免疫印迹(WB)实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹步骤
2.6 免疫印迹（Western blot）（1）裂解细胞，提取细胞总蛋白：收集细胞（约2×106），离心洗涤2次，加入100µL RIPA裂解液，置冰上反应30min，4℃12,000r/min离心15min，取上清，蛋白定量后分装，-80℃冻存备用；（2）蛋白定量：Bradford法测定蛋白质含量[35]：①分别在微量离心管中各加入0.5mg/mL BSA 5µL、10µL、15µL及20µL，以0.15mmol/L的NaCl补足至100µL，同时以两管100µL的0.15mmol/L的NaCl作空白对照。
②每管各加入900μL考马斯亮蓝G-250溶液，振荡混匀，室温放置2min。
③用1cm光径的微量比色杯测A595吸光值，取A595吸光值对标准蛋白浓度作图，画出标准曲线，并测量待测样品的A595吸光值，从BSA标准曲线中确定待测样品的浓度。
（3）SDS-PAGE电泳①制胶SDS丙稀酰胺凝胶12％分离胶8％分离胶5％积层胶去离子水 3.3mL 4.6mL 2.7mL1.5mol/L Tris-Cl(pH8.8)2.5mL 2.5mL －1.0mol/L Tris-Cl(pH6.8) －－0.5mL30%丙稀酰胺 4.0mL 2.7mL 0.67mL10% SDS 0.1mL 0.1mL 0.04mL10%APS 0.1mL 0.1mL 0.04mLTEMED 0.004mL 0.004mL 0.004mLTotal 10mL 10mL 4mL其中10%APS和TEMED需等临灌胶之前再加入。
先配制好分离胶，在涡旋混合器上混匀，立刻用吸管将胶缓缓灌入到大小两块玻璃板之间，至胶的最上缘距玻璃板顶端3cm左右。
再用去离子水覆盖在分离胶的上层，封闭空气使胶易于凝固。
室温静置1h左右可看到去离子水和胶之间由于折射率不同而出现一条界限，说明胶已经凝好，可用注射器小心吸出上层的去离子水。
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明一、试剂和溶液转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色二、实验步骤1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗涤3 次；5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行稀释）中，室温混摇2h；9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。
免疫印迹(immunoblotting)
免疫印迹（immunoblotting）免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。
由于免疫印迹具有SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。
免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。
主要实验步骤如下：1.蛋白质抽提a．实验对象为组织样品，取适量（250～500mg）新鲜组织样品或正确保存的组织样品，加1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂），匀浆后抽提总蛋白（或核蛋白）。
b.实验对象为细胞样品，每份样品取1×106～1×107细胞，PBS清洗细胞，去PBS加0.1ml～1ml含蛋白酶抑制剂的总蛋白抽提试剂（或核蛋白抽提试剂）抽提总蛋白（或核蛋白）。
2.蛋白质定量：按KCTMBCA蛋白质定量试剂盒操作说明操作，测定样品浓度。
3.变性聚丙烯酰胺不连续凝胶电泳(SDS-PAGE)将准备好的样品液和生物素标记的蛋白质分子量标准分别上样，标准加进第一个孔中，电泳分离蛋白。
4.蛋白质转移到硝酸纤维膜或PVDF膜按Bio-Rad蛋白转移装置说明组装滤纸凝胶纤维素夹层，30mA恒流条件下，4°C转移过夜。
5.膜的封闭和抗体孵育a．膜在5％BSA溶液中室温孵育1小时以封闭膜上的非特异结合。
b.封闭过的膜加入一级抗体室温孵育1.5小时，抗原抗体结合。
c.加入HRP标记的二级抗体以结合一级抗体及HRP标记的抗生物素抗体以结合分子量标准，室温孵育膜1小时。
