免疫印迹(immunoblotting)
immunoblotting免疫印迹法
immunoblotting免疫印迹法免疫印迹法（Immunoblotting）免疫印迹法是一种常用的实验技术，用于检测和分析蛋白质的存在与表达水平。
它结合了免疫学和电泳技术，能够帮助研究者确定特定蛋白质的分子量、定量和免疫反应性。
本文将对免疫印迹法的原理、操作流程和应用范围进行探讨。
一、免疫印迹法的原理免疫印迹法的原理基于抗原抗体反应。
首先，待检样品经过电泳分离，然后将蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上。
接着，利用一系列步骤将目标蛋白质与特异性的一抗和二抗结合，形成特异性的免疫复合物。
最后，通过酶促发色反应，将免疫复合物标记出来，产生相应的信号。
二、免疫印迹法的操作流程1. 样品制备：待检样品应首先经过蛋白提取、浓缩和纯化处理，以保证分析的准确性。
其中关键的步骤是蛋白质的电泳分离，常用的方法有SDS-PAGE和聚丙烯酰胺凝胶电泳。
2. 转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚丙烯酰胺膜上，常用的方法有湿式和半湿式转印。
湿式转印适用于小分子量蛋白质，而半湿式转印适用于大分子量蛋白质。
3. 阻断：将转印膜放入含有蛋白质的阻断缓冲液中，防止非特异性结合。
通常使用的阻断缓冲液有牛奶粉、鸡蛋清或BSA。
4. 孵育：将特异性一抗加入阻断缓冲液中，与目标蛋白质发生特异性结合。
一抗的选择应该根据具体的研究目的来确定。
5. 洗涤：将转印膜反复洗涤以去除非特异性结合的抗体和杂质。
洗涤缓冲液的选择应该根据一抗的种类来确定。
6. 结合：加入特异性的二抗，与一抗结合形成免疫复合物。
二抗通常是由小鼠或兔子制备的抗小鼠或反兔子的抗体。
7. 洗涤：再次洗涤以去除未结合的二抗和杂质。
8. 检测：利用酶标技术将免疫复合物标记出来。
常用的酶标方法有辣根过氧化物酶和碱性磷酸酶。
酶标反应产生的信号可以使用荧光、发光或显色来检测。
9. 分析：通过分析免疫印迹结果，可以确定目标蛋白质的存在与表达水平。
常用的分析方法有荧光成像、蛋白质印迹仪和密度分析软件。
免疫印迹法
原理
经过PAGE分离的蛋白质样品， 转移到固相载体（例如硝酸纤 维素薄膜）上，固相载体以非 共价键形式吸附蛋白质，且能 保持电泳分离的多肽类型及其 生物学活性不变。以固相载体 上的蛋白质或多肽作为抗原， 与对应的抗体起免疫反应，再 与酶或同位素标记的第二抗体 起反应，经过底物显色或放射 自显影以检测电泳分离的特异 性目的基因表达的蛋白成分。
免疫印迹法
商宇伟
定义
免疫印迹法（immunobiotting test，IBT） 也被称作酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoeletrotransfer blot，EITB），是 20世纪70年代末，发展起来的一门蛋白质多参 数检测技术。由于其与早先建立的核酸印迹法 southern blot相类似，所以习惯上又叫westernblot。
电泳2小时
转印结果的检查：电泳结束后，用丽春红对NC膜预染下，观察转移 效果。随后用水冲洗掉丽春红的颜色，进行封闭。
3、酶免疫定位
封闭：将上述得到的NC膜，用封闭液在摇床上过夜封闭。为了防止免
疫试剂的非特异性吸附。
清洗：封闭时间达到后用PBST清洗NC膜3次左右，每次约15分钟。 一抗孵育：清洗好后，加入一抗标记2小时左右。一抗一般选择源于兔
特点：HRP能激发化学发光显色底物发光，通过对X线胶片的曝 光，显影定影从而达到显色的目的。灵敏性很高且比较安全。
发光底物的配制： 2ml的A液+2ml的B液+6ml的SW。 摇床上与NC膜避光孵育5分钟。
总结
SDS-PAGE电泳分离蛋白 转膜
过夜封闭 PBST洗3次，每次15分钟 一抗孵育2小时 PBST洗3次，每次15分钟 酶标二抗孵育1小时 PBST洗3次，每次15分钟 DAB显色底物显色法显色 ECL显色法
免疫印迹实验报告
免疫印迹实验报告一、实验目的免疫印迹（Western blotting）是一种广泛应用于分子生物学、生物化学和免疫学等领域的技术，用于检测和定量特定蛋白质在样品中的表达水平。
本次实验的目的是通过免疫印迹技术检测目标蛋白在不同样品中的表达情况，以验证实验假设并为进一步的研究提供数据支持。
二、实验原理免疫印迹实验基于抗原抗体特异性结合的原理。
