蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
免疫印迹实验注意事项
免疫印迹实验注意事项一、实验概述免疫印迹(Western blot)是一种重要的蛋白质检测技术,在生物医学研究中被广泛应用。
该实验通过将蛋白质样品经电泳分离,并将其转移到膜上,最终使用特异性抗体探测目标蛋白质。
然而,为了确保实验结果的准确性和可靠性,实验过程中需要注意以下事项。
二、实验仪器和试剂准备在进行免疫印迹实验之前,需要准备合适的仪器和试剂。
以下是一些注意事项:1. 仪器准备•确保电泳仪、转印仪和成像仪等仪器的功能正常,并进行必要的校准和测试。
•清洁仪器,避免污染和干扰实验结果。
2. 试剂准备•使用优质的试剂,并根据说明书正确配制试剂溶液。
•为避免批次差异,建议每次实验使用同一批试剂。
•试剂保存在适当的温度和条件下,以保证其稳定性。
3. 溶液准备•使用无菌、纯净的水和试剂配制实验所需的溶液。
•确保溶液的 pH 值正确,并进行必要的调整。
•溶液保存在适当的温度和条件下,避免污染和变质。
三、实验操作注意事项在进行免疫印迹实验时,需要注意以下操作事项:1. 样品处理•样品的制备和处理应严格按照实验要求进行,以确保样品的完整性和稳定性。
•样品处理过程中应尽量避免使用可能影响蛋白质结构和功能的试剂和条件。
2. 蛋白质的电泳分离•样品电泳前,必须对电泳胶进行适当的处理和准备,确保其质量和性能。
•样品电泳条件的选择要考虑样品性质和目标蛋白质的分子量等因素。
•电泳过程中,要严格控制电流和电压,避免产生异常结果。
3. 转膜过程•使用合适的滤纸和膜材料,并按照正确的方法和条件进行转膜操作。
•转膜时间和电压的选择要根据蛋白质的分子量和转膜效率进行调整。
4. 抗体探测和成像•使用具有较高亲和力和特异性的抗体进行探测,以提高结果的准确性和可靠性。
•抗体的浓度和反应时间应根据需要进行调整,避免产生过度或不足的信号。
•成像过程中,要确保暗室环境的光线充足、胶片或成像仪的参数设置正确。
5. 数据分析和结果解读•在进行数据分析和结果解读时,应使用合适的软件和方法,确保结果的准确性和可靠性。
蛋白印迹——western-blot-实验流程及注意事项
蛋白印迹——Western blot实验流程及注意事项各种凝胶电泳方法可以直接了解蛋白的某些性质如迁移率、电荷、大小、丰度以至蛋白的亲疏水性等。
此外,特异染色方法可用于识别不同种类的蛋白质。
Western blot技术大大扩展了凝胶电泳后识别和鉴定蛋白的可能性。
这一技术首先将电泳分离后的蛋白质条带或斑点从凝胶介质转移到固相支持膜上,然后用特异性配体进行检测。
特异性抗体和凝集素等已被广泛应用检测印迹膜上的蛋白。
印迹技术还常常作为电泳分离后用化学方法(如蛋白氨基端序列分析等)鉴定蛋白的一个重要步骤。
一、聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE或SDS-PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳简称为PAGE(Polyacrylamide gel electrophoresis),是以聚丙烯酰胺凝胶作为支持介质的一种常用电泳技术。
聚丙烯酰胺凝胶由单体丙烯酰胺和甲叉双丙烯酰胺聚合而成,聚合过程由自由基催化完成。
催化聚合的常用方法有两种:化学聚合法和光聚合法。
化学聚合以过硫酸铵(AP)为催化剂,以四甲基乙二胺(TEMED)为加速剂。
在聚合过程中,TEMED催化过硫酸铵产生自由基,后者引发丙烯酰胺单体聚合,同时甲叉双丙烯酰胺与丙烯酰胺链间产生甲叉键交联,从而形成三维网状结构。
PAGE根据其有无浓缩效应,分为连续系统和不连续系统两大类,连续系统电泳体系中缓冲液pH值及凝胶浓度相同,带电颗粒在电场作用下,主要靠电荷和分子筛效应。
不连续系统中由于缓冲液离子成分,pH,凝胶浓度及电位梯度的不连续性,带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应,分子筛效应,还具有浓缩效应,因而其分离条带清晰度及分辨率均较前者佳。
不连续体系由电极缓冲液、浓缩胶及分离胶所组成。
浓缩胶是由AP催化聚合而成的大孔胶,凝胶缓冲液为pH6.7的Tris-HCL。
分离胶是由AP催化聚合而成的小孔胶,凝胶缓冲液为pH8.9 Tris-HCL。
Western-Blot基本原理、过程及注意事项
Western Blot基本原理、过程及注意事项原理是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测.主要有三个过程:蛋白质电泳、转膜、检测.样品的准备样品种类主要有培养的细胞、组织(需磨碎)、特殊细胞(切割下来的肿瘤细胞)等。
1、裂解液主要有RIPA和三去污两种,RIPA适用于细胞质中蛋白检测,而三去污适用于总蛋白。
三去污又分为离子型和非离子型。
离子型的裂解能力较强如SDS等,非离子型的包括NP—40、Tritonx-100.2、裂解液的成分,3、样品缓冲液sample buffer备注:1、样品应保持低温,且实验过程应低温操作,此举为了抑制酶的活性。
裂解完后样品液会显得粘稠是长结构DNA所致,故需要匀浆,打断DNA。
一般不用超声,因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1:1混匀.4度保存。
3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中,以充分变性蛋白。
配胶:胶的主要成分为丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺,应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N'—亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N—亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H2O至100ml。
