(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验
蛋白质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）
蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验，WesternBlot）蛋⽩质印迹法（免疫印迹试验）即 Western Blot。
它是分⼦⽣物学、⽣物化学和免疫遗传学中常⽤的⼀种实验⽅法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或⽣物组织样品进⾏着⾊。
通过分析着⾊的位置和着⾊深度获得特定蛋⽩质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
蛋⽩免疫印迹（Western Blot）是将电泳分离后的细胞或组织中蛋⽩质从凝胶转移到固相⽀持物NC膜或PVDF膜上，然后⽤特异性抗体检测某特定抗原的⼀种蛋⽩质检测技术，现已⼴泛应⽤于基因在蛋⽩⽔平的表达研究、抗体活性检测和疾病早期诊断等多个⽅⾯。
⼀提起Western blot，⼤家会不禁联想到Southern blot和Northern blot。
其实它们的名字也是个有趣的故事。
1975年，Edwin Southern教授发明了DNA杂交检测技术，故命名为Southern blot。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授⼜发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blot相似，故命名为Northern。
George Stark这位⽜⼈教授在两年后⼜开发出类似的蛋⽩质检测⽅法。
1981年，Neal Burnette将其命名为Western blot。
为什么当时没叫Eastern blot呢？这⽆从考证，不过科学家们还真是挺有创意的。
30年来， Western blot技术已成为蛋⽩质研究中最常⽤的⼯具。
它的标准流程如下：蛋⽩质⾸先通过SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，再通过电泳转移到固相⽀持物上，固相⽀持物包括硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜。
⾸先将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的⾮特异性吸附，这样固定的蛋⽩质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作⽤。
最后通过放射、⽣⾊或化学发光的⽅法进⾏定位。
Western Blot原理与Northern Blot、Southern blot类似。
Western Blot实验(蛋白质印迹法)
时间：2016-05-07
一：蛋白定量（实验前处理）
• 组织：到手的组织状态：冰袋快递：组织腐烂，蛋白含量减少 干冰快递：基本无影响 甲醛处理：石蜡包埋组织蛋白提取试剂盒 需用匀浆器，液氮等方法加入1*PBS充分研磨 裂解液量：组织（g）：裂解液（ml）=1:10 细胞：一般为细胞悬液实验前需确定细胞大概浓度 裂解液量： 107数量细胞加入1ml裂解液
五：封闭（过程）
• 丽春红染色漂洗完成后。 • 清洗干净的膜放入盛有5%BSA的容器中，室温 封闭60-90min，或者4度过夜。
• 5%BSA：秤取2gBSA
加40ml 1xPBS(或TBST)
六：一抗孵育（查询抗体）
决定二抗属性 条带大小
适用实验
一抗稀释比例
六：一抗孵育（过程）
• 封闭完成前，参照说明书将一抗用5%BSA稀释到足够实验 需求的量（无特殊要求，一抗稀释液用封闭液）。 • 封闭完成后，从膜上剪下宽度为1.5cm左右相应蛋白大小 条带，倒掉封闭液，加入稀释好的一抗溶液，摇床上平缓 摇动，室温孵育120min或4℃孵育过夜。 • 一抗孵育完成后，倒掉一抗溶液（有回收要求的抗体，回 收一抗溶液4℃保存），用TBST漂洗膜4次，第一次漂洗 主要漂洗BSA，冲刷后便可倒去，TBST可以加至膜漂浮在 液体中，每次10min。
• 分离胶
分离胶浓度 试剂 6% 分子量（kDa) 去离子水（ml） 30％丙烯酰胺（ml） 1.5MTris－HCl （PH8.8）（ml） 10％SDS（ml） 10％AP（ml） TEMED（ul） 总体积（ml） ≥94 5.3 2 2.5 0.1 0.1 0.008 8% 70-94 4.6 2.7 2.5 0.1 0.1 0.006 10% 55-70 4.0 3.3 2.5 0.1 0.1 0.004 12% 20-55 3.3 4.0 2.5 0.1 0.1 0.004 15% 10-20 2.3 5.0 2.5 0.1 0.1 0.004 18% ≤10 1.3 6.0 2.5 0.1 0.1 0.004
蛋白质免疫印迹实验
蛋白质免疫印迹实验（Western Blot）蛋白质免疫印迹（Western Blot）实验原理蛋白质免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的一种蛋白质检测方法。