首先，通过十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDSPAGE）将蛋白质样品按照分子量大小分离。
然后，将分离后的蛋白质从凝胶转移到固相支持物（如硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜）上。
接着，膜与特异性抗体进行孵育，使抗体与目标蛋白结合。
最后，通过检测抗体的存在来确定目标蛋白的表达水平。
检测抗体的方法通常包括使用酶标记的二抗结合底物产生显色或发光信号，或者使用荧光标记的二抗通过荧光检测系统进行检测。
三、实验材料和设备1、材料细胞裂解液蛋白酶抑制剂蛋白标准品一抗（特异性针对目标蛋白）二抗（酶标记或荧光标记）化学发光底物（或荧光检测试剂）预染蛋白分子量标准硝酸纤维素膜或聚偏二氟乙烯膜电泳缓冲液转膜缓冲液封闭液（如脱脂奶粉或牛血清白蛋白溶液）洗涤液（含吐温 20 的磷酸盐缓冲液）2、设备电泳仪和电泳槽转膜装置摇床冰箱酶标仪（或荧光检测仪器）四、实验步骤1、蛋白样品制备收集细胞或组织样本，加入适量的细胞裂解液和蛋白酶抑制剂，在冰上裂解一定时间。
离心收集上清液，即为蛋白样品。
2、 SDSPAGE 电泳制备 SDSPAGE 凝胶，根据目标蛋白的分子量选择合适的分离胶浓度。
将蛋白样品与上样缓冲液混合，煮沸变性。
上样，进行电泳，直至溴酚蓝指示剂到达凝胶底部。
3、转膜电泳结束后，将凝胶浸泡在转膜缓冲液中平衡。
按照“三明治”结构组装转膜装置，依次为阴极、滤纸、凝胶、膜、滤纸、阳极。
在冰浴或冷室中进行转膜，根据蛋白分子量和转膜条件确定转膜时间。
4、封闭转膜结束后，将膜放入封闭液中，在摇床上孵育一定时间，以封闭非特异性结合位点。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹法
电泳2小时
转印结果的检查：电泳结束后，用丽春红对NC膜预染下，观察转移 效果。随后用水冲洗掉丽春红的颜色，进行封闭。
3、酶免疫定位
封闭：将上述得到的NC膜，用封闭液在摇床上过夜封闭。为了防止免
疫试剂的非特异性吸附。
清洗：封闭时间达到后用PBST清洗NC膜3次左右，每次约15分钟。 一抗孵育：清洗好后，加入一抗标记2小时左右。一抗一般选择源于兔
色法中最常用的底物，可以和HRP作用形
成褐色不溶性产物。反应速度快，灵敏性 较高，特异性好。但是显色后光照数小时
会褪色不易保存。
DAB显色液的配方： 9ml的0.01mol/L Tris-Cl(pH7.6) 1ml的0.3%的CoCl2 DAB少许 10ul的H2O2
2.化学发光显色法(ECL法)
免疫印迹法
商宇伟
定义
免疫印迹法（immunobiotting test，IBT） 也被称作酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoeletrotransfer blot，EITB），是 20世纪70年代末，发展起来的一门蛋白质多参 数检测技术。由于其与早先建立的核酸印迹法 southern blot相类似，所以习惯上又叫westernblot。
特点：HRP能激发化学发光显色底物发光，通过对X线胶片的曝 光，显影定影从而达到显色的目的。灵敏性很高且比较安全。
发光底物的配制： 2ml的A液+2ml的B液+6ml的SW。 摇床上与NC膜避光孵育5分钟。
总结
SDS-PAGE电泳分离蛋白 转膜
过夜封闭 PBST洗3次，每次15分钟 一抗孵育2小时 PBST洗3次，每次15分钟 酶标二抗孵育1小时 PBST洗3次，每次15分钟 DAB显色底物显色法显色 ECL显色法
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
Western印迹法
Western印迹法Western 印迹法Western印迹法又称为免疫印迹（immunoblot）。
是用特异性抗体鉴定已被分离并转移到一种膜上的蛋白质混合物中的特殊抗原的方法。
即针对特定氨基酸序列的特异性试剂作为探针检测的方法。
Western Blot 采用聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。
经过PAGE电泳分离的蛋白质样品，转移到固相载体上（固相载体以非共价键吸附蛋白质，并能保持其类型和生物学活性的不变）。
二、基本原理当蛋白质经高分辨率的SDS-PAGE电泳后，可被分离成许多不同的蛋白质区带，由于蛋白质的各个组分被固定于凝胶的网状结构中，可以将电泳后的蛋白带经电转移技术，转移到固相的硝酸纤维素膜上，再和特异性的抗体结合，经直接或间接抗原-抗体反应显示特异性的阳性条带。