加入HRP标记的GAPDH抗体可同时检测GAPDH含量。
6.结果检测：化学发光法检测，膜与化学发光底物孵育，经X胶片曝光显影。
图片扫描保存为电脑文件，并用ImageJ分析软件将图片上每个特异条带灰度值的数字化。
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明
免疫印迹实验操作具体步骤及详细说明免疫印迹（Western Blotting，简称WB）是一种常用的分子生物学技术，主要用于检测和鉴定蛋白质的存在以及其在不同样本中的表达水平。
下面将详细介绍WB实验的具体步骤。
1.细胞裂解和蛋白质提取：首先将待检测的组织样本或细胞样本通过离心将其收集，并添加适量的裂解缓冲液。
使用超声波或机械破碎手段将细胞打乱，使蛋白质溶解在裂解缓冲液中。
再通过离心去除细胞碎片和细胞核等。
2.蛋白质浓度测定：根据实验需要，采用BCA法、Lowry法或Bradford法等方法测定蛋白质浓度，以确定后续实验的载体中待加载的蛋白质量。
3.蛋白质电泳：将相同量的蛋白质样品加入SDS-凝胶槽中，进行电泳。
电泳时蛋白质在凝胶中向阴极迁移，分子量小的蛋白质迁移速度较快，分子量大的较慢。
电泳结束后，将凝胶转移到膜上。
4.膜上瞬时染色：在转移至膜上后，可以使用Ponceau S染色或其他瞬时染色方法，以确认蛋白质在膜上的存在和转移效果。
5.阻断：在膜上的蛋白质检测之前，需要对膜进行阻断处理，以防止非特异性结合。
常用的方法是在膜上加入牛血清蛋白或脱脂奶粉的溶液，进行阻断。
6.一抗反应：加入已稀释好的一抗抗体，与目标蛋白质特异性结合。
一抗的选择要根据待检测蛋白的特异性来确定。
7.清洗：一抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的一抗抗体。
8.二抗反应：9.清洗：二抗反应后，用TBST或PBS等缓冲液进行多次清洗，以去除未结合的二抗抗体。
10.显色和成像：使用显色剂（如ECL）使膜上的蛋白质发生化学发光反应，然后将膜放入X射线片中，进行曝光。
最后使用化学显影废片机或Gel Doc System等设备进行成像。
11.数据分析：使用专业的成像软件分析成像结果，计算蛋白质的相对表达水平，并与内参蛋白进行比较。
需要注意的是，在进行WB实验的过程中，要严格操作，避免污染和交叉反应的出现。
同时，应根据实验需求选择适当的试剂和抗体，并进行标记、保存和储存等操作。
蛋白质免疫印迹(Western Blot )实验步骤和原理及注意事项
蛋白质免疫印迹（Western Blot ）实验步骤和原理及注意事项1.收集蛋白样品(Protein sample preparation)可以使用适当的裂解液。
收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。
根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。
因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。
BCA法。
2. 电泳(Electrophoresis)(1) SDS-PAGE凝胶配制(2) 样品处理在收集的蛋白样品中加入适量浓缩的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
例如2X或5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液。
使用5X的SDS-PAGE蛋白上样缓冲液可以减小上样体积，在相同体积的上样孔内可以上样更多的蛋白样品。
100℃或沸水浴加热3-5分钟，以充分变性蛋白（根据蛋白分子的大小，煮沸时间可适当变化，一般不低于5min。
煮沸只是变性蛋白，而不是分解，一般加了抑制酶不会分解。
煮沸对于SDS-PAGE凝胶电泳是必须的，只有煮沸,才能消除蛋白质的立体二级结构,伸展为一维线性结构,所以一般来讲二聚体都会解体,才能完全按照分子量跑电泳,加的蛋白Marker才有指示分子量的意义。
蛋白样品变性后与SDS充分结合，SDS使每个氨基酸带相同的电荷,使整个蛋白呈线性结构. 抗体因为要是线性表位结合的，100度煮10min 后13000,离心5分钟,取上清电泳,因为沉淀会导致拖尾.也可以取上清到另一管,4度可以放一周备再次电泳）。