)储于棕色瓶,4℃避光保存。
4、分离胶的配方:以20ml的8﹪分离胶为例:5、浓缩胶配方:6ml为例备注:1、制胶是避免产生气泡,空气会影响胶的聚合,在蛋白质表观分子量分析时影响大.2、因为有SDS,每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净,与制胶板压紧,避免漏胶。
5、制胶时,加水应缓慢不要破坏胶面,其作用:可以平衡胶面,赶气泡等。
胶固定后用滤纸吸除干净,有水跑胶时条带会歪。
6、先插梳子再灌浓缩胶。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹(Western Blotting,简称WB)是一种常用的分子生物学技术,主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取:首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集,并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱,使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定:根据实验需要,采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度,以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳:将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中,进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移,分子量小的蛋白质迁移速度较快,分子量大的较慢。
电泳结束后,将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色:在转移至膜上后,可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法,以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断:在膜上的蛋白质检测之前,需要对膜进行阻断处理,以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液,进行阻断。
6.一抗反应:加入已稀释好的一抗抗体,与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗:一抗反应后,用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗,以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应:9.清洗:二抗反应后,用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗,以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像:使用显色剂(如ECL)使膜上的蛋白质发生化学发光反应,然后将膜放入X射线片中,进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析:使用专业的成像软件分析成像结果,计算蛋白质的相对表达水平,并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是,在进行WB实验的过程中,要严格操作,避免污染和交叉反应的出现。
同时,应根据实验需求选择适当的试剂和抗体,并进行标记、保存和储存等操作。
westernblot法
Western blot,也称为蛋白质印迹或免疫印迹,是一种常用的生物化学技术,用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项:一、实验步骤蛋白样品制备:从细胞或组织中提取蛋白质样品,常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量:使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量,以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳:将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离,根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜:将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上,以便进行后续的免疫检测。
免疫检测:使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测,抗体与目标蛋白质结合后,通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析:对免疫检测结果进行定量和定性分析,如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程,确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆,以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前,要对蛋白质样品进行定量,以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中,要选择合适的转移缓冲液和转移时间,以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中,要选择合适的抗体和显色试剂,以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中,要选择合适的分析方法和软件,以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之,Western