对已知的表达蛋白，可以用相应的抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可以融合部分的已知片段进行检测，如HA-tag，Flag-tag，c-myc-tag等。
Western Blot采用的是聚丙烯酰胺（PAGE）凝胶电泳，被检测的是蛋白质，其中检测探针是相应的抗体，显色是使用的标记后的二抗。
经过PAGE凝胶分离的蛋白质样品，转移到固相载体上，如醋酸纤维素膜，固相载体以非共价键的形式吸附蛋白质。
然后以固相载体上的蛋白质作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，然后再与标记后的二抗起反应，经过底物显色以检测目的蛋白。
蛋白质免疫印迹（Western Blot）原理蛋白免疫印迹法主要分为三个阶段进行第一阶段是SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)在这个阶段，经过变性处理的蛋白质样品经SDS处理后会带上阴性电荷,在聚丙烯酰胺凝胶中在电场的作用下从阴极向阳极泳动,且分子量越小,泳动速度就越快。
所以在此阶段，根据蛋白的泳动速度可以将样品中的蛋白质根据其分子量的大小进行分离，此阶段分离效果肉眼不可见。
如果想观察蛋白的电泳情况，可以在电泳完成后进行考马斯亮蓝染色进行观察；第二阶段为电转移，又称为转膜。
即将在凝胶中已经分离的蛋白质条带通过电场的作用转移至硝酸纤维素膜上, 一般选用恒流300 mA，通电90 min即可将凝胶中的蛋白条带转移到醋酸纤维素膜载体上。
转移到载体上的蛋白条带也是肉眼不可见的，如果想观察转移的效果，可以在转移后对载体进行丽春红染液染色。
第三阶段为酶联免疫显色检测将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜(相当于包被了抗原的固相载体)依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后,加入能形成不溶性显色物的酶反应底物,使目的条带蛋白显色。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
WesternBlot蛋白免疫印迹法
3 Western blot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）, 29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）, 1g,去离子水溶解，37℃ 水浴助溶，定容至100mL。
0.45M m滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。
2）10%十二烷基硫酸钠（5口5）：SDS，10g；H2O，80mL。
68℃加热溶解，浓HCl 调pH 至7.2，定容至100mL，室温保存。
3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。
避光，4℃保存。
（4℃2 周）4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至8.8，定容至100mL，4℃保存。
5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至 6.8，定容至100mL，4℃保存。
6）电泳缓冲液（10X）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O, 800mL。
调节pH 至8.3, 定容至1L，4℃保存（用时稀释为1义）。
7）5X SDS-PAGEloadingBuffer （5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；澳酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。
充分混匀，分装成500M L/份，室温保存。
使用前每份加入25M L p -巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。
8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。
室温保存。
10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；力口H2O 600mL 充分溶解，加200mL 甲醇，混匀，定容至1匕，室温保存。
Western blot(蛋白印迹法)详细步骤
Western blot（蛋白印迹法）详细步骤一、组织的研磨准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。
②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。
③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。
④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。
注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h 以上。