(3)电泳i.清洗玻璃板：一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。
两面都擦洗过后用自来水冲，再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。
ii.灌胶与上样（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。
）（2）配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
灌胶时，可用10 ml枪吸取5 ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。
western blot 免疫印迹方法
Western blot一、S DS-聚丙烯凝胶电泳二、转膜1.准备好转膜用的物品：转膜夹、剪刀、镊子、纤维素膜、滤纸，盘子，盒子，玻璃棒，甲醇，转膜液（不加SDS，有气泡）2.将滤纸侵泡于盘中的转膜液，赶走气泡，将膜剪去一角做标记，侵泡于甲醇中，根据黑胶白膜原则叠好，保证无气泡后夹紧放入电泳槽中，黑对黑原则放入电泳槽，槽内放入冰袋，盖好电泳槽盖。
3.于冰上或者冰箱中低温转膜，恒流300mA，50min三、封闭（正面朝上）TBS洗5min配5%脱脂奶粉-TBS摇几分钟4℃过夜。
四、加一抗，倒去封闭液，用TBS冲洗一次，TBST 5min×3次（大概10ml），加入用2.5%脱脂奶粉-TBST稀释的一抗（1：10），室温摇2h五、加二抗：倒去一抗或回收（TBST,5mi n×3次）用2.5%脱脂奶粉-TBST按2000:1稀释二抗（鼠抗人IgE抗体），室温摇2h（有的已经与HRP结合的，如若没有，后面加HRP），TBST洗5mi n×3次，然后TBS洗5mi n×3。
六、化学发光，显影，定影（1）将A和B两种试剂在保鲜膜上等体积混合；1min后，将膜蛋白面朝下与此混合液充分接触；1min后，将膜移至另一保鲜膜上，去尽残液，包好，放入X-光片夹中。
（2）在暗室中，将1×显影液和定影液分别到入塑料盘中；在红灯下取出X－光片，用切纸刀剪裁适当大小（比膜的长和宽均需大1cm）；打开X-光片夹，把X－光片放在膜上，一旦放上，便不能移动，关上X-光片夹，开始计时；根据信号的强弱适当调整曝光时间，一般为1min或5min，也可选择不同时间多次压片，以达最佳效果；曝光完成后，打开X-光片夹，取出X-光片，迅速浸入显影液中显影，待出现明显条带后，即刻终止显影。
显影时间一般为1～2min（20～25℃），温度过低时（低于16℃）需适当延长显影时间；显影结束后，马上把X-光片浸入定影液中，定影时间一般为5～10min，以胶片透明为止；用自来水冲去残留的定影液后，室温下晾干。
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析流程
免疫印迹分析(Western Blot)是一种常用的蛋白质分析方法。
它的基本流程包括:
1. 样品制备:提取并定量蛋白质样本。
常用的方法有细胞裂解、组织匀浆等。
2. 电泳分离蛋白:使用SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白质。
根据分子量的不同,蛋白质会在凝胶上分离成不同的条带。
3. 转膜:将凝胶中的蛋白转移到NC膜或PVDF膜上。
4. 滤膜:使用5%脱脂奶粉或BSA在室温封闭1小时,以阻断膜胶的非特异性结合位点。
5. 一抗反应:加入特异性的一抗,孵育过夜。
一抗与目标蛋白特异性结合。
6. 二抗反应:洗涤后加入连接HRP的二抗,孵育1-2小时。
二抗与一抗结合。
7. ECL显色:滴加显影液,HRP催化发光底物氧化产生发光信号。
8. 凝胶成像:曝光、扫描和记录结果。
目标蛋白会出现特异性的条带。
9. 数据分析:通过条带的位置和强度分析目标蛋白的相对分子量和表达量。
以上是免疫印迹分析的基本流程。
根据实验目的,可以选择不同的样品制备方法、凝胶系统、转膜系统等,从而实现对蛋白质的分离、定量和功能分析。
WB实验操作流程
Western Blot即蛋白质印迹法（免疫印迹试验），是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。
其基本原理是通过特异性抗体对凝胶电泳处理过的细胞或生物组织样品中的特定蛋白进行显影。
通过分析显影的位置和显影深度获得特定蛋白质在所分析的细胞或组织中表达情况的信息。