blot是一种常用的生物化学技术,在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时,要严格遵守实验步骤和注意事项,以保证实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白(根据蛋白分子的大小,煮沸时间可适当变化,一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白,而不是分解,一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的,只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合,SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的,100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳)。
(3)电泳i.清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。
)(2)配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时,可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法原理
蛋白质免疫印迹法(Western Blot)是一种常用于检测蛋白质的方法。
其原理基于蛋白质电泳分离和特定抗体与目标蛋白质的特异性结合。
1. 样品制备:首先,待检样品经过蛋白质提取,然后经过电泳分离,通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)将样品中的蛋白质根据其分子量大小分离。
2. 蛋白转膜:随后,将分离得到的蛋白质通过电泳转印到聚合物(如聚偏氟乙烯)膜上,形成蛋白质膜。
3. 阻断:将膜置于含有蛋白质阻断剂(如牛血清白蛋白)的缓冲液中,阻止非特异性结合。
4. 抗体结合:将膜与特异性抗体一起孵育,抗体与目标蛋白质特异性结合。
这些抗体通常是经过免疫动物制备,针对目标蛋白质的特定抗原位点。
5. 靶蛋白检测:使用荧光标记或酶标记的二抗(即与第一抗体结合的抗体)与第一抗体结合。
这些二抗能够使特定结合的蛋白质与检测标记发生反应。
6. 信号检测:使用荧光标记物或底物,通过荧光检测或发色反应检测结合的蛋白质。
常用方法是使用化学发光底物,比如辣根过氧化物酶和酮硫磺胺基碳酸红等底物。
通过这个原理,蛋白质免疫印迹法可以提供关于特定蛋白质的存在、相对丰度以及蛋白质分子量等信息。
它在分子生物学和生物医学研究中被广泛应用于蛋白质分析和诊断。
WesternBlot基本原理过程及注意事项
W e s t e r n B l o t基本原理过程及注意事项The latest revision on November 22, 2020W e s t e r n B l o t基本原理、过程及注意事项原理是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测。
对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
主要有三个过程:蛋白质电泳、转膜、检测。
样品的准备样品种类主要有培养的细胞、组织(需磨碎)、特殊细胞(切割下来的肿瘤细胞)等。
1、裂解液主要有RIPA和三去污两种,RIPA适用于细胞质中蛋白检测,而三去污适用于总蛋白。
三去污又分为离子型和非离子型。
离子型的裂解能力较强如SDS等,非离子型的包括NP-40、Tritonx-100。
2、裂解液的成分,3、样品缓冲液samplebuffer备注:1、样品应保持低温,且实验过程应低温操作,此举为了抑制酶的活性。
裂解完后样品液会显得粘稠是长结构DNA所致,故需要匀浆,打断DNA。
一般不用超声,因为容易引起蛋白不可逆的变性。
2、用2X样品缓冲液与样品1:1混匀。
4度保存。
3、样品混合液加样前需要100℃或沸水浴加热3-5分钟并迅速插入冰中,以充分变性蛋白。
配胶:胶的主要成分为丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺,应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N,N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g,N,N-亚甲叉双丙稀酰胺1g,加H2O至100ml。
)储于棕色瓶,4℃避光保存。
4、分离胶的配方:以20ml的8﹪分离胶为例:5、浓缩胶配方:6ml为例备注:1、制胶是避免产生气泡,空气会影响胶的聚合,在蛋白质表观分子量分析时影响大。
2、因为有SDS,每次混匀时不应剧烈以免产生过多气泡。
3、蛋白容易与SDS脱离而失去负电荷,因此胶中加入SDS为了给蛋白持续的负电荷。
4、垫条清洗干净,与制胶板压紧,避免漏胶。
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项
western blot检测蛋白质的表达实验的结论和注意事项Western blot(免疫印迹)是一种常用的实验技术,用于检测蛋白质的表达水平和鉴定特定的蛋白质。
下面将分别介绍Western blot的实验结论和注意事项。
实验结论:通过Western blot实验可以得出以下结论:1. 确定蛋白质的表达水平:Western blot可以定量检测特定蛋白质在样本中的表达水平,比如癌细胞中的肿瘤抑制因子的表达水平是否下调,通过和对照组的比较可以得出结论。
2. 确定蛋白质的鉴定:Western blot可以用于鉴定特定蛋白质的存在与否,通过与已知目标蛋白的分子量进行比较,可以确定其身份。
