在免疫检测阶段，蛋白质与特定抗体结合，形成抗原-抗体复合物。
然后，通过化学发光或者染色等方法，检测抗原-抗体复合物的信号。
这种信号可以定量分析蛋白质的表达水平，并且可以检测到非常低浓度的蛋白质。
在科研领域中，Western blot被广泛应用于蛋白质的定性和定量分析。
科研人员可以利用Western blot来检测特定蛋白质的表达情况，比如研究蛋白质在不同组织或细胞中的表达差异，或者研究蛋白质在生理或病理状态下的变化。
此外，Western blot还可以用于检测蛋白质的修饰状态，比如磷酸化、甲基化等。
通过Western blot的定量分析，科研人员可以获取蛋白质的相对丰度信息，从而更好地理解蛋白质在生物学过程中的功能和调控机制。
除了在科研领域中的应用，Western blot还被广泛用于临床诊断。
临床医生可以利用Western blot来检测患者血清中特定蛋白质的表达情况，从而辅助诊断某些疾病，比如肿瘤、自身免疫性疾病等。
此外，由于Western blot对蛋白质的特异性检测能力，它还被用于药物研发和药物靶点筛选。
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4
一般流程
蛋白质样品的制备
SDS聚丙烯酰胺凝胶 电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
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5
蛋白质样品的制备
从-20℃冰箱取出细胞液，室温溶解后， 3000rpm离心5min，吸去上清液，保留细 胞沉淀。每管加入一定量的上样缓冲液裂 解细胞，用手指轻弹以充分裂解细胞。充 分裂解后，煮沸10min，使蛋白变性， 12000rpm离心5min，取上清，测蛋白含量， 用的是TCA蛋白测定法测蛋白含量。
Western blot又成蛋白质印迹法，对单 项电泳后蛋白质分子的印迹分析称 western印迹法，它是分子生物学、生 物化学和免疫遗传学中常用的一种实 验方法,且能对蛋白进行定性和半定量
的分析方法。
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3
基本原理
Western blot是通过特异性抗体对 凝胶电泳处理过的细胞或生物组织 样品进行着色。通过分析着色的位 置和着色的深度获得特定的蛋白质 在所分析的细胞或组织中的表达情 况的信息。
Western blot 实验技术
2012.12.12
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1
Western blot的定义
Western blot的基本原理
Western blot的一般流程
Western blot的常见问题
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2
定义
印迹法（blotting）是指将样品转移到 固相载体上，而后利用相应的探测反
应来检测样品的一种方法。
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11
电泳步骤：
1.清洗玻璃板
2.灌胶与上样
（1）玻璃板对齐后放在夹中卡紧，然后垂 直卡在架子上准备灌胶
（2）配置10%的分离胶，加入TEMED后立 即摇匀即可灌胶。灌胶至玻璃板高度的2／ 3处即可，然后胶上加一层水，液封后的胶 凝的更快（30min）。
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12
（3）当水与胶之间有一条明显的折射线时， 说明胶已凝了。等三分钟胶完全凝固后倒 去上层水，并用吸水纸将水吸干。
5.将膜晾干备用。
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封闭
用5%的脱脂奶粉封闭液 （2.5g脱脂奶粉， 50mlPBST缓冲液）封闭， 在摇床上封闭一小时。
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一抗杂交
一抗稀释液：一抗，10ml PBST，0.1g脱脂 奶粉，30ul叠氮钠。用PBST稀释一抗至适当 浓度（一抗使用前要3000r／min离心3min）。
