实验报告三 免疫印迹
实验四.免疫印迹
样品的浓缩效应
SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳使用一种不连续的 缓冲液系统,在这一系统中，凝胶分为低浓度的 成层胶和较高浓度的分离胶，配制凝胶的缓冲 液也有不同的pH和离子强度。
当电泳时，凝胶中样品里的SDS多肽复合物沿 移动的界面迁移，在分离胶表面形成了一个极 薄的层，极大地浓缩了样品的体积
同时，在水溶液中，SDS—多肽复合物具有近似的形状(长 椭圆棒状)，并且不同SDS—多肽复合物的短轴长度趋于一 致，而长轴与分子量成正比。这样，SDS—多肽复合物， 在SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳的迁移率，不再 受蛋白质多 肽原有电荷和形状的影响，而只与其分子量有关，并且在 一定条件下与迁移率成线性关系
凝胶的分子筛效应
聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺(acry1amide，简 称Acr)和交联剂亚甲双丙烯酰胺(N,N-methylene bisacry1amide，简称Bis)在催化剂的作用下聚合 而成
凝胶聚合时所形成的微孔影响了不同SDS—多 肽复合物电泳时的迁移率，即所谓的分子筛效 应。微孔的大小由于Bis和Acr的比例和凝胶的 浓度决定。
按图所示装好印迹电泳装置，注意蛋白
质转移方向 -
+，除去膜和滤纸间的
气泡
免疫学检测摇育过夜来自封闭加一抗摇育1h
加二抗
洗膜
摇育2h（3次，每次10min ）
洗膜
加底物
试验记录
方法
SDS-PAGE 凝胶的制备
SDS-PAGE贮备液（试剂中的A~F液）按 比例制备 分离胶(T=12％) 浓缩胶(T=5％ )
灌胶
灌分离胶 分离胶溶液迅速灌注 ，留出灌注浓缩胶 所需的空间（梳子长加1cm）
灌浓缩胶 分离胶聚合完全，灌入浓缩胶并立即插 入Teflon梳子（避免气泡）移出梳子，用 去离子水洗加样槽
免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤
活性蛋白整体方案免疫印迹(Western Blot)的基本原理、实验步骤Western Blot原理Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。
固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
转移后的NC膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭NC膜上的疏水结合位点。
用目标蛋白的抗体（一抗）处理NC膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。
用一抗处理过的NC膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG的抗体。
处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
实验操作(一)配胶1.将玻璃板洗净，最后用ddH2O冲洗，将与胶接触的一面向下倾斜置于干净的纸巾晾干。
2.分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡），加入10%AP及TEMED即可。
3.封胶：灌入2/3的分离胶后应立即封胶，胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS。
封胶后静置至胶凝固。
待胶凝后将封胶液倒掉，如用醇封胶需用大量清水及ddH2O活性蛋白整体方案冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
4.灌好浓缩胶后1h拔除梳子，注意在拔除梳子时防止气泡进入梳孔使梳孔变形。
拨出梳子后用ddH2O冲洗胶孔两遍以去除残胶，随后用0.1%的SDS封胶。
蛋白定量的实验报告
蛋白定量的实验报告本实验旨在利用免疫印迹（Western blot）技术进行蛋白定量，了解不同浓度蛋白样品的定量方法及其应用，为今后实验设计提供参考。
实验原理：免疫印迹是一种常用的蛋白分析技术，通过在蛋白印迹膜上利用特异性抗体与目标蛋白相互作用，从而检测和定量目标蛋白的存在量。
免疫印迹技术的基本步骤包括：电泳分离蛋白样品、将蛋白转移至膜上、与抗体结合、信号发光和检测。
实验步骤：1. 准备蛋白样品：将待测蛋白样品依次制备成不同浓度的标准品，分别为25 μg/mL、50 μg/mL、75 μg/mL和100 μg/mL。
2. SDS-PAGE电泳：将不同浓度的蛋白样品加入蛋白电泳缓冲液，按照分子量大小进行电泳分离。