3. 确定蛋白质的修饰状态:一些蛋白质在翻译后会发生修饰,如磷酸化、糖基化等,这些修饰状态可能会影响蛋白质的功能。
通过Western blot可以检测修饰状态,并进一步探究其功能。
注意事项:在进行Western blot实验时,有一些注意事项需要遵守,以保证实验的准确性和可靠性:1. 样品制备:样品的制备至关重要,要确保样品蛋白质的完整性和稳定性。
使用磷酸化酶抑制剂、蛋白酶抑制剂等,避免蛋白质在制备过程中被降解。
2. 蛋白质的分离:Western blot一般需要将蛋白质进行SDS-PAGE电泳,要注意合理选择电泳条件和胶液浓度,以达到最佳的蛋白质分离效果。
同时还需要确保样品装载均匀,可与内参蛋白进行标准化。
3. 转膜条件:Western blot的关键步骤是将分离的蛋白质迁移到聚丙烯酰胺薄膜。
转膜条件包括电流、时间和转膜缓冲液的配方,需要根据蛋白质的大小和性质进行优化,以确保迁移的效率和完整性。
4. 主抗体选择:选择适当的主抗体对目标蛋白进行检测,主抗体的产地、克隆型和浓度都会影响实验结果。
需要进行充分的文献调研和优化,以保证实验的准确性和特异性。
5. 二级抗体选择:Western blot实验中一般需要使用带有酶标记物(如HRP)的二级抗体来检测主抗体与蛋白质结合情况。
蛋白质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验方法原理步骤及注意事项
蛋⽩质免疫印迹(WesternBlot,WB)实验⽅法原理步骤及注意事项实验⽅法原理Western免疫印迹(Western Blot)是将蛋⽩质转移到膜上,然后利⽤抗体进⾏检测的⽅法。
对已知表达蛋⽩,可⽤相应抗体作为⼀抗进⾏检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交⽅法类似,但Western Blot采⽤的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋⽩质,“探针”是抗体,“显⾊”⽤标记的⼆抗。
经过PAGE分离的蛋⽩质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以⾮共价键形式吸附蛋⽩质,且能保持电泳分离的多肽类型及其⽣物学活性不变。
以固相载体上的蛋⽩质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第⼆抗体起反应,经过底物显⾊或放射⾃显影以检测电泳分离的特异性⽬的基因表达的蛋⽩成分。
该技术也⼴泛应⽤于检测蛋⽩⽔平的表达。
实验材料蛋⽩质样品试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HClβ-巯基⼄醇ddH2O⽢氨酸Tris甲醇PBSNaClKClNa2HPO4KH2PO4ddH2O考马斯亮兰⼄酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2DAB试剂盒仪器、耗材电泳仪电泳槽离⼼机离⼼管硝酸纤维素膜匀浆器剪⼑移液枪刮棒实验步骤⼀、试剂准备1. SDS-PAGE试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β-巯基⼄醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液:⽢氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇200 ml;加ddH2O定容⾄1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO4 1.44 g;KH2PO4 0.24 g;加ddH2O⾄1000 ml。
5. 膜染⾊液:考马斯亮兰 0.2 g;甲醇80 ml;⼄酸2 ml;ddH2O118 ml。
western blot技术的原理方法注意事项
western blot技术的原理方法注意事项一、原理Westernblot是一种常用的蛋白质检测技术,其基本原理是蛋白质的印迹技术,即把蛋白质从复杂的样品中分离出来,并转移到固相支持物上,再与特异性抗体结合,通过显色或电子显微镜观察鉴定蛋白质的表达和分布情况。
二、方法1.样品处理:首先,需要将蛋白质样品进行提取、分离和纯化。
根据样品性质,可以采用不同的提取方法,如细胞裂解液、组织匀浆液等。
2.凝胶电泳:将分离纯化的蛋白质样品转移到分离胶中,通过电泳将不同分子量的蛋白质分离。
3.免疫反应:将膜上的蛋白质与特异性抗体结合,形成抗原-抗体复合物。
4.显色反应:通过化学反应,使抗原-抗体复合物显色,便于观察和拍照。
5.电子显微镜观察:对于较小的样品,可以采用电子显微镜对蛋白质进行观察和定量分析。
三、注意事项1.样品处理:提取的蛋白质样品应尽可能保持完整性和纯度,避免在提取、分离和转移过程中发生变性或降解。
2.凝胶电泳:分离胶的选择应根据待测蛋白质的分子量大小进行,以确保蛋白质能够完全分离。
同时,应注意电泳过程中的电压、电流和时间等参数,避免过度电泳导致蛋白质失活或降解。
3.免疫反应:应注意抗体滴度的选择,确保抗体能够充分识别目标蛋白质。
同时,应避免使用过期或质量不佳的抗体。
4.显色反应:应注意显色试剂盒的质量和操作步骤,确保显色反应充分且颜色易于观察。
同时,应注意显色颜色的稳定性,避免因颜色不稳定影响结果判断。
5.电子显微镜观察:应注意电子显微镜的操作步骤和设备维护,确保电子显微镜能够正确成像。
同时,应注意样品的制备和处理,确保样品能够被电子显微镜准确观察。
6.实验条件:实验过程中应注意调整实验条件,如孵育时间、洗膜次数、抗体稀释度等,以确保实验结果的准确性和可靠性。
7.重复性:在进行Westernblot实验时,应注意重复性实验的开展,以减少实验误差和提高实验结果的可靠性。
总之,Westernblot技术虽然复杂,但只要掌握了其原理和方法,并注意以上注意事项,就能够获得准确可靠的结果。
western blotting实验操作步骤讲解