（4）按方法配置5%的浓缩胶，加入TEMED 后积极摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓 缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中，待浓缩 胶凝过后，两手分别捏住梳子的两端竖直 向上轻轻将其拔出（一般20分钟时最好 拔）。
(5将装置放入电泳槽中，加入足量的电泳液 后开始准备上样（电泳液至少漫过小玻璃 板内侧）
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蛋白质-SDS复合物的形状近似于长的椭圆棒， 它们的短轴是恒定的，而长轴与蛋白质分子量的 大小成比例。
因此，蛋白质-SDS复合物在SDS-聚丙烯酰胺凝胶 电泳系统中的迁移率不再受蛋白质原有电荷的影 响，而主要取决于椭圆棒的长轴长度，即蛋白质 亚基分子量的大小。
当蛋白质分子量在15KD到200KD之间时，电泳迁移 率与分子量的对数呈线性关系。
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9Байду номын сангаас
SDS-PAGE电泳
基本原理： 在聚丙烯酰胺凝胶系统中引进SDS（十二烷基磺酸 钠）， SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质 的二级和三级结构，同时，在强还原剂（beta-巯基 乙醇）作用下，使半胱氨酸之间的二硫键断裂。
蛋白质在一定浓度的含有强还原剂的SDS溶液中，与 SDS分子按比例结合(多肽和SDS的质量比为1:1.4)， 形成带负电荷的SDS-蛋白质复合物，所带的负电荷大 大超过了蛋白质分子原有的电荷量，从而消除了不同 分子之间原有的电荷差异 。
1.转一张膜需要准备长8.0cm，宽5.5cm的六 张滤纸和一张硝酸纤维素膜。（切滤纸和 膜时要戴上手套，以免手上的蛋白会污染 膜）将切好的滤纸和膜至于转移缓冲液中 浸两小时才可使用。（使膜浮于转移缓冲 液上，只有下层才与水接触，这样由于毛 细血管作用才能把整个膜浸湿。）
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2.将玻璃板撬开，去掉小玻璃板。将浓缩胶轻轻 刮去，小心的剥下分离胶先放于转移缓冲液中。 （在撬玻璃板时要小心，因玻板易碎。剥离分 离胶时要注意不要弄破分离胶）
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6
（1）25mg/mL BSA的配制:
取0.8mL蛋白标准配制液加入到一管蛋白
标
准(20mg BSA)中，充分溶解后配制
25mg/mL的蛋白标准溶液。配制后可立即使用，
也以-20℃长期保存。
（2）1mg/mL BSA的配制:
取BSA贮备液25mg/mL（0.1mL），用 1×loading buffer（2.4mL）稀释至2.5mL， 按0.5mL分装成5个包装，标记放入-20℃。
3.放置顺序：阴极-海绵垫-三层滤纸-分离胶-膜三层滤纸-海绵垫-阳极。（顺序不能反了，膜 盖上后不可移动，每盖一层，要用玻棒擀出其 中的气泡。第二、三步时戴手套，因转移缓冲 液中含甲醇，实验室要开门空气流通。）
4.把夹子放入转移槽中，黑面对对槽的黑面，白 面对槽的红面，转移时会产热用冰块降温。一 般150V，400mA转膜1：30h。
13
（6）根据测出的蛋白含量，计算出含一定质量 蛋白的溶液体积即为上样量。上样前要将蛋白 于沸水中煮沸10min使蛋白变性，并12000r／ min离心5min。
3.电泳
在浓缩胶中电压可为80V，至溴酚蓝进入分离 胶后将电压转换为90V,电泳至溴酚蓝离下边缘 1cm处时停止电泳。
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转膜
将一抗稀释液倒入保鲜膜袋内，从封闭液中 取出膜用滤纸吸干残留液体，将膜放入一抗 稀释液中，膜蛋白面与抗体液面接触。室温 下脱色摇床20min,4℃过夜。次日用PBST缓 冲液室温脱色摇床上洗三次，每次10min。
（3）60% TCA工作液的配制:
取2.2g TCA（三氯醋酸）溶于3.67mL双蒸水 中，即为60% TCA工作液，使用前配制。
（4）配制BSA标准系列和样品 如表格：
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蛋白样品 5μl，1×loading buffer 45μl， ddH2O 50μl，TCA 66.7μl，放置15-30min， 用酶标仪，λ=595nm处测定蛋白含量。