完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤
Westernblot实验步骤及注意事项
Westernblot实验步骤及注意事项adminWesternblot 实验步骤1. 组织块称重2. 利用液氮、研钵粉碎组织块3. 加入RIPA缓冲液（每克组织3 ml RIPA），PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），利用Polytron进一步匀浆（15,000转/分*1分钟）维持4℃4. 加入PMSF（每克组织30μl，10 mg/ml PMSF），冰上孵育30分钟5. 移入离心管4℃约20,000 g（约15,000转）15分钟6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度8. 取相同质量的细胞裂解液（体积*蛋白质浓度），并加等体积的2×电泳加样缓冲液9. 沸水浴中3分钟10. 上样11. 电泳（浓缩胶20mA，分离胶35mA）12. 电转膜仪转膜（100mA 40分钟）13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色14. Westernblot 试剂盒显色15. 分析比较记录western blot的实验步骤及注意事项的资料1. 把聚丙烯酰胺凝胶中的蛋白质电泳转移到硝酸纤维膜上。
1）转移缓冲液洗涤凝胶和硝酸纤维素膜，将硝酸纤维素膜铺在凝胶上，用5ml移液管在凝胶上来回滚动去除所有的气泡。
2）在凝胶/滤膜外再包一张3mm滤纸（预先用转移缓冲液浸湿），将凝胶夹在中间，保持湿润和没有气泡。
3）将此滤纸/凝胶/薄膜滤纸按照厂家建议方法放入电泳装置中，凝胶面向阴极。
4）将上述装置放入缓冲液槽中，并灌满转移缓冲液以淹没凝胶。
5）按照厂家所示接通电源开始电泳转移。
6）转移结束后，取出薄膜和凝胶，弃去凝胶。
2. 将薄膜漂在氨基黑中快速染色，直至分子量标准显现时取出，记录下标准位置。
3. 用100ml水洗涤纤维素膜，必要时可用脱色缓冲液。
4. 膜置印迹缓冲液中于37℃保温1小时。
5. 室温下，用PBS-Tween缓冲液洗涤薄膜。
6. 用封口机将薄膜封入塑料袋中，尽可能不留空气。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
westernblot法
Western blot，也称为蛋白质印迹或免疫印迹，是一种常用的生物化学技术，用于分析样品中特定蛋白质的存在、细胞中特异蛋白质的半定量分析以及蛋白质分子的相互作用研究等。
下面是Western blot的基本步骤和注意事项：一、实验步骤蛋白样品制备：从细胞或组织中提取蛋白质样品，常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
蛋白定量：使用BCA蛋白浓度测定法等对蛋白质样品进行定量，以便后续的Western blot分析。
凝胶电泳：将蛋白质样品在聚丙烯酰胺凝胶中电泳分离，根据蛋白质的大小和电荷进行分离。
转膜：将电泳分离后的蛋白质样品转移到硝酸纤维素膜上，以便进行后续的免疫检测。
免疫检测：使用特异性抗体对转移后的蛋白质样品进行免疫检测，抗体与目标蛋白质结合后，通过显色反应呈现阳性结果。
数据分析：对免疫检测结果进行定量和定性分析，如条带大小、灰度值等。
二、注意事项实验前要充分了解实验原理和操作流程，确保实验的正确性和可行性。
蛋白样品制备过程中要保证细胞或组织充分裂解和匀浆，以获得更纯的蛋白质样品。
在进行Western blot分析前，要对蛋白质样品进行定量，以保证实验结果的准确性。
在转膜过程中，要选择合适的转移缓冲液和转移时间，以保证蛋白质样品的完整转移。
在免疫检测过程中，要选择合适的抗体和显色试剂，以保证免疫检测结果的特异性。
在数据分析过程中，要选择合适的分析方法和软件，以保证数据分析的准确性和可靠性。
总之，Western blot是一种常用的生物化学技术，在蛋白质分析领域具有广泛的应用价值。
在进行Western blot实验时，要严格遵守实验步骤和注意事项，以保证实验结果的准确性和可靠性。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
WesternBlot蛋白免疫印迹法
3 Western blot3.1试剂配制1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：丙烯酰胺（Acr）, 29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis）, 1g,去离子水溶解，37℃ 水浴助溶，定容至100mL。
0.45M m滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。
2）10%十二烷基硫酸钠（5口5）：SDS，10g；H2O，80mL。
68℃加热溶解，浓HCl 调pH 至7.2，定容至100mL，室温保存。
3）10%过硫酸铵（AP）：AP，1g；H2O，10mL。
避光，4℃保存。
（4℃2 周）4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：Tris，18.17g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至8.8，定容至100mL，4℃保存。
5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：Tris，12.11g；H2O 80mL。
用浓HCl 调pH 至 6.8，定容至100mL，4℃保存。
6）电泳缓冲液（10X）：甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O, 800mL。
调节pH 至8.3, 定容至1L，4℃保存（用时稀释为1义）。