Western印迹法分三个阶段进行第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。
蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体（一抗）和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色，阳性反应的条带清晰可辨。
三、操作步骤一）配制SDS-PAG 灌胶:分离胶浓缩胶二）上样蛋白质样品的制备直接用电泳加样缓冲液裂解细胞制备细胞蛋白质提取液三）SDS-PAGESDS-蛋白质复合物的电泳迁移率只与其分子量有关。
在一定条件下，迁移率与分子量呈对数线性关系。
丙烯酰胺凝胶对蛋白质的分辨范围丙烯酰胺（%[w/v]）分离范围（kDa）15 15~4512.5 15~6010 18~757.5 30~1205 60~212（四）蛋白质的电转移打开蛋白质转移槽的胶板，依次放入：海绵、两张滤纸、凝胶、硝酸纤维素膜、再两张滤纸、海绵（以上所有的材料都需缓冲液浸湿，凝胶也必须保持湿润），合上转移槽的胶板，放入转移槽中，凝胶在负极一侧，倒入转移缓冲液，电泳。
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)
免疫印迹技术(Immunoblotting technique)免疫印迹技术又称蛋白质印迹(Western blotting)是一种借助抗原鉴定特异性抗体的有效方法，该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
本实验以检测可提取性核抗原(ENA)抗体为例。
【实验原理】先将ENA混合抗原经SDS-PAGE电泳，使各种抗原成分根据分子量不同区分开来，再通过电转印将各种抗原成分转印到硝酸纤维素薄膜上，血清中抗ENA抗体与硝酸纤维素薄膜上的ENA抗原成分结合，再与碱性磷酸酶标记的抗人IgG抗体结合，形成抗原抗体酶标抗体复合物，洗涤后加入底物显色，根据有无显色带的出现判断抗ENA抗体的有无，显色带的位置判断抗ENA抗体的类型。
【主要试剂与器材】1.ENA多肽抗体谱检测试剂盒包括印有ENA的硝酸纤维素薄膜、碱性磷酸酶记标的抗人IgG抗体、显色液(BCIP/NBT)、浓缩洗涤液和样品缓冲液、终止液、ENA多肽抗体标准带图谱等，有商品供应。
2.待检血清和阳性质控血清3.小型摇床、恒温箱、反应槽、吸管、微量移液器、滤纸等。
【操作方法】1.将浓缩洗涤液、样品稀释液按说明书用蒸馏水进行稀释。
2.抗原条放入反应槽中，每个槽内加入样品稀释液1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体。
3.用样品稀释液将血清1∶10稀释，吸取1.5ml稀释血清加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
4.弃去槽内液体，每个槽内加入1∶10稀释的洗涤液 1.5ml浸泡5min后，弃去槽内液体，用吸水纸吸干。
5.吸取1.5ml用样品稀释液1∶10稀释AP标记的抗人 IgG，加入槽内，置小型摇床上孵育30min。
6. 同4洗涤。
7.每个槽内加入底物液1.5ml，置小型摇床上孵育 20min后，弃去槽内液体，用自来水洗净，加入终止液。
8.与标准显色带比较，判断结果。
【结果判断】将印迹膜上出现的显色区带与标准图谱比较，可判断哪种ENA抗体阳性。
蛋白质印迹技术
蛋白质印迹技术蛋白质印迹（Western blotting）是一种检测固定在固相基质上的蛋白质的免疫化学办法，又称免疫印迹（immunoblotting )。
1979年，Towbin等将分析DNA的Southern blotting技术扩展到蛋白质的讨论领域，并且和特异、敏捷的免疫分析技术相结合，称之为“Western blotting"（蛋白质印迹）。
免疫印迹可分为两个步骤：将蛋白质由凝胶转移至固相基质上；特异性抗体检测。
试验原理蛋白质印迹法是将蛋白质混合样品经SDS-PAGE后，分别为不同的条带，其中含有能与特异性抗体相结合的待检测的蛋白质（抗原蛋白），将凝胶上的蛋白质以电转印的方式，转印至固相支持物（如硝酸纤维素膜，NC膜）上，再用特异抗体作为探针对靶蛋白举行检测的办法。
因为该办法结合了PAGE的高辨别率和固相免疫反应的高特异性等多种优点，可检测到低至1-5 ng的中等分子量大小的靶蛋白。