3. 蛋白转移：将电泳分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，可以使用湿式转印法或半湿式转印法。
4. 阻断与孵育：用5%非脂乳糖或3%牛血清蛋白阻断膜上的非特异性结合位点，防止非特异性结合。
5. 一抗孵育：将目标蛋白的一抗加入阻断液中，孵育膜，使抗体与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗孵育：将与目标蛋白一抗结合的二抗加入孵育液中，孵育膜，二抗一般会携带荧光物质或酶标记，在可见光或紫外线下观察或进一步检测。
7. 发光与显影：通过添加发光底物或显色剂，观察蛋白在膜上的相对强度并进行定量分析。
结果与讨论：在本次实验中，我们成功制备了不同浓度的标准品，并进行了免疫印迹实验，通过观察膜上的发光信号强度来定量目标蛋白的含量。
从实验结果中我们可以看出，随着标准品蛋白浓度的增加，免疫印迹膜上的发光信号强度也呈现出增加的趋势。
这是因为在免疫印迹技术中，标准品的蛋白浓度与免疫印迹膜上的发光信号强度成正相关关系。
因此，通过在实验中测量标准品的发光信号强度，可以根据标准曲线来计算待测样品中目标蛋白的含量。
需要注意的是，在进行免疫印迹实验时，关键的环节是选择合适的抗体。
抗体的特异性与亲和力会直接影响免疫印迹结果的准确性。
因此，在实验设计中，需要充分考虑抗体的选择，并进行合适的预实验来验证抗体的特异性和性能。
免疫印迹实验实验报告
免疫印迹实验实验报告免疫印迹实验实验报告引言：免疫印迹实验是一种常用的生物化学实验方法，用于检测和分析蛋白质的存在及其相对丰度。
通过将目标蛋白质从复杂的混合物中分离出来，并使用特异性抗体进行检测，免疫印迹实验能够提供关于蛋白质的信息，如分子量、丰度和修饰状态等。
实验目的：本次实验的目的是通过免疫印迹实验检测特定蛋白质在不同组织中的表达差异，并分析其可能的功能和调控机制。
通过这一实验，我们希望深入了解蛋白质的表达和功能，为进一步的研究提供实验依据。
材料与方法：1. 细胞或组织样本：收集不同组织或细胞系的样本，如肝脏、肺、肾脏等。
2. 组织破碎液：含有蛋白酶抑制剂的RIPA缓冲液。
3. SDS-PAGE凝胶：根据目标蛋白质的分子量选择合适的凝胶浓度。
4. 转膜装置：将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到膜上。
5. 抗体：选择与目标蛋白质特异性结合的一抗和二抗。
6. 蛋白质检测：使用化学发光等方法检测蛋白质的存在。
实验步骤：1. 样本制备：将收集到的组织样本切碎并加入组织破碎液，通过离心将细胞碎片和细胞核沉淀分离。
2. 蛋白质浓度测定：使用BCA或Lowry等方法测定样品中蛋白质的浓度。
3. SDS-PAGE电泳：将样品加入SDS-PAGE凝胶孔中，进行电泳分离。
4. 转膜：将SDS-PAGE凝胶上的蛋白质转移到预处理好的膜上。
5. 阻断与一抗孵育：将膜放入含有牛奶或BSA的缓冲液中，以阻断非特异性结合。
然后加入特异性抗体孵育膜。
6. 二抗孵育与检测：加入与一抗结合的二抗，并使用化学发光等方法检测蛋白质的存在。
结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功地检测到了目标蛋白质在不同组织中的表达差异。
以肝脏、肺和肾脏为例，我们发现在这三种组织中目标蛋白质的表达量存在明显差异。
这表明目标蛋白质在不同组织中可能具有不同的功能和调控机制。
进一步分析表明，在肝脏中目标蛋白质的表达量最高，而在肺和肾脏中表达量较低。
这可能与目标蛋白质在肝脏中的特定功能相关，例如参与代谢过程或解毒作用。
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
蛋白印迹实验报告
蛋白印迹实验报告篇一：实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验十二Western印迹鉴定目标蛋白实验目的1.了解Western blot的原理及其意义，掌握Western blot的操作方法；2.应用Western blot 技术分析鉴定经SDS-PAGE分离后转移到尼龙膜上的重组蛋白。
实验原理Western印迹法简称蛋白质印迹法。
蛋白质样品经SDS-PAGE电泳后，凝胶所含的样品蛋白质区带通过电泳方法转移、固定到载体（如尼龙膜、硝酸纤维素膜）上，固相载体以非共价键的形式与蛋白质结合，从而固定住蛋白质；以膜上的蛋白或多肽为抗原，与相应的第一抗体起免疫反应，再和酶标记或同位素标记的第二抗体反应，用适当的溶液漂洗去未结合抗体后，置含底物的溶液中温育，或通过放射自显影显出谱带，即可检测出样品中的特异蛋白组分。