蛋白免疫印迹杂交(Western Blot, WB)WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离,再转移到杂交膜上,然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。
以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析,有助于成功完成WB。
A第一部分:蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步,更是决定WB成败的关键步骤,总体原则和注意事项:1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白(通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品);2.保持蛋白处于溶解状态(通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择);3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等,(低温操作,加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂);4.尽量去除核酸,多糖,脂类等干扰分子(通过加入核酸酶或采取不同提取策略);5.样品分装,长期于-80℃中保存,避免反复冻融。
方法的选择◆自行配制抽提试剂,根据文献方法或经验提取;◆购买商品化试剂盒,按其说明书的方法提取。
Example 1:实验中提取肾脏总蛋白,具体实验过程如下:1.提前一天4℃解冻RIPA,一定要完全融化;配PBS(用于细胞试验则需高压);2.配制裂解液:PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM(根据样本数配制所需的量,临用临配);3.裂解组织:每个样品称取100mg,加1ml裂解液,匀浆后4℃静置2h使其充分裂解,14000g,4℃离心10min,取上清。
4.蛋白定量:取少量上清稀释30倍蛋白定量,然后计算出各样本原液蛋白浓度。
注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂,蛋白定量不能选用Bradford法,可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。
5.样品蛋白浓度均一化:根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。
具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致,本次蛋白浓度为3mg/ml。
生化实验九 Western_blot的原理、操作
实验九 Western blot的原理、操作及注意事项原理:通过电泳区分不同的组分,并转移至固相支持物,通过特异性试剂(抗体)作为探针,对靶物质进行检测,蛋白质的Western印迹技术结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等多种特点,可检测到低至1~5ng(最低可到10-100pg)中等大小的靶蛋白。
一、抗原的选择和制备A:样品的制备1 组织:组织的处理方法:组织洗涤后加入3倍体积预冷的PBS,0℃研磨,加入5×STOP buffer,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm,5mins 离心,取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml),溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml)煮沸10min,分装后于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样。
2 细胞:细胞的处理方法:离心收集细胞或者直接往细胞培养瓶内加入5×STOP buffer,收集,180W,6mins,0℃超声波破碎,5000rpm,5mins 离心,取上清。
加入β-ME(9.5ml加入0.5ml),溴酚蓝(9.5ml加入0.5ml)煮沸10min,分装后于-20℃保存,用时取出,直接溶解上样。
3 分泌蛋白的提取(特例):直接收集分泌液,加入β-ME、溴酚蓝制样。
二、SDS-聚丙烯酸胺凝胶电泳(SDS-PAGE)A:实际操作1.做胶前的准备1)检查是否有足够的、干净的 spacer、comb 和架子。
2)检查是否有新鲜的,足量10%APS,没有立刻重配。
3)按将要检测的抗体对应的原始抗原的分子量大小,计算出胶的浓度,并算出分离胶各组分的用量。
2.制胶,电泳1)装好架子。
2)按照下面配方配制分离胶。
(单位:ml,Total: 8ml)在胶上面加入一层蒸馏水,促进胶更好的凝集。
3)4)待胶凝集好后,上样,电泳。
上层胶用60-80V电压,当样品至分离胶时,用100-120V 电压。
一般电泳时间在1.5小时左右。
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项
维真生物-WesternBlot实验方法及注意事项WesternBlot实验方法及注意事项实验原理:WesternBlot印迹方法,又称为免疫印记,是将获得的蛋白质样品通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,对不同分子量的蛋白质进行分离,并通过转移电泳将凝胶上分离到的蛋白质转印至固相支持物(NC膜或PVDF膜)上,用抗靶蛋白的非标记抗体(一抗)与转印后膜上的靶蛋白进行特异性结合,再与经辣根过氧化物酶标记(偶联)的二抗结合,最后用ECL超敏发光液试剂检测。
如果转印膜上含有靶蛋白,经X光片曝光、显影后,则会在X-光片上出现特异性蛋白条带。