实验流程主要包括以下几个步骤：样品制备；SDS-PAGE凝胶电泳；转膜；封闭；免疫杂交；显影。
实验器材操作步骤样品制备准备进行western blot的样品可分为细胞、组织、免疫沉淀或亲和纯化后的蛋白等。
样品为蛋白溶液时不需要进行提取，而样品为细胞、组织或包埋组织等则需要根据样品的特性对其进行提取。
根据需求不同还可针对于细胞亚结构进行提取。
（1）以体外培养的贴壁细胞样本为例，对其进行总蛋白提取：1、倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
2、每瓶细胞加3ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
3、按1ml裂解液加10 μl PMSF（100mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）4、每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
5、裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
）6、于4℃下12000rpm离心5min。
（提前开离心机预冷）7、将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于－20℃保存。
（2）以哺乳动物组织样本为例，对其进行总蛋白提取：1. 将100 mg 组织剪切成小块，加入适量的冰冷PBS 洗涤两次后，4℃，700×g（3000 rpm) 离心3 min，弃上清。
western blotting实验操作步骤讲解
蛋白免疫印迹杂交（Western Blot, WB）WB是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。
WB 是进行微量蛋白质分析比较成熟的技术之一。
以下是总结Western Blot 操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。
A第一部分：蛋白样本提取制备蛋白样品制备是Western Blotting的第一步，更是决定WB成败的关键步骤，总体原则和注意事项：1.尽可能提取完全或降低样本复杂度只集中于提取目的蛋白（通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品）；2.保持蛋白处于溶解状态（通过裂解液的pH 、盐浓度、表面活性剂、还原剂等的选择）；3.提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等，（低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂）；4.尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子（通过加入核酸酶或采取不同提取策略）；5.样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。
方法的选择◆自行配制抽提试剂，根据文献方法或经验提取；◆购买商品化试剂盒，按其说明书的方法提取。
Example 1：实验中提取肾脏总蛋白，具体实验过程如下：1.提前一天4℃解冻RIPA，一定要完全融化；配PBS（用于细胞试验则需高压）；2.配制裂解液：PMSF:RIPA=1:99,PMSF终浓度为100mM（根据样本数配制所需的量，临用临配）；3.裂解组织：每个样品称取100mg，加1ml裂解液，匀浆后4℃静置2h使其充分裂解，14000g，4℃离心10min，取上清。
4.蛋白定量：取少量上清稀释30倍蛋白定量，然后计算出各样本原液蛋白浓度。
注意由于裂解液里含有较高浓度的洗涤剂，蛋白定量不能选用Bradford法，可以选用改良的Lowry’s法或者BCA法。
5.样品蛋白浓度均一化：根据蛋白定量计算的结果将各样品蛋白浓度调整一致。
具体方法为加入PBS稀释至样品浓度一致，本次蛋白浓度为3mg/ml。
免疫印迹操作步骤
免疫印迹操作步骤western blot 超详细步骤一、蛋白质的样品制备：一、溶液：裂解液及蛋白酶抑制剂（每毫升裂解液加20ulcocktail）二、操作步骤：1、6孔板置于冰上，细胞经预冷的PBS漂洗3次，每孔加入100μl裂解液，5min后用细胞刮刀刮取细胞，用枪头转移至1.5mlEP 管中，编号置于冰上。