试剂与器材试剂1.转移缓冲液：甘氨酸（39 mmol/L），Tris 碱（48mmol/L），SDS （%），200ml 甲醇（20%），定容至1,000mL；2.封闭液：5% 脱脂奶粉，% 叠氮钠，溶于PBST溶液中；3.丽春红S（Ponceaus）染液：丽春红S溶于1mL 冰乙酸中，加水至100mL；洗膜液：PBS 缓冲液含% Tween 20；5．DAB浓缩显色液（50X）：DAB （二氨基联苯胺）是根过氧化物酶的底物之一，临用前稀释。
6．5 x PBS：在1600mL蒸馏水中溶解Na 2HPO4 , Na H2PO4, 40g Na Cl,用/L NaOH调pH至，加水定容至2升。
高压灭菌20 分钟，室温保存。
用前稀释至1x 。
7．SDS-PAGE电泳用溶液和试剂。
器材电泳装置一套;2.电转移膜装置3.抗体-酶反应摇床操作方法〈一〉电转移1．将蛋白质样品进行SDS-PAGE，待溴酚蓝跑出胶后停止电泳（1）。
2．载手套切6-8张定性滤纸和一张尼龙膜，它们的大小应与凝胶的大小相同。
在尼龙膜的一（左）角作一记号（或剪角），与滤纸和海棉（纤维）垫浸泡于转移缓冲液中。
蛋白质免疫印迹检测Caspase-3的活化 预习报告
实验：蛋白质免疫印迹检测Caspase-3的活化预习报告（北医综合实验）一、Western Blot实验原理Western Blot (蛋白质免疫印迹法)是将经过聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体(例如硝酸纤维索薄膜——NC膜)上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肤类型及其生物学活性不变。
然后以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与相应的第—抗体(一抗)发生抗原抗体免疫反应，一抗再与酶或同位素标记的第二抗体发生免疫反应，经过底物显色或放射自显影来检测电泳分离的目的蛋白。
此方法是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法，可以定性研究目的蛋白的相对分子质量，或者定量检测目的基因蛋白水平的表达。
通常，Western Blotting的实验操作包括两部分：1. SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS—Polyacrylamide Gel Electrophoresis，SDS-PAGE)(1)聚丙烯酰胺凝胶聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(简称Acr)和少量交联剂N，N—甲叉双丙烯酰胺(简称Bis)，通过化学催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂四甲基乙二胺(TEMED)的化学聚合作用交联聚合形成的三维网状结构的高聚物。
以此为支持物的电泳就称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(Polyacrylamide Gel Electrophoresis，简称PAGE)。
聚丙烯酰胺凝胶的浓度大时，形成的网孔孔径小，适于分离相对分子质量较小的物质，反之，要分离相对分子质量较大的物质就需要选择较小的凝胶浓度。
凝胶浓度与被分离物质的相对分子质量(M r)大小的关系，大致范同如表7-1：(2)聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)聚丙烯酰胺凝胶电泳根据其有无浓缩效应，分为连续系统和不连续系统两大类。
连续系统电泳体系中缓冲液的pH值及凝胶的浓度相同，带电粒子在电场作用下，主要靠电荷效应和分子筛效应进行分离。
不连续系统中缓冲液的离子成分和pH值、凝胶浓度及电位梯度都具有不连续性，带电粒子在电场中的泳动不仅依赖电荷效应和分子筛效应，还依靠浓缩效应，因而其分离的条带清晰度及分辨率均比连续系统高。
免疫印迹
3.弃去液体，加PBS（2-3 ml）漂洗3次，每次 3-5分钟。
操作步骤
4.加入1ml酶标二抗，37℃45分钟，不时 摇动。
5.弃去液体，加入PBS（2-3ml）漂洗3次 以上，每次3-5分钟。
6.加入底物DAB覆盖NC膜，避光显色510分钟。
免疫印迹
装置示意图
电极
转移槽 膜 胶
滤纸
免疫印迹
优 点：
同时具有SDS-PAGE的高分辨力和固相 免疫测定的高特异性和敏感性；
方法简便； 标本可长期保存； 结果便于比较。
实验流程
实验方法蛋白质的SDS-聚丙 Nhomakorabea酰胺凝胶电泳 （已完成）
蛋白质从SDS-PAGE凝胶转移至硝纤膜 （已完成）
封闭硝纤膜的免疫球蛋白结合位点 （操作内容）
酶标抗体结合与染色 （操作内容）
实验材料