实验材料:分离胶及积层胶溶液、水饱和异丁醇、1×Tris?Cl/SDS,pH8.8 、蛋白质分子量标准混合物、1×SDS电泳缓冲液、电泳装置及夹子、玻璃板、灌胶支架、缓冲液槽等附件、0.75mm封边垫片、0.75mm样品梳子、50μl微量加样器、恒流电源常用试剂:1)30%丙烯酰胺/0.8% N,N’-亚甲丙烯酰胺将30克丙烯酰胺和0.8克N,N’-亚甲丙烯酰胺溶于总体积为60ml 水中,加热至37℃溶解之,补加水至终体积为100ml。
0.45μm 微孔滤膜过滤除菌,查证该溶液pH应不大于7.0,置棕色瓶中保存。
小心:丙烯酰胺具有很强的神经毒性并可通过皮肤吸收,其作用具有累积性。
称量丙烯酰胺和N,N’-亚甲丙烯酰胺时应戴手套和面具。
可认为聚丙烯酰胺无毒,但也应谨慎操作,因为它还可能含有少量未聚合材料。
2)4×Tris?Cl/SDS,pH8.8,在300mlH2O中溶解91g Tris碱(1.5mol/L),用1mol/L调节pH 至8.8,补加H2O至体积500ml。
用0.45μm滤膜过滤溶液,再加入2g SDS[0.4%(w/v)],于4℃可保存1月。
3)4×Tris?Cl/SDS,pH6.8,在40mlH2O中溶解6.05g Tris碱(0.5mol/L),用1mol/L调节pH 至6.8,补加H2O至体积100ml。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
一、实验原理。
WB实验,即Western Blot实验,是一种常用于检测蛋白质的实验方法。
它通过电泳将蛋白质分离开来,然后用特定的抗体结合目标蛋白,最后通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
在WB实验中,主要包括蛋白质电泳分离、转膜、抗体结合和检测等步骤。
下面将详细介绍WB实验的步骤及操作要点。
二、实验步骤。
1. 蛋白质电泳分离。
首先,将待测样品加入SDS-PAGE凝胶槽中,进行蛋白质电泳分离。
电泳结束后,将蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上。
2. 蛋白质转膜。
将电泳分离后的蛋白质转移到聚丙烯酰胺凝胶膜上,通常采用湿法转膜或半干法转膜。
转膜后,将膜进行封闭处理,以防止非特异性结合。
3. 抗体结合。
将待测蛋白质与特异性一抗进行孵育结合,然后进行洗脱,接着与辣根过氧化物酶标记的二抗结合。
最后再次进行洗脱,以去除非特异性结合。
4. 检测。
通过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在与表达水平。
化学发光法是常用的检测方法之一,它通过特定底物的化学反应产生发光信号,用于检测目标蛋白的存在与表达水平。
三、实验操作要点。
1. 实验前的准备工作要做到充分,包括准备好所需试剂、仪器设备的检查和调试等。
2. 在操作过程中要严格遵守操作规程,保证实验的准确性和可靠性。
3. 注意实验中各步骤的时间控制,避免步骤之间的等待时间过长或过短。
4. 蛋白质转膜时要注意膜的完整性和均匀性,避免出现膜上蛋白质分布不均匀的情况。
5. 在抗体结合和检测过程中,要注意洗脱的次数和时间,严格控制非特异性结合的发生。
6. 实验结束后,要及时清洗和维护仪器设备,妥善保存实验结果和数据。
通过以上步骤和操作要点的介绍,相信大家对WB实验的原理和操作有了更清晰的认识。
在进行实验操作时,一定要认真细致,严格按照操作规程进行,确保实验结果的准确性和可靠性。
希望本文对大家有所帮助,谢谢阅读!。
蛋白印迹实验方法的原理和步骤
蛋白印迹实验,又被称为Western blot,是一种用于检测特定蛋白质的方法。
通过这种实验方法,研究人员可以确定样品中是否含有特定蛋白质,以及其相对浓度。
这一方法在生物医学研究中被广泛应用,对于研究蛋白质结构、功能和相互作用具有重要意义。
本文将介绍蛋白印迹实验的原理和步骤,希望能够帮助读者对这一实验方法有更深入的了解。
一、蛋白印迹实验的原理蛋白印迹实验的原理基于蛋白质的分子量及电荷特性。
当蛋白质被电泳分离后,可以通过膜转移和特异性抗体结合的方式来检测目标蛋白。
其基本步骤包括蛋白电泳分离、膜转移、抗体结合和信号检测。
1. 蛋白电泳分离蛋白印迹实验首先需要对样品中的蛋白进行电泳分离。
这一步骤通过SDS-PAGE或其他电泳方法进行,将蛋白质按照分子量大小进行分离。
分离过程中,蛋白质会在凝胶中形成不同的泳动带,便于后续的检测和分析。
2. 膜转移分离完毕后,需要将凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这一步骤通常通过湿式膜转移或半干式膜转移进行,目的是将蛋白质牢固地转移到膜上,并保持其原有的位置关系和相对分子量大小。
3. 抗体结合蛋白转移至膜上后,需要与特异性抗体结合。
这些抗体通常是针对特定蛋白的,并且标记有辅酶或发光物质,便于检测和定量分析。
抗体结合过程需要严格控制条件,确保特异性和灵敏度。
4. 信号检测最后一步是通过染色、荧光或化学发光的方式来检测抗体和蛋白的结合情况。
根据信号的强度和位置,可以确定目标蛋白的存在与否以及其相对浓度。
以上就是蛋白印迹实验的基本原理,下面将介绍蛋白印迹实验的具体步骤。
二、蛋白印迹实验的步骤1. 样品处理首先需要将研究样品进行处理,常见的处理方法包括蛋白溶解、沉淀和浓缩。
处理完毕后,样品中的蛋白质将变得易于电泳分离和检测。
2. 蛋白电泳将处理好的样品加载到SDS-PAGE凝胶上,进行蛋白电泳分离。
这一过程需要严格控制电场强度和时间,以确保蛋白质能够按照分子量大小进行有效分离。
3. 膜转移电泳分离完毕后,需要将凝胶上的蛋白转移到膜上。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动,待所检测的蛋白带显色达到最深程度后,将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜,自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致?若不是这样结果会怎样?
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡, 否则结果会怎样?