仪器和材料电转移装置（电源）；摇床；暗匣；转印夹；浅盘（30cm×15cm×3cm)；玻璃棒；杂交袋或杂交盒；胶片；保鲜膜；滤纸；0. 22μm孔径的硝酸纤维素膜。
试剂 (1) Running Buffer (Tris-甘氨酸电泳缓冲液，1×2500ml) ; 25 mmol/L Tris 7. 55g 250mmol/L甘氨酸 47. 0g 10%SDS 25m1 (2) Transfer Buffer ( Tris-甘氨酸电转膜缓冲液，1× 2500m1，pH＝8.3）：48 mmol/L Tris 14. 50g 39mmol/L 甘氨酸 7. 25g 10% SDS 9. 25ml 20％甲醇 500m1 (3) TTBS缓冲液（pH 7.5，2 ×2500ml)： 20 mmol/L Tris 12. l l g 0. 5 M NaCl 146. 1 g 0.05%Tween 20 2. 5 ml (4) Stripping Buffer（pH2. 0，1000m1)：甘氨酸 1. 8768 SDS 10. 0g (5) 10％牛奶封闭液：称取10. 0g脱脂奶粉，溶于80m1 TTBS（pH7.5 )中，搅拌彻低溶解，后加入TTBS定容至100m1，再加入10μl Thimerosal混匀。
生物素化免疫印迹法的原理
生物素化免疫印迹法的原理生物素化免疫印迹法（Biotinylated Immunoblotting）是一种常用的蛋白质检测技术，广泛应用于生物医学研究和临床诊断中。
该方法利用生物素（Biotin）标记的抗体与特定蛋白质结合，再通过酶标记的亲生素（Streptavidin）结合生物素，通过酶催化反应使目标蛋白质产生可视化的信号。
本文将详细介绍生物素化免疫印迹法的原理及其应用。
生物素化免疫印迹法的原理基于特异性抗原与抗体的结合反应。
首先，待检样品经过蛋白质分离技术（如SDS-PAGE）将蛋白质分离并定位在聚丙烯酰胺凝胶上。
然后，将聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质转移到固体膜上，例如聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
这个过程称为电转印（Electrotransfer）。
接下来，将转印膜中的非特异性结合位点（例如未被蛋白质占据的空白位点）阻断，以防止后续步骤中的非特异性结合。
通常使用的阻断剂有非脂型乳清蛋白（非脂型BSA）或牛血清白蛋白（BSA）。
这样可以减少背景信号，提高检测的特异性。
然后，在转印膜上加入经生物素标记的一抗抗体，这种抗体能与待检测蛋白特异性结合。
生物素是一种小分子化合物，其分子量较小，与蛋白质结合不会影响其性质。
生物素标记的抗体与待检测蛋白特异性结合后，形成抗原-抗体复合物。
为了可视化待检测蛋白，将转印膜与酶标记的亲生素（通常是辣根过氧化物酶-HRP）结合。
亲生素是一种能与生物素非常紧密结合的蛋白质。
亲生素与生物素结合后，形成稳定的复合物。
然后，在转印膜上加入适当的底物，如4-氨基联苯二酚（4-chloro-1-naphthol），使HRP催化底物产生可视化的颜色反应。
产生的颜色与待检测蛋白的含量成正比。
生物素化免疫印迹法具有许多优点。
首先，该方法对待检测蛋白的特异性非常高，可以检测到非常低浓度的蛋白。
其次，由于生物素与亲生素结合稳定，可以进行长时间的信号增强，从而提高检测的灵敏度。
此外，生物素化免疫印迹法还可以同时检测多个蛋白，通过使用不同生物素标记的抗体，可以在同一转印膜上检测多个目标蛋白。
免疫印迹法的实验技术
印迹法（blotting）是指将样品转移到固相载体 上，而后利用相应的探测反应来检测样品的一种 方法。
Western Blot 印迹方法，是检测蛋白质混合 液体中某种特定目的蛋白的定性方法，也可作为 确定同一种蛋白质在不同细胞或者同一种细胞不 同条件下的相对含量的半定量方法。
实验主要内容：
注意事项
玻璃板要清洁,对齐卡严，防止漏胶。 丙烯酰胺和双丙烯酰胺在聚合前具有很强的神经毒性并容 易吸附于皮肤，其作用具有累积性，故称量或配胶时应戴 手套及口罩 . 过硫酸铵会缓慢分解，应隔周新鲜配制. 溶液中一旦加入TEMED，应立即混匀并快速灌注入玻璃 夹槽中 . 浓缩胶缓冲液(PH为6.8)、分离胶缓冲液(PH8.8)， PH值要准确。 胶灌入前要充分混匀，灌胶要缓慢,避免有气泡的产生. 为保持电泳的平衡，在无样品孔中也应加入适量的电泳上 样缓冲液. 正确连接电泳连线（负极在上，正极在下）以保证蛋白由 上向下方向电泳。