NC膜 1条/组 5％脱脂奶粉 1ml/组 一抗溶液 1ml/组 酶标抗体 1ml/组 PBS 40ml/组 小镊子 1支/组 底物显色液 10ml/班
操作步骤
1.封闭：把NC膜（已转印）放入小试管中， 加入5％脱脂奶粉1ml，塞上小胶塞，室温 下温育15－20分钟，期间注意缓慢摇动数 次。
7.分析结果。
结果图例
谢 谢！
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的生物学实验技术，用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平，以及研究其功能和相互作用。
本实验旨在通过免疫印迹技术，探究细胞中特定蛋白质的表达情况，为进一步的研究提供基础数据。
实验材料与方法：材料：1. 细胞或组织样本2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳样品缓冲液4. 聚丙烯酰胺凝胶5. 转印膜6. 蛋白质标记物7. 抗体8. 酶联免疫检测试剂盒方法：1. 提取细胞或组织中的蛋白质，制备细胞裂解液。
2. 将蛋白质样品与电泳样品缓冲液混合，进行电泳分离。
3. 将分离后的蛋白质转移到转印膜上。
4. 在转印膜上进行阻断，以防止非特异性结合。
5. 添加特异性抗体，与目标蛋白质结合。
6. 使用酶联免疫检测试剂盒，检测抗体与蛋白质结合的信号。
7. 分析实验结果，得出结论。
实验结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白质在细胞或组织中的表达情况。
实验结果显示，在细胞裂解液中，目标蛋白质呈现出明显的条带，证明其在细胞中存在且可被提取。
进一步分析实验结果，我们可以得出以下结论：1. 目标蛋白质在不同组织中的表达水平存在差异。
通过比较不同组织样本中目标蛋白质的表达情况，我们发现其表达水平在不同组织中存在差异。
这可能与细胞功能的差异以及组织特异性基因的调控有关。
2. 目标蛋白质在细胞发育过程中的变化。
通过对细胞或组织样本在不同发育阶段进行免疫印迹实验，我们可以观察到目标蛋白质在细胞发育过程中的表达变化。
这些变化可能与细胞分化、增殖以及功能转变等过程密切相关。
3. 目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
通过免疫印迹实验，我们可以进一步研究目标蛋白质与其他蛋白质的相互作用。
通过添加不同抗体，我们可以检测到目标蛋白质与其他蛋白质的结合情况，揭示其在细胞信号传导和调控网络中的功能。
总结：免疫印迹实验是一种非常有用的生物学实验技术，可以用于检测特定蛋白质的表达水平以及研究其功能和相互作用。
实验三 免疫印迹
Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白1. 背景印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种方法。
1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA-RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为Southern blotting。
之后，James Alwine、David Kemp和George Stark三位教授又发明了RNA杂交检测技术，因与Southern blotting相似，故命名为Northern blotting。
George Stark这位教授在两年后又开发出类似的蛋白质检测方法。
1981年，在Neal Burnette所著的Analytical Biochemistry中，首次将单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析称为Western blotting。
此后开发的Eastern blotting是Western blotting的变形，对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析称为Eastern blotting。
30年来，Western blotting技术已成为蛋白质研究中最常用的工具，用于鉴定目的蛋白是否存在样品当中，蛋白质的表达情况（上调或下调表达）和不同的样品之间的表达差异性。
pET系统是在E. coli中克隆表达重组蛋白的功能最强大的系统。
目的基因被克隆到pET质粒载体上，受噬菌体T7强转录及翻译信号控制；表达由宿主细胞提供的T7 RNA 聚合酶诱导。
T7 RNA 聚合酶机制十分有效并具选择性：充分诱导时，几乎所有的细胞资源都用于表达目的蛋白；诱导表达后仅几个小时，目的蛋白通常可以占到细胞总蛋白的50%以上。