2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。
3.每种样品都最好留有副管，备用。
二、裂解提蛋白准备：裂解液配制比例RIPA:PMSF=1000：10=100：1若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。
②盖好盖子，在冰上裂解30~40min.③到时间后于4℃，12000rpm离心10min，取上清液转移到新的离心管中，于-20℃保存。
注意：1.裂解液加入后用手指弹一下混匀，当加入量很少时，成粘稠状，有必要时应用枪头混匀。
三、BCA法测定蛋白浓度（BCA试剂盒）准备：BCA试剂盒（BCA试剂A、BCA试剂B、蛋白标准液）、酶标板、酶标仪、摇床步骤：①按1:15或1:30稀释待测样品，即取1μl样品+14μl水。
③按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50:1）根据样品数量配制BCA工作液。
④每个标准品孔加入200μl BCA工作液，样品孔加入待测样品10μl和200μlBCA工作液，充分混匀，在摇床上震荡30s，37℃放置30min，于492nm下测定OD值。
⑤标准曲线以蛋白含量（μg）为横坐标，吸光度为纵坐标，根据样品的吸光度可以在标准曲线上查得相应的蛋白含量。
蛋白免疫印迹（WesternBlot）
蛋白免疫印迹（WesternBlot）1.4.9 细胞裂解液50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去氧胆酸钠及0.1% SDS1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。
1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。
1.4.12转膜缓冲液Tris碱3.03g，甘氨酸14.4g，甲醇200ml，补ddH2O 至1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。
4℃避光保存。
1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。
1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。
1.4.15 10%SDSSDS 10g，ddH2O定容100ml。
1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）丙烯酰胺29g，N，N’-Y亚甲双丙烯酰胺1g，温热去离子水分别溶解上述后,再补去离子水至100ml.滤纸过滤,储于棕色试剂瓶中,4℃保存一月。
1.4.17 10×TBST缓冲液浓度为100mmol/L Tris-HCl pH 8.0；1500 mmol/L NaCl；0.2%Tween-20，补水至1000ml. 高压灭菌，4℃保存，使用前再做10 倍稀释。
1.4.18 封闭液（5%脱脂奶粉）脱脂奶粉 5g，1×TBST 80ml,充分溶解后补1×TBST 至100ml。
1.4.19 10%过硫酸胺APS（4℃避光保存）APS 10g，ddH2O定容100ml。
蛋白质免疫印迹(Western Blot,WB )
蛋白质免疫印迹（Western Blot，WB ）标签：western-blot免疫印迹 蛋白质蛋白质免疫印迹可应用于：（1）从蛋白质混合物中检出目标蛋白质；（2）定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况；（3）用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA相互作用后续分析。
实验材料蛋白质样品试剂、试剂盒裂解液 PBS SDS上样缓冲液 电泳缓冲液 转移缓冲液 丽春红染液 TBST TBS 洗脱抗体缓冲液 抗体仪器、耗材电泳仪移液器脱色摇床显影仪实验方法原理Western免疫印迹，是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。
对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，探针是抗体，显色用标记的二抗。
经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
实验步骤一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO40.24 g；加ddH2O至1000 ml。
Westernblotting蛋白免疫印迹实验
裂解液用量说明： 通常6孔板每孔细胞加入150μL裂解液，若细胞密度非常高可以适当加大裂解液用量至200μL或250μL。
22
3.1.2 蛋白含量测定
a).配制BCA工作液：根据标准品和样品数量，按50体积试剂 A,1体积试剂B配制适量BCA工作液，充分混匀。
b).将标准品、待测样品和工作液按下表加入到96孔板中，混
5
1.2 蛋白免疫印迹的应用
• 检测样品中特异性蛋白质是否存在
例转 ：移 李 桂 波 . 利 用 免 疫 印 迹 法 钓 取 P C 3 M 细 胞 中 与 人 前 列 腺 癌 高 相关特异性短肽结合蛋白的研究[D].吉林:吉林大学,2007.