根据待测样品的蛋白质分子量选择分离胶和浓缩胶的浓度. （一般浓缩胶为5%，分离胶根据所测蛋白分子量定）
凝胶浓度（％）
Hale Waihona Puke 线性分离范围（KD)15 10
12-43 16-68
7.5
5.0
36-94
57-212
作用
浓缩胶：当样品上样并接通两极间电流后(电泳槽 的上方为负极，下方为正极)，在凝胶中形成移动 界面并带动凝胶中所含SDS负电荷的多肽复合物 向正极推进。样品首先通过高度多孔性的浓缩胶， 使样品中所含SDS 多肽复合物在分离胶表面聚 集成一条很薄的区带（或称积层）（0.51cm）。
凝胶电泳
样品的印迹
免疫学检测
实验步骤 提取细胞或组织蛋白→测定蛋白
免疫印迹
9. 上样
10. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）
11. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）
12. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色
13. Westernblot 试剂盒显色
14. 分析比较记录
一.试剂选择
1. 膜的选择:主要采用 NC膜和PVDF膜,其比较如下:
2.膜的孔径: 0.45um适用一般蛋白质. 0.2um适用小分子蛋白质.
3.蛋白质染色
Ponceau-S Red丽春红 5ug 无
快绿Fc 5ug 无
Sypro Rose 1-2ng 无
氨基黑10B 1ug 有
考马斯亮兰R-250 500ng 有
印度墨 100ng 有
胶体金 4ng 有
试剂：
1、蛋白提取试剂（RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA）， PMSF（每克组织30ml，10 mg/ml PMSF））
2、NC膜或PVDF膜
3、丽春红，考马斯亮蓝
4、Western Blot试剂盒
实验步骤
1. 取细胞。
2. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA）， PMSF（每克组织30ml，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃
免疫印迹(immunoblotting)又称蛋白质印迹(Western blotting)，是一种借助特异性抗体鉴定抗原的有效方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。将含有目标蛋白(抗原)的样品首先用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)或非变性电泳(Native-PAGE)等分离后，通过转移电泳原位转印至硝酸纤维素膜或其它膜的表面，然后将膜表面的蛋白质再用抗原抗体反应进行特异性检测。例如，将经SDS-PAGE分离的蛋白质带转移到膜上后，膜用封闭液处理，然后与第一抗体反应，膜经漂洗后再与偶有辣根过氧化物酶(HRP)或碱性磷酸(酯)酶(AP)的第二抗体反应，加人生色底物反应之后，即可显示出目标蛋白的位置。由于免疫印迹具有SDS-PAGE的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，其优点是方法简便、标本可长期保存、结果便于比较，故广泛应用于分子生物学等领域，成为免疫学、微生物学及其他生命科学常用的一种研究方法。
免疫印迹技术原理
免疫印迹技术原理免疫印迹技术（Western Blotting，简称WB）是一种确定蛋白质分子的稳定性、位置和浓度的重要方法。
它是通过电泳将蛋白质分子按照大小分离，然后通过转印将其从凝胶中转移到薄膜上，最后使用特定的抗体检测蛋白质，从而得到蛋白质信息的技术。
WB技术已广泛应用于生物医学研究、药物筛选和临床诊断等领域，因其应用广泛、结果可靠而备受青睐。
一、电泳分离蛋白质WB技术首先需要将样品中的蛋白质分子通过电泳进行分离。
首先，将蛋白质样品和电泳缓冲液混合，然后用蛋白质沉淀浓缩技术去除一些干扰物质。
其次，将样品与负载缓冲液混合，然后将混合液加载到凝胶孔中。
待凝胶凝固后，将凝胶浸入电泳缓冲液中，通过电流将蛋白质分子按照大小电泳运动，最终形成不同位置的带状图。
通常使用SDS-PAGE技术进行分离。
二、蛋白质转印WB技术的转印步骤是将蛋白质从凝胶上转移到膜上，以便后续用抗体进行检测。