2. 实验目的利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。
免疫印迹 实验报告
免疫印迹实验报告免疫印迹实验报告免疫印迹（Western blot）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于生物医学研究领域。
本实验旨在通过免疫印迹技术检测目标蛋白的表达情况，并探究其在细胞信号转导中的作用。
实验材料和方法：材料：1. 细胞培养基和培养器具2. 细胞裂解液3. 蛋白质电泳胶和电泳仪4. 蛋白转印膜和转印仪5. 抗体：一抗和二抗6. ECL检测试剂盒方法：1. 培养细胞并进行处理，如添加特定药物或刺激剂。
2. 收集细胞并用细胞裂解液裂解蛋白。
3. 通过SDS-PAGE电泳将蛋白质分离。
4. 将分离的蛋白转移到蛋白转印膜上。
5. 进行膜上抗原的非特异性结合位点的阻断。
6. 使用一抗与目标蛋白特异性结合。
7. 清洗膜，并使用二抗与一抗结合。
8. 再次清洗膜，并使用ECL检测试剂盒进行显色。
9. 使用图像分析软件分析结果。
结果与讨论：通过免疫印迹实验，我们成功检测到目标蛋白的表达情况。
在实验中，我们选择了细胞中一个重要的信号转导蛋白作为目标蛋白，以探究其在细胞内的作用和调控机制。
首先，我们培养了细胞并进行了不同处理。
通过细胞裂解液裂解蛋白，我们成功地提取了目标蛋白。
接下来，我们使用SDS-PAGE电泳将蛋白质分离，并将其转移到蛋白转印膜上。
通过这一步骤，我们可以将蛋白在膜上固定，并便于后续的抗体结合。
在进行免疫印迹之前，我们需要对膜进行阻断，以防止非特异性结合。
通过使用牛血清白蛋白或非脂性奶粉等物质，我们可以有效地阻断膜上的非特异性结合位点。
在阻断后，我们使用一抗与目标蛋白特异性结合。
一抗的选择对于实验结果的准确性至关重要，因此我们在实验前进行了充分的文献调研和试验优化。
在与一抗结合后，我们进行了膜的清洗，以去除未结合的抗体。
接下来，我们使用二抗与一抗结合，并再次清洗膜。
二抗通常被标记有荧光素或酶，以便于后续的信号检测。
最后，我们使用ECL检测试剂盒进行显色。
ECL技术利用酶的催化作用产生荧光或发光信号，从而检测目标蛋白的表达情况。
实验报告三--免疫印迹
实验三：免疫印迹1 原理免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC 膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器2.1 试剂（所有试剂均供两组用）2.1.1 转移缓冲液Tris 3.025g甘氨酸14.413g甲醇20mL加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)Tris 2.42gNaCl 27.750g加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL2.1.3 TTBSTBS 800mLTween-20 400μl2.1.4 封闭液及抗体稀释液脱脂奶粉0.3gTBS 100mL2.1.5 底物溶液二氨基联苯胺（DAB） 5.0mgTBS 18mLH2O220μl 临用前配2.1.6 丽春红总蛋白质染色液丽春红1g4%乙酸100mL2.1.7 5%小牛血清生理盐水小牛血清7.5mL0.85%生理盐水定容至150mL2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）酶标抗IgG 0.1mL5%小牛血清生理盐水定容至150mL2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸3 试验步骤3.1 SDS-PAGE电泳分离所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。
免疫印迹实验步骤及问题解决
免疫印迹实验步骤及问题解决一、实验步骤试剂和缓冲液1x RIPA 缓冲液: 50 mM Tris，150 mM NaCl，0.1% SDS，0.5% SDS，1% Triton X-100 或NP40. 1x PBS 缓冲液: 137 mM NaCl，2.7 mM KCl，2.7 mM Na2HPO4，2.7 mM KH2PO4，pH 7.4 BCA或Bradford蛋白分析试剂盒1.5 M Tris缓冲液（pH 8.8）: 90.68 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到8.81.0 M Tris缓冲液（pH 6.8）: 60.58 g Tris-HCl to ddH2O，500 ml溶液pH调节到6.810% APS: 100 mg AP 溶于1 ml ddH2O。
用前准备10% SDS: 10 g SDS溶于100 ml ddH2O。