• 在进色后应时应注意哪些问题? • 请简述免疫印迹实验的原理,并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极,二 者结合在一起,然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合,形成“三明治 ”结构,放入电转移仪器上,加入电泳 缓冲液,通上电源后,蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式: • Ve=Vo+KV1 • Ve:某一溶质的洗脱体积 • Vo:层析柱的外水体积 • Vi:层析柱的内水体积 • K:某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1.试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸,5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
WB实验是一种常用的蛋白质检测方法,它可以用来检测目标蛋白在细胞或组织中的表达水平,是生物学研究中常用的实验技术之一。
本文将介绍WB实验的原理和步骤,希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。
一、实验原理。
WB实验的原理主要基于蛋白质的电泳分离和免疫印迹技术。
首先,将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离,然后将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上,接着用特异性抗体与目标蛋白结合,最后通过化学发光或显色反应来检测目标蛋白的表达水平。
二、实验步骤。
1. 样品制备,将待检测的蛋白样品加入SDS-PAGE样品缓冲液,加热变性,然后进行电泳分离。
2. 凝胶电泳,将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中,连接电源进行电泳分离,直至蛋白样品分离完全。
3. 转膜,将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上,可以选择湿式转膜或半干式转膜的方法,转膜时间和电流密度需要根据蛋白的大小和数量进行调整。
4. 封闭,将转膜后的膜放入封闭液中,封闭蛋白质膜上的非特异性结合位点,减少后续免疫印迹过程中的非特异性结合。
5. 抗体结合,将封闭后的膜与特异性一抗抗体孵育,使抗体与目标蛋白结合。
6. 洗膜,将膜进行多次洗涤,去除未结合的抗体。
7. 二抗结合,将膜与辣根过氧化酶标记的二抗孵育,二抗与一抗结合形成复合物。
8. 洗膜,将膜进行多次洗涤,去除未结合的二抗。
9. 显色或发光,根据实验需要选择化学发光或显色反应,观察目标蛋白的表达水平。
三、实验注意事项。
1. 样品制备时需加入还原剂和变性剂,使蛋白完全变性并且带有负电荷,便于电泳分离。
2. 蛋白转膜时,需保持膜的完整性,避免出现气泡和损坏,影响后续的免疫印迹效果。
3. 免疫印迹过程中的抗体孵育和洗膜步骤需要严格控制时间和条件,以保证特异性结合和减少非特异性结合。
4. 显色或发光反应的时间和条件也需要根据实验情况进行优化,以获得清晰的实验结果。
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取:1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞,然后弃去洗液。
重复上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
(PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度)3)加裂解液于冰上裂解 30 min,为使细胞充分裂解,培养瓶要经常来回摇动(可放置在4℃摇床裂解)。
4)裂解完后,用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧(动作要快),然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
(整个操作尽量在冰上进行)5)在EP管中将细胞震碎(10s/次,3次)6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
(离心机提前预冷至4℃)7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于-20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合,96孔板每孔加入22.5μLdd水,2.5μL蛋白提取液,200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃,90r,孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后,使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度(浓度需要×10)4)将蛋白配成等浓度等体积(使用配置好的裂解液配),按照4:1加入5X loading buffer然后煮5min(100℃),放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm,梳子1.5mm1)清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2)验漏:玻璃板对齐后放入夹中卡紧,然后垂直卡在架子上,加满水验漏3)灌胶:验漏结束后用纸吸干水分,按方法配制下层胶(4mL+4mL+80μLAP),灌胶时,可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水,液封后的胶凝的更快。
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蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后,为确保每个蛋白样品的上样量一致,需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同,需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积,在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟,以充分变性蛋白(根据蛋白分子的大小,煮沸时间可适当变化,一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白,而不是分解,一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的,只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合,SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的,100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳)。
(3)电泳i.清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样(1)玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。
)(2)配10%分离胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时,可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出,待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水,液封后的胶凝的更快。
(灌胶时开始可快一些,胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下,这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢,否则胶会被冲变型。
)(3)当水和胶之间有一条折射线时,说明胶已凝了。
再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
(4)配4%的浓缩胶,加入TEMED(TEMED,中文名为四甲基乙二胺,是一种无色透明的液体,有微腥臭味,可以用于配制SDS-PAGE胶。
TEMED可以催化APS产生自由基,从而加速聚丙烯酰胺凝胶的聚合,可作为一种促凝剂使用)后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小,从而使加样孔的上样体积减小,所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后,两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
(5)用水冲洗一下浓缩胶,将其放入电泳槽中。
(小玻璃板面向内,大玻璃板面向外。
若只跑一块胶,那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向里。