通常使用的转印方法有湿式转印和半干式转印。
在湿式转印中，将凝胶、薄膜和转印缓冲液放置在转印装置中，然后通过吸附作用将蛋白质从凝胶中转移到膜上。
在半干式转印中，凝胶和薄膜之间放置有滤纸和海绵，通过蛋白质的电泳迁移将蛋白质转移到膜上。
转印完成后，膜通常应该预处理一下才能进行抗体检测。
三、抗体检测抗体在WB技术中扮演着重要的角色。
它们能够识别目标蛋白质，并通过一系列的反应来产生信号。
在抗体检测中，首先将膜与阻断缓冲液一起孵化，以防止非特异性的背景信号出现。
之后，将与目标蛋白质相关的抗体与膜孵化，目标蛋白质与抗体结合。
接下来，用与结合抗体相关的二次抗体对膜进行孵化。
二次抗体通常用于检测与抗体结合的目标蛋白质。
最后，膜与特定物质反应后可形成目标蛋白质的信号，通常使用化学发光或染色来检测目标蛋白质。
总结：免疫印迹技术是一种广泛应用于生物医学研究、药物筛选和临床诊断等领域的技术，其原理主要包括电泳分离蛋白质、蛋白质转印和抗体检测等步骤。
通过这种技术，我们可以准确地检测到目标蛋白质，进而推进生物医学领域的理解、研究和应用。
免疫印迹法
免疫印迹法免疫印迹法（immunobiotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southern早先建立的检测核酸的印迹方法 Southern blot 相类似，亦被称为Western-blot。
免疫印迹法分三个阶段进行。
第一阶段为SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）：抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移：将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位：将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3’-二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加入的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
在艾滋病病毒感染中此法作为确诊试验。
抗原经电泳转移在硝酸纤维素膜上后，将膜切成小条，配合酶标抗体及显色底物制成的试剂盒，可方便地在实验室中供检测用。
根据出现显色线条的位置可判断有无针对病毒的特异性抗体。
一． SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）基本原理是聚丙烯酰胺凝胶是由丙烯酰胺单体acr聚合成长链并通过双功能化合物甲叉双丙烯酰胺Bis交联而成的三维网状结构凝胶。
聚丙烯酰胺凝胶的机械性、弹性、透明度、粘着度取决于凝胶的总浓度，总浓度越大，平均孔径越小，机械强度越强。
免疫印迹法的实验技术
免疫印迹试验名词解释
免疫印迹试验名词解释
免疫印迹试验（immunoblotting）是一种常用的实验技术，用于检测和分离蛋白质样本中特定抗原的存在。
该技术结合了蛋白质电泳分离和免疫反应原理。
免疫印迹试验的步骤如下：
1.样本处理：将待测蛋白质样本经过电泳分离，通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
2.转印：将分离的蛋白质从凝胶转移到固定在膜上的靶蛋白（通常是聚偏二氟乙烯膜）。
3.阻断：用一种阻止非特异性结合的蛋白质（例如乳清蛋白或牛血清白蛋白）封闭膜上的未被转移的位点，以减少非特异性结合。
4.抗体结合：将特异性抗体添加到膜上，使其与目标抗原特异性结合。
5.洗涤：洗去未结合的抗体，以减少非特异性结合。
6.检测：添加适当的检测试剂，例如酶标记的二抗或荧光标记的二抗，以与特异性抗体结合的抗原发生化学或光学反应。
7.显色：通过添加染色剂，例如酶底物或荧光染料，可使目标抗原在膜上可视化。
通过免疫印迹试验，可以确定样本中特定蛋白质的存在与否，确定蛋白质的分子量，并研究蛋白质的表达水平和亚细胞定位等信息。
这项技术在生物医学研究、临床诊断和药物开发等领域广泛应用。
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免疫印迹(5.4)
18兆去离子水调整总体积
40ml
每10ml RIPA裂解液放入0.1ml蛋白酶抑制剂cocktail. -20℃分装保存，临用前无需加入PMSF。