• 对特异性蛋白质进行半定量分析
例：
6
1.3 WB的原理
积。 注意事项: • 过滤后4℃保存。 • 这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节pH值，而不用 Tris-HCL。 ④转移缓冲液：
2 . 9 g 甘 氨 酸 、 5 . 8 g Tr i s 碱 、 0 . 3 7 g S D S ， 并 加 入 2 0 0 m L 甲 醇 ， 加 水 至 总 量 1 L 。
匀。
管号 试剂(μL)
空白
标准管
管 1×3 2×3 3x3 4×3 5×3
6×3
测定管 ×2
蛋白质标准液 (1mg/mL)
0
1
2
4
6
8
10
—
蒸馏水(μL) 10 9
8
6
4
2
0
—
待测样(μL) — — —
—
—
—
—
10
BCA工作液 (μL)
200
200
(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验
蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。
【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
蛋白质印迹分析（WesternBlotAnalysis）
蛋⽩质印迹分析（WesternBlotAnalysis）蛋⽩质印迹分析(Western Blot Analysis)【实验⽬的】了解蛋⽩质印迹法的基本原理及其操作和应⽤。
【实验原理】蛋⽩质印迹法⼜称为免疫印迹法，这是⼀种可以检测固定在固相载体上蛋⽩质的免疫化学技术⽅法。
待测蛋⽩既可以是粗提物也可以经过⼀定的分离和纯化,另外这项技术的应⽤需要利⽤待测蛋⽩的单克隆或多克隆抗体进⾏识别。
如图所⽰，可溶性抗原，也就是待测蛋⽩⾸先要根据其性质，如分⼦量，分⼦⼤⼩，电荷以及其等电点等采⽤不同的电泳⽅法进⾏分离；通过电流将凝胶中的蛋⽩质转移到聚偏⼆氟⼄烯膜上；利⽤抗体（⼀抗）与抗原发⽣特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取⽬的蛋⽩。
值得注意的是在加⼊⼀抗前应⾸先加⼊⾮特异性蛋⽩，如⽜⾎清⽩蛋⽩对膜进⾏“封阻”⽽防⽌抗体与膜的⾮特异性结合。
经电泳分离后的蛋⽩往往需再利⽤电泳⽅法将蛋⽩质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常⽤的两种电转移⽅法分别为: 1.半⼲法: 凝胶和固相载体被夹在⽤缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。
2.湿法：凝胶和固相载体夹⼼浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进⾏。
由于湿法的使⽤弹性更⼤并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这⾥只描述湿法的基本操作过程。
对于⽬的蛋⽩的识别需要采⽤能够识别⼀抗的第⼆抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利⽤辣根过氧化物酶所催化的⼀个⽐⾊反应，该反应的产物有特定的颜⾊且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对⼆抗的识别⽽识别⼀抗，进⽽判断出⽬标蛋⽩所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。
【实验操作】⒈.蛋⽩质的分离根据⽬的蛋⽩的性质，利⽤电泳⽅法将其进⾏分离。
为提⾼电转移的效率，通常采⽤SDS/PAGE技术。
分离实验结束后，⾸先将样品墙的上边缘⽤⼩⼑去除，然后在胶板的右上⾓切⼀个⼩⼝以便定位，⼩⼼放⼊转移缓冲溶液中待⽤。
western blot 免疫印迹实验
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE）
转膜
封闭
加抗体
一抗
检测
可以看到目的条带
二抗上的酶：辣根 过氧化物酶，有其 底物存在时会发光
二抗：被标记了的 抗体（检测）
一个一抗可以和两 个甚至更多的二抗 结合
请老师与同学们指正
滤纸：维持transfer buffer稳定的流动 胶 膜 滤纸
海绵垫：固定整个系统
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE） 转膜 封闭 加抗体 检测
所有蛋白从胶转移到膜上，并 于膜紧密结合，封闭是指还空 白的结合位点，防止后面加的 抗体和膜结合（阻止非特异性 结合）
和蛋白高度亲和
胶
膜
把蛋白转移到膜上进行检测（为于表面更容易与抗体结合） 蛋白带负电，外加一个电场，蛋白从负往正
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE）
转膜 封闭
海绵垫
加抗体检测ຫໍສະໝຸດ 放入电泳槽中：胶靠近负极， 膜靠近正极，在transfer buffer中加入甲醇（甲醇促 使蛋白与SDS分离），使蛋 白更好的与膜结合。
western blot 免疫印迹实验
western blot 免疫印迹实验
目的（功能）：检测和分析蛋白
大分子量
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE）
转膜 封闭
小分子量
加抗体
检测
SDS带负电荷，与蛋白结合使蛋白带负电，从而能在电场作用下迁移