1x Tris-甘氨酸电泳缓冲液: 25 mM Tris，230 mM 甘氨酸（pH 8.3），0.1% SDS。
3x SDS蛋白加样缓冲液: 150 mM Tris （pH 6.8），6% SDS，30% 甘油，30 mM EDTA和0.2% 溴酚蓝1x TTBS: 25 mM Tris（pH 7.5）: 0.15 M NaCl，0.05% Tween-20，0.001% 硫柳汞1x 转移缓冲液: 3 g Tris，14.4 g甘氨酸和200 ml甲醇，加ddH2O 到1L样品准备细胞培养样品贴壁细胞去除培养基，用1X PBS冲洗去掉残留培养基加入预冷的400 ul-1 ml 1X RIPA缓冲液/100 mm平皿。
在冰上孵育5-10 min。
完全刮下细胞并转移到在冰上预冷的1.5 ml离心管中。
（可选）充分混匀或超声处理。
4°C下12,000 rpm离心10-15 min并收集上清总蛋白用前需储存在-20°C。
免疫印迹技术实验报告
免疫印迹技术实验报告免疫印迹技术实验报告引言：免疫印迹技术是一种广泛应用于生物学研究领域的实验方法，通过检测目标蛋白在细胞或组织中的表达情况，可以帮助科学家深入了解生物体内的分子机制。
本文将介绍我们在实验室中使用免疫印迹技术的实验过程和结果，以及对实验结果的分析和讨论。
实验材料与方法：我们使用了以下材料和方法进行实验：1. 细胞或组织样本：我们选择了人类肺癌细胞系A549作为研究对象，同时还使用了正常肺组织作为对照组。
2. 蛋白提取：利用细胞裂解液将细胞或组织中的蛋白质释放出来。
3. SDS-PAGE凝胶电泳：将蛋白样品分离成不同大小的带状蛋白条带。
4. 转膜：将分离的蛋白迁移到聚合物膜上，以便进行后续的免疫检测。
5. 免疫检测：使用特异性抗体对目标蛋白进行检测，并使用辣根过氧化物酶（HRP）标记的二抗进行信号放大。
6. 显色：通过添加显色底物，使目标蛋白在免疫印迹膜上形成可见的带状条带。
7. 图像获取与分析：使用化学发光成像系统获取免疫印迹膜上的图像，并使用图像分析软件进行定量分析。
实验结果：在实验中，我们成功地提取了A549细胞和正常肺组织中的蛋白质，并进行了SDS-PAGE凝胶电泳分离。
通过免疫检测，我们发现在A549细胞中，目标蛋白X的表达水平明显高于正常肺组织。
此外，我们还观察到在A549细胞中，目标蛋白Y的表达水平也有所上调。
对实验结果的分析与讨论：通过实验结果的分析与讨论，我们可以得出以下结论：1. 目标蛋白X在肺癌细胞中的过度表达可能与肺癌的发生和发展有关。
这一发现与之前的研究结果相符，进一步验证了目标蛋白X在肺癌中的重要作用。
2. 目标蛋白Y的上调表达可能与肺癌细胞的增殖和侵袭能力增强有关。
这一发现为进一步研究目标蛋白Y在肺癌发展中的功能和机制提供了线索。
进一步研究的展望：基于本次实验结果，我们提出了以下进一步研究的展望：1. 探究目标蛋白X在肺癌细胞中的功能和调控机制，以揭示其在肺癌发展中的具体作用。
免疫印迹实验报告
竭诚为您提供优质文档/双击可除免疫印迹实验报告篇一：免疫印迹实验报告——westerblotwesternblot实验报告摘要：目的：学习并掌握westernblot分离蛋白及观察方法方法：westernblot结果：见后文结论：westernblot能很好地分离蛋白关键词：westernblot、分离、小鼠组织、蛋白westernblottestreportAbstract:objective:Learnandmasterthewesternblotprot einisolatedandobservationmethodmethods:westernblot ：,sds-pageandelectrictransferResults:seebelowKeywords:westernblot、separate、mousetissues、protein前言:免疫印迹又称western印迹(westernblotting)，与DnA的southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为nc膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，westernblotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，westernblotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
免疫印迹试验名词解释
免疫印迹试验名词解释
免疫印迹试验（immunoblotting）是一种常用的实验技术，用于检测和分离蛋白质样本中特定抗原的存在。
该技术结合了蛋白质电泳分离和免疫反应原理。
免疫印迹试验的步骤如下：