2、以上所得的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为3S，间歇时间为10S，重复三次。
3、于4℃离心机（预冷）12000r离心15min，取上清，收集于0.5mlEP管中。
二、蛋白浓度的测定（BCA法测定蛋白浓度）1.取标准蛋白（2mg/ml）备用。
2.于标准蛋白稀释为2mg/ml 1mg/ml 0.5 mg/ml 0.25 mg/ml 0.125mg/ml 0mg/ml，96孔板中每孔加入10ul，设3个复孔，待测蛋白稀释8倍，每孔加入10ul，设3个复孔，每孔加入BCA工作液（A液：B液=50：1混匀）90ul，37℃温浴30min，酶标仪测出各吸光度值，EXCEL输入数据，绘制标准曲线。
测出待测蛋白浓度。
测完蛋白含量后，计算含30、50μl蛋白的溶液体积即为上样量。
按上样量取出样品至0.5ml的EP管中，加入5×SDS 上样缓冲液至终浓度为1×。
后蛋白于95℃煮5min（干湿温箱预热）。
样品于-80℃保存。
三、电泳1.制胶分离胶:电泳凝胶浓度试剂10%H2O(ml) 4.030%丙烯酰胺3.31.5mol/lTris.cl(PH8.8) (ml)2.510%SDS(ml) 0.110%AP(ml) 0.1TEMED(μl) 5总体积(ml) 10浓缩胶试剂浓度(5%)H2O(ml) 230%丙烯酰胺(T: 30%,C: 3%(ml) 0.51.0mol/lTris.cl(PH8.8) (ml) 0.510%SDS(μl) 4010%AP(μl) 30TEMED(μl) 4总体积(ml) 31、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。
完整版WesternBlot免疫印迹法实验方法步骤
Western Blot(免疫印迹法)实验方法步骤发布日期:2008-8-25 热门指数:4360Western Blot(免疫印迹法)主要包括以下4个基本步骤：n 样品制备n 电泳分离n 蛋白的膜转移n 免疫杂交与显色――蛋白检测溶液和试剂n 1X 磷酸盐缓冲液(PBS)n Modified RIPA bufferTris-HCl: 50 mM, pH 7.4 ; NP-40: 1% ;Na-deoxycholate: 0.25% ;NaCl: 150 mM ;EDTA: 1 mM ;PMSF: 1 mM ;Aprotinin, leupeptin, pepstatin: 1 microgram/ml each ;Na3VO4: 1 mM ;NaF: 1 mMn 1X SDS 样品缓冲液62.5 mM Tris-HCl (pH 6.8 于25°C), 2% w/v SDS, 10%甘油,50 mM DTT, 0.01% w/v溴酚蓝n 转移缓冲液25 mM Tris base, 0.2 M 甘氨酸, 20%甲醇(pH 8.3)n 10X Tris缓冲盐(TBS)准备1L 10X TBS: 24.2 g Tris base, 80 g NaCl;用1N HCl调pH为7.6n 脱脂奶粉或BSAn 甲醇n TBS/T缓冲液1X TBS, 0.1% Tween-20）TBS/T封闭缓冲液（n1X TBS, 0.1% Tween-20加5% w/v脱脂奶粉或BSAn 一抗的稀释1X TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA (多抗)或5%脱脂奶粉(单抗)Note: 一般来说, BSA被推荐用于多克隆抗体，脱脂奶粉用于单克隆抗体，这样可得到较高的信噪比。
抗体的稀释度参考抗体说明书或根据实验确定。
n 预染的蛋白质Marker，可用于监测转膜的效率样品制备原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
WB实验步骤详解
WB实验步骤详解Western blotting (WB)是一种用于检测蛋白质的技术，它可以分析蛋白质的大小、数量和结构。
WB通常用于检测特定蛋白质在细胞或组织中的表达水平，以及蛋白质的修饰状态。
本文将详细介绍WB实验的步骤，以帮助读者更好地理解和掌握这一技术。
步骤一，细胞或组织的裂解。
WB实验的第一步是将细胞或组织裂解，以释放蛋白质。
通常使用RIPA缓冲液或其它含有蛋白酶抑制剂的裂解液来裂解细胞或组织。