7）5X SDS-PAGEloadingBuffer （5mL）：1MTris-HCl（pH6.8），1.25mL；SDS，0.5g；澳酚蓝（BPB），25mg；甘油，2.5mL；加去离子水定容至5mL。
充分混匀，分装成500M L/份，室温保存。
使用前每份加入25M L p -巯基乙醇（2-ME），加入2-ME的loading buffer可在室温下保存一个月左右。
8）考马斯亮蓝染色固定液：40%双蒸水，10%醋酸,50%甲醇，室温保存9）考马斯亮蓝染色液：考马斯亮蓝R-250，250mg；甲醇，45ml；冰醋酸，10ml；H2O，定容至100ml。
室温保存。
10）考马斯亮蓝染色脱色液：醋酸，100ml；乙醇，50ml；dH2O 850ml，充分混合，室温保存11）膜转移缓冲液：甘氨酸，2.9g；Tris，5.8g；SDS，0.37g；力口H2O 600mL 充分溶解，加200mL 甲醇，混匀，定容至1匕，室温保存。
western blot 免疫印迹方法
Western blot一、S DS-聚丙烯凝胶电泳二、转膜1.准备好转膜用的物品：转膜夹、剪刀、镊子、纤维素膜、滤纸，盘子，盒子，玻璃棒，甲醇，转膜液（不加SDS，有气泡）2.将滤纸侵泡于盘中的转膜液，赶走气泡，将膜剪去一角做标记，侵泡于甲醇中，根据黑胶白膜原则叠好，保证无气泡后夹紧放入电泳槽中，黑对黑原则放入电泳槽，槽内放入冰袋，盖好电泳槽盖。
3.于冰上或者冰箱中低温转膜，恒流300mA，50min三、封闭（正面朝上）TBS洗5min配5%脱脂奶粉-TBS摇几分钟4℃过夜。
四、加一抗，倒去封闭液，用TBS冲洗一次，TBST 5min×3次（大概10ml），加入用2.5%脱脂奶粉-TBST稀释的一抗（1：10），室温摇2h五、加二抗：倒去一抗或回收（TBST,5mi n×3次）用2.5%脱脂奶粉-TBST按2000:1稀释二抗（鼠抗人IgE抗体），室温摇2h（有的已经与HRP结合的，如若没有，后面加HRP），TBST洗5mi n×3次，然后TBS洗5mi n×3。
六、化学发光，显影，定影（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析(Western Blot)是一种常用的蛋白质分析方法。
它的基本流程包括:
1. 样品制备:提取并定量蛋白质样本。
常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
2. 电泳分离蛋白:使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。
根据分子量的不同,蛋白质会在凝胶上分离成不同的条带。
3. 转膜:将凝胶中的蛋白转移到NC膜或PVDF膜上。
4. 滤膜:使用5%脱脂奶粉或BSA在室温封闭1小时,以阻断膜胶的非特异性结合位点。
5. 一抗反应:加入特异性的一抗,孵育过夜。
一抗与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗反应:洗涤后加入连接HRP的二抗,孵育1-2小时。
二抗与一抗结合。
7. ECL显色:滴加显影液,HRP催化发光底物氧化产生发光信号。
8. 凝胶成像:曝光、扫描和记录结果。
目标蛋白会出现特异性的条带。
9. 数据分析:通过条带的位置和强度分析目标蛋白的相对分子量和表达量。
以上是免疫印迹分析的基本流程。
根据实验目的,可以选择不同的样品制备方法、凝胶系统、转膜系统等,从而实现对蛋白质的分离、定量和功能分析。
免疫印迹操作步骤
免疫印迹操作步骤western blot 超详细步骤一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP 管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验
蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。
【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。
其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。
4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。
这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。
5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。
此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。
做Weston blot 操作步骤
免疫印迹（Western blot）1.蛋白样品的制备（尽量冰上操作）1.1提取蛋白：EP管和金属浴架子预冷，按说明书在蛋白酶抑制剂中加裂解液RIPA，将细胞洗液用吸纸吸干净，否则会影响蛋白浓度测定（需要确认洗液？和操作顺序？）向各组样品中添加等量的裂解液RIPA，冰上放置10分钟超声，对于200ul的样品，超声25-30s，振幅35%，上中下液层各10s离心，12000rpm，10min，4度取上清，即细胞总蛋白1.2 蛋白定量（测蛋白浓度）BCA(1)配溶液：将BCA溶液的A液与B液（50:1）配成混合液，(2)把BSA稀释成0.5mg/ml，0.4mg/ml，0.3mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml,Tips：每个浓度3个孔*20ul，在第一排的第一个孔里配80ul，分别取20ul加到下面的3个孔，弃掉第一个孔。
(3)对于待测样品，2ul蛋白样品（上清）+18ul PBS，每个样3个孔做重复，可根据蛋白样品的体积调整稀释比例(4)加显色液200ul/孔（避光操作）(5)把96孔板放入37℃恒温箱30min；(6)用酶标仪检测蛋白浓度：562nm，制作标准浓度曲线（插入散点图，求线性函数），计算各样品蛋白浓度，求平均值，用裂解液调所有蛋白样品浓度一致（在Excel中计算所有）(7)加SDS（SDS容易析出，在液态时添加），用蛋白样品将SDS（5X）稀释为SDS（1X），提前打开金属浴100℃10 min(蛋白变性前后要顺离)2.配胶（先安装好制胶夹）步骤：(1)玻璃板清洗干净，底部要齐（可底部涂抹凡士林），否则容易漏胶，短玻璃板在前，与大玻璃板正面相接。