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE） 转膜 封闭 加抗体 检测
蛋白质印迹(Western blot)实验方案
蛋白质印迹（Western blot）实验方案溶液和试剂裂解缓冲液这些缓冲液可在 4 ℃下保存数周，或者以分装形式在 -20 ℃下保存长达 1 年。
Nonidet-P40 (NP40) 缓冲液150 mM NaCl1.0% NP40（可用 0.1% Triton X-100 替代）50 mM Tris-HCl pH 8.0蛋白酶抑制剂RIPA 缓冲液（放射免疫沉淀试验缓冲液）150 mM NaCl1.0% NP-40 或0.1% Triton X-1000.5% 脱氧胆酸钠0.1% SDS（十二烷基硫酸钠）50 mM Tris-HCl pH 8.0蛋白酶抑制剂Tris-HCl 缓冲液20 mM Tris-HCl pH 7.5蛋白酶抑制剂电泳、转膜、封闭缓冲液Laemmli 2×缓冲液/上样缓冲液4% SDS10% 2-巯基乙醇20% 甘油0.004% 溴酚蓝0.125 M Tris-HCl测定 pH 并调节至 pH 6.8。
电泳缓冲液（Tris-甘氨酸/SDS）25 mM Tris 碱190 mM 甘氨酸0.1% SDS测定 pH，pH 应为约8.3。
必要时进行调节。
转膜缓冲液（湿转）25 mM Tris 碱190 mM 甘氨酸20% 甲醇测定 pH，pH 应为约8.3。
必要时进行调节。
对于大于 80 kDa 的蛋白质，我们推荐加入最终浓度为 0.1% 的 SDS。
转膜缓冲液（半干转）48 mM Tris39 mM 甘氨酸20% 甲醇0.04% SDS封闭缓冲液5% 奶粉或 BSA（牛血清白蛋白）加入 TBST 缓冲液中。
混匀并过滤。
过滤失败可能导致出现“斑点”，其中微小的黑色颗粒会在显色过程中污染印迹。
实验步骤样品裂解1. 制备细胞培养物裂解物.将细胞培养皿置于冰上，用冰冷的 PBS 洗涤细胞。
.吸出 PBS，然后加入冰冷的裂解缓冲液（每 107 细胞/100 mm 培养皿/150 cm2培养瓶加入 1 ml；每 5×106细胞/60 mm 培养皿/75 cm2培养瓶加入 0.5 ml）。
完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
蛋白质印迹(Western blotting)实验操作步骤
蛋白质印迹/Western blotting实验操作步骤一、总蛋白的提取单层贴壁细胞总蛋白的提取：1)吸除培养液2)每皿细胞加4℃预冷的 PBS。
平放轻轻摇动 1min 洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（PBS会降低细胞裂解液的效价和总蛋白的浓度）3)加裂解液于冰上裂解 30 min，为使细胞充分裂解，培养瓶要经常来回摇动（可放置在4℃摇床裂解）。
4)裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至 1.5mL 离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行）5)在EP管中将细胞震碎（10s/次，3次）6)于4℃下 12000rpm 离心 20-30 min。
（离心机提前预冷至4℃）7)将离心后的上清分装转移倒 1.5mL 的离心管中放于－20℃保存。
二、BCA法测蛋白浓度1)将BCA protein assay每孔 A液200μL,B液4μL混合，96孔板每孔加入22.5μLdd水，2.5μL蛋白提取液，200μLA+B混合液2)在烘箱中37℃，90r，孵育30min3)使用酶标仪测出吸光度后，使用公式y=0.9154x-0.118计算出蛋白浓度（浓度需要×10）4)将蛋白配成等浓度等体积（使用配置好的裂解液配），按照4：1加入5X loading buffer然后煮5min（100℃），放入-20℃保存三、SDS-PAGE电泳板子1.5mm，梳子1.5mm1）清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲洗2）验漏：玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上，加满水验漏3）灌胶：验漏结束后用纸吸干水分，按方法配制下层胶（4mL+4mL+80μLAP),灌胶时，可用 1mL 枪吸取胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加1 mL水，液封后的胶凝的更快。
蛋白质印迹分析（WesternBlotAnalysis）
蛋⽩质印迹分析（WesternBlotAnalysis）【实验⽬的】了解蛋⽩质印迹法的基本原理及其操作和应⽤。
【实验原理】蛋⽩质印迹法⼜称为免疫印迹法，这是⼀种可以检测固定在固相载体上蛋⽩质的免疫化学技术⽅法。
待测蛋⽩既可以是粗提物也可以经过⼀定的分离和纯化,另外这项技术的应⽤需要利⽤待测蛋⽩的单克隆或多克隆抗体进⾏识别。
如图所⽰，可溶性抗原，也就是待测蛋⽩⾸先要根据其性质，如分⼦量，分⼦⼤⼩，电荷以及其等电点等采⽤不同的电泳⽅法进⾏分离；通过电流将凝胶中的蛋⽩质转移到聚偏⼆氟⼄烯膜上；利⽤抗体（⼀抗）与抗原发⽣特异性结合的原理，以抗体作为探针钓取⽬的蛋⽩。
值得注意的是在加⼊⼀抗前应⾸先加⼊⾮特异性蛋⽩，如⽜⾎清⽩蛋⽩对膜进⾏“封阻”⽽防⽌抗体与膜的⾮特异性结合。