1.样本处理：将待测蛋白质样本经过电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2.转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到固定在膜上的靶蛋白（通常是聚偏二氟乙烯膜）。
3.阻断：用一种阻止非特异性结合的蛋白质（例如乳清蛋白或牛血清白蛋白）封闭膜上的未被转移的位点，以减少非特异性结合。
4.抗体结合：将特异性抗体添加到膜上，使其与目标抗原特异性结合。
5.洗涤：洗去未结合的抗体，以减少非特异性结合。
6.检测：添加适当的检测试剂，例如酶标记的二抗或荧光标记的二抗，以与特异性抗体结合的抗原发生化学或光学反应。
7.显色：通过添加染色剂，例如酶底物或荧光染料，可使目标抗原在膜上可视化。
通过免疫印迹试验，可以确定样本中特定蛋白质的存在与否，确定蛋白质的分子量，并研究蛋白质的表达水平和亚细胞定位等信息。
这项技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域广泛应用。
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实验三：免疫印迹
1 原理
免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。
不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相载体的靶蛋白所呈现的抗原表位发生特异性反应。
该技术结合了凝胶电泳分辨力高和固相免疫测定特异敏感等诸多优点，具有从复杂混合物中对特定抗原进行鉴别和定量检测，以及从多克隆抗体中检测出单克隆抗体的优越性。
该技术的灵敏度能达到标准的固相放射免疫分析的水平而无需对靶蛋白进行放射性标记。
目前，Western blotting广泛用于蛋白质研究、基础研究和临床医学的研究。
免疫印迹可分成两个步骤：蛋白质由凝胶转移至固相基质；特异性抗体检测。
蛋白质转移通常由电泳实现，现常用的方法有二：1 半干法：将凝胶和固相基质似三明治样夹在缓冲液湿润的滤纸中间，通电10-30分钟可完成转移；2 湿法：将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸在转移装置的缓冲液中，通电45分钟或过夜课完成转移。
本试验采用湿法转移。
免疫印迹用膜通常有硝酸纤维素膜和尼龙膜两种。
大多数应用前者。
本实验也用硝酸纤维素膜进行转移。
转移结束后，蛋白质的检测可分成三个步骤进行：首先，将膜同特异性抗体孵育数小时或过夜，然后将膜同可特异性识别上述抗体（一抗）的第二抗体（二抗）孵育，通常二抗连接有如辣根过氧化物酶等标记物。
目的蛋白可由该酶催化的显色反应在膜上形成有色产物加以检测。
本实验用的是酶标抗IgG，故不加一抗。
2 试剂与仪器
2.1 试剂（所有试剂均供两组用）
2.1.1 转移缓冲液
Tris 3.025g
甘氨酸14.413g
甲醇20mL
加蒸馏水约800mL，调pH至8.3，定容1000mL
2.1.2 Tris缓冲盐溶液(TBS)
Tris 2.42g
NaCl 27.750g
加蒸馏水约800mL，调pH至7.5，定容1000mL
2.1.3 TTBS
TBS 800mL
Tween-20 400μl
2.1.4 封闭液及抗体稀释液
脱脂奶粉0.3g
TBS 100mL
2.1.5 底物溶液
二氨基联苯胺（DAB） 5.0mg
TBS 18mL
H2O220μl 临用前配
2.1.6 丽春红总蛋白质染色液
丽春红1g
4%乙酸100mL
2.1.7 5%小牛血清生理盐水
小牛血清7.5mL
0.85%生理盐水定容至150mL
2.1.8 酶标抗IgG（1：1500）
酶标抗IgG 0.1mL
5%小牛血清生理盐水定容至150mL
2.2 仪器夹心式电泳槽，电泳仪，硝酸纤维素膜，直径9cm培养皿，剪刀，镊子，刀片，微量移液枪，普通滤纸
3 试验步骤
3.1 SDS-PAGE电泳分离
所需试剂、仪器以及分离步骤完全与实验六相同，故此处从略。
不同之处如下：3.1.1 样品制备：取人血清0.1ml，加稀释5倍的上样缓冲液0.5ml，振摇后10000rp/5min离心，取80μl上清液加入等体积的样品缓冲液，在沸水浴中加热3min。
瞬间离心，取上清液上样。
3.1.2 加样：拔出梳子，用电极缓冲液冲洗样品槽后加样。
上样量从左到右为5
、20、15、10、5、5、5、5、10、15、20、5μl（从中间分开，两侧对称）。
3.1.3 电泳：稳流10mA电泳，当溴酚蓝指示剂前沿到达距底部1cm左右时，停止电泳。
取出胶，将点有样品的胶条从中间切成两条，一条用常规方法染色和脱色，另一条用于转移和酶联。
3.2 转移蛋白质到硝酸纤维素膜上（电转移）