(2)沿大玻璃板加分离胶（12%，10-100kDa，原则：小分子量高浓度），加至玻璃夹上分界线上方一点。
（枪头贴紧大玻璃板一侧，防止产生气泡。
）(3)迅速加入无水乙醇压平。
（等待30 min,倒掉无水乙醇，用吸水纸吸水）。
western blot 免疫印迹实验
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE）
转膜
封闭
加抗体
一抗
检测
可以看到目的条带
二抗上的酶：辣根 过氧化物酶，有其 底物存在时会发光
二抗：被标记了的 抗体（检测）
一个一抗可以和两 个甚至更多的二抗 结合
请老师与同学们指正
滤纸：维持transfer buffer稳定的流动 胶 膜 滤纸
海绵垫：固定整个系统
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE） 转膜 封闭 加抗体 检测
所有蛋白从胶转移到膜上，并 于膜紧密结合，封闭是指还空 白的结合位点，防止后面加的 抗体和膜结合（阻止非特异性 结合）
和蛋白高度亲和
胶
膜
把蛋白转移到膜上进行检测（为于表面更容易与抗体结合） 蛋白带负电，外加一个电场，蛋白从负往正
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE）
转膜 封闭
海绵垫
加抗体检测ຫໍສະໝຸດ 放入电泳槽中：胶靠近负极， 膜靠近正极，在transfer buffer中加入甲醇（甲醇促 使蛋白与SDS分离），使蛋 白更好的与膜结合。
western blot 免疫印迹实验
western blot 免疫印迹实验
目的（功能）：检测和分析蛋白
大分子量
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE）
转膜 封闭
小分子量
加抗体
检测
SDS带负电荷，与蛋白结合使蛋白带负电，从而能在电场作用下迁移
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE） 转膜 封闭 加抗体 检测
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;P MSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20n 封闭缓冲液（TBS/T）1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note:一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
westernblot原理及步骤
westernblot原理及步骤Western blot原理及步骤。
Western blot，又称免疫印迹法，是一种用于检测特定蛋白质的方法。
它能够通过识别蛋白质在膜上的位置来确定其分子量，并且可以检测蛋白质的表达水平。
本文将介绍Western blot的原理及步骤，希望能够帮助读者更好地理解和应用这一技术。
1. 原理。
Western blot的原理基于蛋白质的电泳分离和免疫检测。
首先，待检测的蛋白样品经过SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将分离后的蛋白转移到膜上。
接着，膜上的蛋白与特异性抗体结合，再经过化学发光或染色等方法来检测目标蛋白的存在和表达水平。
2. 步骤。
（1）蛋白样品制备，将待检测的蛋白样品加入SDS-PAGE凝胶电泳缓冲液，使其蛋白质变性并带有负电荷，然后进行蛋白定量。
（2）SDS-PAGE凝胶电泳，将蛋白样品加载到聚丙烯酰胺凝胶中，然后进行电泳分离，使蛋白质按照大小分子量在凝胶中迁移。
（3）蛋白转膜，将分离后的蛋白转移到膜上，通常使用的是聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜。
转膜的方法有湿式转膜和半干式转膜两种。
（4）膜上抗体结合，将蛋白转膜后的膜进行封闭，然后与特异性的一抗抗体结合，再与辅助抗体结合。
（5）信号检测，通过化学发光或染色等方法来检测膜上蛋白的存在和表达水平，如辣根过氧化物酶（HRP）发光、碱性磷酸酶（AP）发光、共价结合荧光素等。
3. 注意事项。
（1）蛋白样品制备要避免蛋白降解和失活，通常在样品中加入蛋白酶抑制剂和磷酸酯酶抑制剂。
（2）SDS-PAGE凝胶电泳要注意电泳条件的选择，如电压、时间和电流密度等。
（3）蛋白转膜后的膜要保持湿润，避免膜的干燥和破裂。
（4）抗体结合和信号检测要根据实验需要选择合适的抗体和检测方法，以确保结果的准确性和可靠性。
4. 应用。
Western blot广泛应用于生物医学研究中，如检测蛋白质的表达水平、鉴定蛋白质、研究蛋白质相互作用等。
Western blot 实验技术
二抗与底物反应显色•辣根过氧 Nhomakorabea物酶法（HRP） •碱性磷酸酶法（AP） •化学发光显色法
朱珊丽老师的结果
1 2 3 4 M Mr 1 2 3 4
Fig 1.SDS-PAGE and Western blot analysis for the CT-MOMP multi-epitopes protein
达到最佳程度时，立即用三蒸水洗涤终止反应
转膜
硝酸纤 维素膜
价格便宜
简单快速封闭非特异性抗体结合
膜的选择
封闭非特异性抗体结合麻烦
尼龙膜 价格昂贵
需要更高的蛋白结合率
（尼龙膜： 480µg/cm2 ；硝酸纤维素膜：80µg/cm2 ）
特殊要求下的选择 目的蛋白与硝酸纤维膜的结合能力弱
需要更大的机械强度