经电泳分离后的蛋⽩往往需再利⽤电泳⽅法将蛋⽩质转移到固相载体上,我们把这个过程称为电泳印迹。
常⽤的两种电转移⽅法分别为:1.半⼲法: 凝胶和固相载体被夹在⽤缓冲溶液浸湿的滤纸之间,通电时间为10分钟~30分钟。
2.湿法：凝胶和固相载体夹⼼浸放在转移缓冲溶液中，转移时间可从45分钟延长到过夜进⾏。
由于湿法的使⽤弹性更⼤并且没有明显浪费更多的时间和原料，因此我们在这⾥只描述湿法的基本操作过程。
对于⽬的蛋⽩的识别需要采⽤能够识别⼀抗的第⼆抗体。
该抗体往往是购买的成品，已经被结合或标记了特定的试剂，如辣根过氧化物酶。
这种标记是利⽤辣根过氧化物酶所催化的⼀个⽐⾊反应，该反应的产物有特定的颜⾊且固定在固相载体上，容易鉴别。
因此可通过对⼆抗的识别⽽识别⼀抗，进⽽判断出⽬标蛋⽩所在的位置。
其他的识别系统包括碱性磷酸酶系统和125I标记系统。
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蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。
【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）（6）于4℃下12000 rpm离心5 min。
（提前开离心机预冷）（7）将离心后的上清分装转移倒0.5 ml的离心管中放于－20℃保存。
2.组织中总蛋白的提取（1）将少量组织块置于1～2 ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。
（2）加400 μL单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。
然后置于冰上。
（3）几分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾几次使组织尽量碾碎。
（4）裂解30 min后，即可用移液器将裂解液移至1.5 ml离心管中，然后在4℃下12000 rpm 离心5 min，取上清分装于0.5 ml离心管中并置于－20℃保存。
3.加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以除按1操作外还应收集培养液中的细胞。
以下是培养液中细胞总蛋白的提取：（1）将培养液倒至15 ml离心管中，于2500 rpm离心5 min。
（2）弃上清，加入4 ml PBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500 rpm离心5 min。
弃上清后用PBS重复洗涤一次。
（3）用枪洗干上清后，加100 μL裂解液（含PMSF）冰上裂解30 min，裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。
（4）将裂解液与培养瓶中裂解液混在一起4℃、12000 rpm离心5 min，取上清分装于0.5 ml 离心管中并置于－20℃保存。
三、蛋白含量的测定1.制作标准曲线（1）从－20℃取出1 mg/ml BSA，室温融化后，备用。
（2）取18个1.5 ml离心管，3个一组，分别标记为0 mg，2.5 mg，5.0 mg，10.0 mg，20.0 mg，40.0 mg。
（3）按下表在各管中加入各种试剂。
（4）混匀后，室温放置2 min。
在生物分光光度计（Bio-Photometer，Eppendorf）上比色分析。
2.检测样品蛋白含量（1）取足量的1.5 ml离心管，每管加入4℃储存的考马斯亮蓝溶液1 ml。
室温放置30 min 后即可用于测蛋白。
（2）取一管考马斯亮蓝加0.15 mol/L NaCl溶液100 ml，混匀放置2分钟可做为空白样品，将空白倒入比色杯中在做好标准曲线的程序下按blank测空白样品。
（3）弃空白样品，用无水乙醇清洗比色杯2次（每次0.5 mL），再用无菌水洗一次。
（4）取一管考马斯亮蓝加95 ml 0.15 mol/L NaCl NaCl溶液和5 ml待测蛋白样品，混匀后静置2 min，倒入扣干的比色杯中按sample键测样品。
注意：每测一个样品都要将比色杯用无水乙醇洗2次，无菌水洗一次。
可同时混合好多个样品再一起测，这样对测定大量的蛋白样品可节省很多时间。
测得的结果是5 ml样品含的蛋白量。
四、SDS－PAGE电泳1.清洗玻璃板一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
2. 灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）按前面方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝的更快。
（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度时要放慢速度。
操作时胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。
加水液封时要很慢，否则胶会被冲变型。
）（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。
再等3 min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
（4）按前面方法配4%的浓缩胶,加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳子插入浓缩胶中。
灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。
插梳子时要使梳子保持水平。
由于胶凝固时体积会收缩减小，从而使加样孔的上样体积减小，所以在浓缩胶凝固的过程中要经常在两边补胶。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
（5）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
）（6）测完蛋白含量后，计算含50 ng蛋白的溶液体积即为上样量。
取出上样样品至0.5 ml 离心管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
（上样总体积一般不超过15 μl，加样孔的最大限度可加20 μl样品。
）上样前要将样品于沸水中煮5 min使蛋白变性。
（7）加足够的电泳液后开始准备上样。
（电泳液至少要漫过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
加入下一个样品时，进样器需在外槽电泳缓冲液中洗涤3次，以免交叉污染。
3.电泳电泳时间一般4～5 h，电压为40 V较好，也可用60 V。
电泳至溴酚兰刚跑出即可终止电泳，进行转膜。
五、转膜1. 转一张膜需准备6张7.0～8.3 cm的滤纸和1张7.3～8.6 cm的硝酸纤维素膜。
切滤纸和膜时一定要戴手套，因为手上的蛋白会污染膜。
将切好的硝酸纤维素膜置于水上浸2 h才可使用。
（用镊子捏住膜的一边轻轻置于有超纯水的平皿里，要使膜浮于水上，只有下层才与水接触。
这样由于毛细管作用可使整个膜浸湿。
若膜沉入水里，膜与水之间形成一层空气膜，这样会阻止膜吸水。
2. 在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜。
3. 将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
）在垫子上垫三层滤纸（可三张纸先叠在一起在垫于垫子上），一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
4. 要先将玻璃板撬掉才可剥胶，撬的时候动作要轻，要在两个边上轻轻的反复撬。
撬一会儿玻璃板便开始松动，直到撬去玻板。
（撬时一定要小心，玻板很易裂。
）除去小玻璃板后，将浓缩胶轻轻刮去（浓缩胶影响操作），要避免把分离胶刮破。
小心剥下分离胶盖于滤纸上，用手调整使其与滤纸对齐，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜盖于胶上，要盖满整个胶（膜盖下后不可再移动）并除气泡。
在膜上盖3张滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，擀几下就可合起夹子。
整个操作在转移液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
（转移液含甲醇，操作时要戴手套，实验室要开门以使空气流通。
）5. 将夹子放入转移槽槽中，要使夹的黑面对槽的黑面，夹的白面对槽的红面。
电转移时会产热，在槽的一边放一块冰来降温。
一般用60 V转移2 h或40 V转移3 h。
6. 转完后将膜用1×丽春红染液染5 min（于脱色摇床上摇）。
然后用水冲洗掉没染上的染液就可看到膜上的蛋白。
将膜晾干备用。
六、免疫反应1 . 将膜用TBS从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床上摇动封闭1h。
2. 将一抗用TBST稀释至适当浓度（在1.5 ml离心管中）；撕下适当大小的一块儿保鲜膜铺于实验台面上，四角用水浸湿以使保鲜膜保持平整；将抗体溶液加到保鲜膜上；从封闭液中取出膜，用滤纸吸去残留液后，将膜蛋白面朝下放于抗体液面上，掀动膜四角以赶出残留气泡；室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min。
3. 同上方法准备二抗稀释液并与膜接触，室温下孵育1～2 h后，用TBST在室温下脱色摇床上洗两次，每次10 min；再用TBS洗一次，10 min，进行化学发光反应。
七、化学发光，显影，定影1. 将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1 min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1 min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
2. 在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1 cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1 min或5 min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为1～2 min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10 min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
应注意的是：显影和定影需移动胶片时，尽量拿胶片一角，手指甲不要划伤胶片，否则会对结果产生影响。