三、蛋白样品的变性
2×SDS-PAGE上样缓冲液：
① 100mM Tris-HCl(pH6.8) ② 200mM DTT ③ 4%SDS ④ 0.2%溴酚兰 ⑤ 20%甘油 ⑥ ddH2O
1M Tris-HCl (pH6.8) 10 ml
1M DTT
SDS 甘油 溴酚蓝 总体积
20 ml
4g 20 ml 0.2 g 100ml
1．尽可能采用简单方法进行样品处理，以避免蛋白丢 失。
2．细胞和组织样品的制备应尽可能减少蛋白的降解， 低温和蛋白酶抑制剂可以减少蛋白的降解，蛋白酶抑制剂 的种类很多，要根据具体情况具体选择。 3．样品裂解液应该新鲜制备，并且分装冻存于-80℃。 切勿反复冻融已制备好的样品。 目的：要获得高丰度、高品质的蛋白质，以满足后续 实验的需求
ddH2O 样品
BCA(ML )
0 10
2
50 10
2
75
10 2
87.5
10 2
93.5
10 2
96.8
10 2
Bradford法敏感度高，并且与一系列干扰Lowry、BCA法的
还原剂（如DTT、巯基乙醇）相容。
与Bradford法相比，BCA法的显著优点是不受常用浓度去
垢剂的影响。
与Lowry法相比，BCA法操作更简单且稳定性更好，几乎没
一免疫印迹法
一。
免疫印迹法免疫印迹法（immunoblotting test，IBT）亦称酶联免疫电转移印斑法（enzyme linked immunoelectrotransfer blot，EITB），因与Southen早先建立的检测核酸的印迹方法Southen blot相类似，亦被称为Western blot。
免疫印迹（western blotting）是在蛋白质电泳分离和抗原抗体检测的基础上发展起来一项检测蛋白质的技术。
它将SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳的高分辨力与抗原抗体反应的特异性相结合。
典型的印迹实验包括三个步骤①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性，非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
图1 免疫印迹法原理示意图第一阶段为SDS—聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带阴电荷，在聚丙烯酰膪凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
第二阶段为电转移。
将在凝胶中已经分离的条带转移至硝酸纤维素膜上，选用低电压（100V）和大电流（1～2A），通电45min 转移即可完成。
此阶段分离的蛋白质条带肉眼仍不可见。
第三阶段为酶免疫定位。
将印有蛋白质条带的硝酸纤维素膜（相当于包被了抗原的固相载体）依次与特异性抗体和酶标第二抗体作用后，加入能形成不溶性显色物的酶反应底物，使区带染色。
常用的HRP底物为3，3，—二氨基联苯胺（呈棕色）和4-氯-1-萘酚（呈蓝紫色）。
阳性反应的条带清晰可辨，并可根据SDS-PAGE时加人的分子量标准，确定各组分的分子量。
本法综合了SDS-PAGE的高分辨力和ELISA法的高特异性和敏感性，是一个有效的分析手段，不仅广泛应用于分析抗原组分及其免疫活性，并可用于疾病的诊断。
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免疫印迹（immunoblotting）
免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：
1.蛋白质抽提
a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：
按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)
将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育
a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：
化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
7.数据分析：
目的蛋白的灰度值除以内参GAPDF的灰度值以校正误差，所得结果代表某样品的目的蛋白相对含量。
8.实验报告，包括详细的实验方法及免疫印迹实验结果的相关图表。