3.2.1 切割与胶尺寸相符的硝酸纤维素膜，用转移缓冲液浸泡5min使没有气泡。
3.2.2 剪2张滤纸与胶尺寸大小相符，将其与海绵一起浸泡在转移缓冲液中。
3.2.3 打开转移槽的胶板，依次放入：a. 一张浸湿的海绵；b. 一张用转移缓冲液饱和的滤纸；c. 用转移缓冲液冲洗过的胶，并小心的赶走滤纸和胶之间的气泡；
d. 硝酸纤维素膜，正面对着胶，在胶和膜的右下角剪一小角，以标明方向；
e. 一张用转移缓冲液饱和的滤纸；
f. 一张浸湿后的海绵。
3.2.4 小心的合上胶板，并立即放入转移电泳槽中。
加转移缓冲液至满。
3.2.5 插好电极，注意正负极方向，胶侧为负，NC膜侧为正。
打开电泳仪开关调至稳压60v，电泳2h，转移结束后打开胶板取出硝酸纤维素薄膜。
3.3膜的酶联免疫染色
3.3.1 用丽春红溶液检验转移是否成功，若显色清楚，用蒸馏水冲洗，TBS洗膜1min。
3.3.2 将膜放入培养皿中。
加封闭液后在37℃摇床上摇动60min。
3.3.3 取出膜，用TTBS洗膜3次，每次3min，将膜放入另一个培养皿中。
3.3.4 在培养皿中加入用150ml 5％小牛血清生理盐水配制的1：1500的酶标IgG，在冰箱中
振荡过夜。
3.3.5 取出膜，用TTBS洗3次，每次3min，最后用TBS溶液洗1次，以去除Tween-20。
3.3.6 将膜浸入10ml底物溶液中，至显色清楚后，取出膜，将胶制成干板。
4 实验结果
4.1 SDS-PAGE电泳分离结果（图1右）
上样量为10μl的泳道分离效果较5μl的泳道好，共出现4个较清晰的条带。
4.2显色后的免疫印迹膜（图1左）
在免疫印迹膜上共检测出一条带C1，应该为球蛋白，对应于右图中的C。
图1：SDS-PAGE 电泳分离结果（右图）和显色后的免疫印迹膜（左图），图上所标的数字分
别为每一个泳道的上样量（单位/μl）
5 讨论
5.1 本实验所用的样品是人血清，人血清的成分非常复杂，BioPharm International （2003）报道：Melecular and Cellular Proteomics 2002年12月号发表的一篇论文称，人血清中已确证的蛋白种类几乎翻了一番，即达到490种。
这是Pacific Northwest National Laboratory （PNNL ）的科学家利用液相层析法和质谱分析法代替传统凝胶电泳法鉴定的成果。
这些人血清蛋白包括了先前在血清中未鉴定出来的低丰度蛋白，以及尚未明功能的蛋白。
由于方法的限制，我们所用的传统电泳方法根本不可能完全分离。
5.2 血清中的蛋白主要是由白蛋白与球蛋白所构成。
健康人的白蛋白与球蛋白的比例为白蛋白约67％，球蛋白约33% 。
所以图1右中条带较深的蛋白质（C ）应该为球蛋白，图1左中被检测的条带（C 1）恰好是这条较深的条带，说明被检测的蛋白就是免疫球蛋白G （IgG ）。
这样图1左的免疫反应结果也得到合理的解释，但是决定性的结论应从两种蛋白在SDS-PAGE 电泳中的迁移率进行分析，但是尚未得到此方面的资料。
5.3 本实验所用的免疫印迹方法称酶联免疫吸附法（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA ），其方法简单，方便迅速，特异性强。
ELISA 是由抗原（抗体）先结
C C 1 人血清蛋白
10 5/μl
合在固相载体上，但仍保留其免疫活性，然后加一种抗体（抗原）与酶结合成的偶联物（标记物），此偶联物仍保留其原免疫活性与酶活性，当偶联物与固相载体上的抗原（抗体）反应后，再加上酶的相应底物，即起催化水解或氧化还原反应而呈颜色。
其所生成的颜色深浅与欲测的抗原（抗体）含量成正比。
并且抗原与抗体的结合，在一定浓度范围内，只有当两者分子比例合适时，才出
现可见反应。
5.4 IgG即免疫球蛋白G，与IgM和IgA属三种同种型天然自身抗体。
酶标记抗体IgG是将酶与抗IgG抗体经适当方法连接而成。
由于辣根过氧化物酶(Horseradish Peroxidase, HRP)活性高，稳定，分子量小，纯酶容易制备，所以最常用。
HRP的催化反应需要底物过氧化氢(H2O2)和供氢体(DH2)。
本实验所用的供氢体DAB(3.3－二氨基联苯胺)的反应产物为不溶性沉淀物，并有电子密度，故适宜于做免疫酶染色。
由于HRP的底物H2O2本身又是酶的抑制剂，因此酶促反应中使用的H2O2不能过量。
应控制在经较短时间反应后呈色即达高峰（说明H2O2已消耗殆尽）。
这样即使再延长时间也不会增加反应产物的颜色。
5.5 BSA和奶粉中常污染有IgG，但是使用Tween-20作封闭剂可以有效减少这些因素带来的干扰。
5.6 转移之后，蛋白质在硝酸纤维素膜两面分布不完全相同，因此显色反应同时
注意两面的信号。
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