三、免疫染色 1．转移后的NC膜于5%脱脂奶粉中封闭，4℃过夜。 2．TBS洗膜1-2次，10min/次。 3. 加一抗孵育，37 ℃或室温孵育1h。 4. TBS洗3次，10min/次。 5．加HRP标记的抗体，室温1h 。 6．TBS洗3次，10min/次。 7．NC膜再转入DAB显色液中，避光反应，待显色反应
Western Blot基本原理
在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。
Western Blot一般流程
蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺
凝胶电泳
转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色
【器材】
转移电泳仪 ，硝酸纤维素膜，滤纸，剪刀， 手套
【试剂】
1．一抗 2．二抗：HRP标记的IgG 抗体 3．转移buffer：Tris 3.03g，Gly14.4g，甲醇200ml，加
蛋白质免疫印迹实验WesternBlot
摇动，待所检测的蛋白带显色达到最深程度后，将硝 酸纤维素薄膜转入 PBS 溶液中停止显色反应。取出 硝酸纤维素薄膜，自然晾干后拍照保存结果。
四 思考题
• 1. 为什么裁剪的滤纸必须与凝胶大小 完全一致？若不是这样结果会怎样？
• 2. 电转移时为什么都必须带手套小心 操作并除去气泡， 否则结果会怎样？
• 在进色后应时应注意哪些问题？ • 请简述免疫印迹实验的原理，并将之与
免疫学相关概念联系起来。
2024/2/11
2024/2/11
一 实验原理
• 电泳将蛋白质从凝胶转移到固体支持物 上是通过电转移仪器完成的。它是将固 体支持物面对阳极、凝胶面对阴极，二 者结合在一起，然后将外面二侧用 Whatman 3MM滤纸结合，形成“三明治 ”结构，放入电转移仪器上，加入电泳 缓冲液，通上电源后，蛋白质即可从凝 胶上转移到固体支持物上。
2024/2/11
一 实验原理
其定量关系符合以下公式： • Ve=Vo+KV1 • Ve：某一溶质的洗脱体积 • Vo：层析柱的外水体积 • Vi：层析柱的内水体积 • K：某一溶质的分配系数
2024/2/11
二试剂和器材
1．试剂
电转移缓冲液 pH8.3 • 39mM甘氨酸 • 4.8mM Tris碱 • 0.037% SDS • 20% 甲醇 • 混合2.9克甘氨酸，5.8克Tris,0.37克SDS,加200ml甲2源自24/2/11三 操作步骤
蛋白质免疫印迹实验步骤
蛋白质免疫印迹实验步骤1. 引言嘿，大家好！今天我们要聊聊一个非常酷炫的实验——蛋白质免疫印迹实验，或者说西方印迹（Western Blot）。
听名字就很高大上对吧？其实就是用来检测特定蛋白质的。
想象一下，你在寻找一颗珍珠，蛋白质就是那颗珍珠，而免疫印迹就是我们的寻宝地图。
别担心，我会一步一步带你走过这条寻宝之路，让我们开始吧！2. 实验准备2.1 材料准备首先，准备好你的材料，这一步可马虎不得哦。
你需要的东西包括样品（这可以是细胞、组织、甚至是你那杯牛奶），裂解缓冲液、凝胶电泳设备、转膜设备、封闭液、抗体（这个可不能少！），还有洗涤液和显色试剂。
听起来有点像是做饭，其实是很简单的，像是在调配一碗美味的汤。
2.2 样品处理接下来，我们要处理样品。
把你的样品和裂解缓冲液混合，轻轻摇晃，让它们充分融合。
接着，要把这些混合液放在冰上静置一段时间，简直就是在给它们来个冷静期，让蛋白质们沉淀下来。
然后，咱们要通过离心机把细胞的碎片和其他杂质去掉。
小心别把珍珠也扔了，哈哈！3. 电泳分离3.1 凝胶制备哎呀，这时候就要准备凝胶了。
其实凝胶就像是个筛子，能让小的蛋白质通过，而大的蛋白质则被挡住。
我们一般用聚丙烯酰胺凝胶，先把它溶解，放到模具里，等它固化。
固化的时候可以去喝杯茶，顺便欣赏一下这小小的“魔法”。
3.2 电泳运行凝胶固化好后，就可以把样品上胶了。
注意哦，别搞得稀里糊涂，把样品挤到槽里。
然后把凝胶放进电泳池，接上电源，开跑！这就像在赛道上，蛋白质们各显神通，争先恐后。
别着急，等到它们跑到适当的地方，再把它们捞出来。
4. 转膜步骤4.1 转膜跑完电泳，接下来是个关键步骤——转膜。
把凝胶和膜叠在一起，放在转膜装置里，接上电源，让蛋白质们转移到膜上。
就像是把书里的内容复制到你的笔记本上，确保每个细节都不漏掉。
转膜的过程可能需要一段时间，但别担心，慢工出细活嘛！4.2 封闭和抗体孵育转完膜后，我们要进行封闭。
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Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤
发布日期:2008-8-25 热门指数:4360
Western Blot(免疫印迹法)
主要包括以下4个基本步骤：
n 样品制备
n 电泳分离
n 蛋白的膜转移
n 免疫杂交与显色――蛋白检测
溶液和试剂
n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)
n Modified RIPA buffer
Tris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mM
n 1X SDS 样品缓冲液
62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝
n 转移缓冲液
25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)
n 10X Tris缓冲盐(TBS)
准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6
n 脱脂奶粉或BSA
n 甲醇
n TBS/T缓冲液
1X TBS, 0.1% Tween-20
）TBS/T封闭缓冲液（n
1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSA
n 一抗的稀释
1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)
Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率
样品制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
2 plate, 500-1000 μl/瓶) 100 μl /w或75 cm，刮落细胞，转样品缓冲液3．加入1X SDS(6-well plate,
移到Ep管。
注意：冰上操作。
4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。
5．煮沸样品5 minutes。
6．离心12000g, 5 min，取上清。
7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶(10 cm x 10 cm)电泳。
72 flask)裂cells/100 mm dish/150 cm如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 10
解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用Bradford法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。
注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。
电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）
转膜
杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。
应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF膜。
NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被
洗脱下来。
根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。
因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。
通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。
大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。
PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。
但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。
前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。
以下为槽式湿转的操作步骤。
1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。
注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。
如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和3-5秒钟。
3. 装配转移三明治：海绵?3层滤纸?胶?膜?3层滤纸?海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。
切记：胶放于负极面（黑色面）。
4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。
注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
免疫杂交与显色
1．用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。
2．置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。
3．15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
4．加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
6．加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
）。
min/T5 次（3洗TBS/Tml 15 ．7．
8．15 ml TBS洗1次。
9．蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。
注意事项：
1．操作中戴手套，不要用手触膜。
2．PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。
3．如检测小于20kD的蛋白应用0.2μm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。
4．某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。
5．关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.3~3%
BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。
6．如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN in PBS or TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋3白染色。
如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。
Western-blot 实验步骤与ELISA差不多，WB只是在膜上做而已。
注意事项
关键是膜的质量与封闭液。