)(6)测完蛋白含量后,计算含50 ng 蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5 ml 离心管中,加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
(上样总体积一般不超过15 μl ,加样孔的最大限度可加20 μl 样品。
)(7) 加足够的电泳液后开始准备上样。
(电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
)用微量进样器贴壁吸取样品,将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
(加样太快可使样品冲出加样孔,若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时,进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次,以免交叉污染。
(8)电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳,进行转膜。
电泳时通常推荐在上层胶时使用低电压恒压电泳,而在溴酚蓝进入下层胶时使用高电压恒压电泳。
对于Bio-Rad 的标准电泳装置或类似电泳装置,低电压可以设置在80-100V,高电压可以设置在120V左右。
为了电泳方便起见,也可以采用整个SDS-PAGE过程恒压的方式,通常把电压设置在100V,然后设定定时时间为90-120分钟。
设置定时可以避免经常发生的电泳过头。
3.转膜(Transfer)推荐在Western实验中选用PVDF膜(FFP36/FFP39)。
硝酸纤维素膜(NC 膜)也可以使用,但硝酸纤维素膜比较脆,在操作过程中特别是用镊子夹取等过程中容易裂开。
通常如果使用Bio-Rad的标准湿式转膜装置,可以设定转膜电流为300-400mA,时间为30-60分钟。
也可以在15-20mA转膜过夜。
具体的转膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短。
在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜。
转膜的效果可以观察所使用的预染蛋白质分子量标准,通常分子量最大的1-2条带较难全部转到膜上。
转膜效果也可以用丽春红染色液(P0022)对膜进行染色,以观察实际的转膜效果。
也可以用考马斯亮蓝快速染色液(P0017)对完成转膜的SDS-PAGE胶进行染色,以观察蛋白的残留情况。
i.转一张膜需准备6张7.0~8.3 cm的滤纸和1张7.3~8.6 cm的硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套,因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。
(用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里,要使膜浮于水上,只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里,膜与水之间形成一层空气膜,这样会阻止膜吸水。
ii.在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
iii.将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫,用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
(一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
)在垫子上垫三层滤纸(可三张纸先叠在一起在垫于垫子上),一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
iv.要先将玻璃板撬掉才可剥胶,撬的时候动作要轻,要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动,直到撬去玻板。
(撬时一定要小心,玻板很易裂。
)除去小玻璃板后,将浓缩胶轻轻刮去(浓缩胶影响操作),要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上,用手调整使其与滤纸对齐,轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上,要盖满整个胶(膜盖下后不可再移动)并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫,擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行,要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触,接触后会发生短路。
(转移液含甲醇,操作时要戴手套,实验室要开门以使空气流通。
)v.将夹子放入转移槽槽中,要使夹的黑面对槽的黑面,夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热,在槽的一边放一块冰来降温。
一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h。
vi.转完后将膜用1×丽春红染液染5 min(于脱色摇床上摇)。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
将膜晾干备用。
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride)是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。
PVDF膜是疏水性的,膜孔径有大有小,随着膜孔径的不断减小,膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。
大于20000的蛋白选用0.45um的膜,小于20000的蛋白选用0.2um的膜。
PVDF膜在使用时需预处理,用甲醇处理的目的是活化膜上的正电基团,使其更容易与带负电的蛋白结合。
PVDF膜具有较高的机械强度,是印迹法中的理想固相支持物材料。
western blotting转膜一般采用“滤纸-凝胶-膜-滤纸”夹心法,凝胶靠近负极,膜靠近正极.因为蛋白上结合有SDS,因而带负电,在电流的作用下会从负极向正极运动,从而转移到膜上。
电场力作用条件下,带电粒子(PAGE胶中的蛋白)会发生定向迁移;蛋白大小如果超过膜孔径(0.22μm or 0.45μm),不会透过膜。
Western Blot技术是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳后,经PAGE分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
一抗就是用来和你要检测的蛋白发生免疫反应的抗体,确定了需要检测样品的种属,就可以选择对应的一抗,而二抗是根据一抗来选择的,比如一抗是小鼠来源的,二抗就要是抗小鼠的。
一抗有很多来源的,如鼠源、兔源等,现在很多生物试剂公司都有产品,选个质量有保证的比较可靠,一抗与目的蛋白(抗原)结合后连接牢固,再用TBS洗脱非特异性结合的抗体,再加二抗孵化,再洗脱,二抗一般用碱性磷酸化酶或者辣根过氧化物酶标记,这样待检目的蛋白就偶联上一抗--二抗--标记酶,最后再用发光液作为酶底物反应,在暗室中即可看见信号强弱不同的荧光,再用胶片曝光就得到了western最终结果。
4.封闭(Blocking)将膜用TBS从下向上浸湿,移至含封闭液的平皿中,室温脱色摇床上摇动封闭1h。
从转膜完毕后所有的步骤,一定要注意膜的保湿,避免膜的干燥,否则极易产生较高的背景。
对于一些背景较高的抗体,可以4℃封闭过夜。
转移成功后的膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点,为防止这些位点与抗体结合引起非特异的染色和背景,一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合,增强信噪比。
封闭剂应该封闭所有未结合位点而不替换膜上的靶蛋白、不结合靶蛋白的表位,也不与抗体或检测试剂有交叉反应。
最常见的封闭剂是BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶和Tween-20,缓冲溶液是TBS或PBS。
惰性蛋白质BSA、脱脂奶粉、酪蛋白、明胶或非离子去污剂Tween-20封闭膜上的未结合位点可以降低抗体的非特异性结合。
Tween-20这种非离子型去污剂在乳化蛋白时,不破坏蛋白的结构,可减少对蛋白质之间原有的相互作用的破坏5. 一抗孵育(Primary antibody incubation)将一抗用TBST(TBST中含有 Tris-Hcl, NaCl,tween20,是做WESTERN BLOT中常用的缓冲溶液)稀释至适当浓度(在1.5 ml离心管中);撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上,四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整;将抗体溶液加到保鲜膜上;从封闭液中取出膜,用滤纸吸去残留液后,将膜蛋白面朝下放于抗体液面上,掀动膜四角以赶出残留气泡;室温下孵育1~2 h后,回收一抗。