裂解液中的蛋白酶抑制剂可以防止蛋白质在裂解过程中被降解，保证蛋白质的完整性。
步骤二，蛋白质的分离。
裂解后的细胞或组织中含有大量的蛋白质，需要将这些蛋白质分离出来。
通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）来分离蛋白质。
SDS-PAGE可以根据蛋白质的大小将其分离成不同的条带，方便后续的检测。
步骤三，将蛋白质转移到膜上。
分离后的蛋白质需要转移到膜上，以便进行免疫印迹检测。
通常使用半湿式或全湿式电泳转印系统将蛋白质转移到聚偏氟乙烯（PVDF）或硝酸纤维素膜上。
转印的时间和电压需要根据蛋白质的大小和数量来确定。
步骤四，膜的封闭。
转移完蛋白质后，需要将膜进行封闭，以防止非特异性结合。
封闭通常使用5%脱脂奶粉或蛋白质封闭剂进行，可以有效地减少非特异性结合，并提高抗体对目标蛋白的特异性识别。
步骤五，抗体的孵育。
封闭后的膜需要与特异性的一抗进行孵育。
一抗可以是针对目标蛋白的单克隆或多克隆抗体。
孵育时间和温度需要根据抗体的性质来确定，通常在4°C下孵育一晚上。
步骤六，膜的洗涤。
孵育完一抗后，需要对膜进行洗涤，以去除未结合的抗体和非特异性结合。
洗涤液通常是含有Tween-20的PBS或TBST缓冲液，需要进行多次洗涤以确保膜的干净。
步骤七，二抗的孵育。
洗涤完膜后，需要与特异性的二抗进行孵育。
二抗通常是与酶或荧光素结合的抗体，可以识别一抗并发出特定的信号。
孵育时间和温度需要根据二抗的性质来确定。
步骤八，膜的洗涤。
(完整版)蛋白免疫印迹(westernblot)实验
蛋白免疫印迹（western blot）实验实验步骤：一、试剂准备1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。
2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇 0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。
3. 转膜缓冲液：甘氨酸 2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
4. 0.01 M PBS(pH7.4)：NaCl 8.0 g；KCl 0.2 g；Na2HPO4 1.44 g；KH2PO4 0.24 g；加ddH2O至1000 ml。
5. 膜染色液：考马斯亮兰 0.2 g；甲醇80 ml；乙酸2 ml；ddH2O118 ml。
包被液（5%脱脂奶粉，现配）：脱脂奶粉1.0 g 溶于20 ml的0.01 M PBS中。
6. 显色液：DAB 6.0 mg；0.01 M PBS 10.0 ml；硫酸镍胺 0.1 ml；H202 1.0 μl。
【晶莱生物】二、蛋白样品制备1.单层贴壁细胞总蛋白的提取（1）倒掉培养液，并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。
（2）每瓶细胞加3 ml 4℃预冷的PBS（0.01M pH7.2～7.3）。
平放轻轻摇动1 min洗涤细胞，然后弃去洗液。
重复以上操作两次，共洗细胞三次以洗去培养液。
将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。
（3）按1ml裂解液加10 μl PMSF（100 mM），摇匀置于冰上。
（PMSF要摇匀至无结晶时才可与裂解液混合。
）（4）每瓶细胞加400 μl含PMSF的裂解液，于冰上裂解30 min，为使细胞充分裂解培养瓶要经常来回摇动。
（5）裂解完后，用干净的刮棒将细胞刮于培养瓶的一侧（动作要快），然后用枪将细胞碎片和裂解液移至1.5 ml离心管中。
（整个操作尽量在冰上进行。
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法
免疫印迹检测方法，又称蛋白质印迹或Western Blotting，是一种利用抗
原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。
以下是其基本步骤：
1. 取样：取上清液作为样品。
2. 电泳：制备电泳凝胶，进行SDS-PAGE。
3. 转移：通过半干式转移，将电泳后的凝胶上的蛋白质转移到膜上。
这个过程包括割胶、平衡、膜处理、转膜等步骤。
其中，转膜是关键步骤，需要将凝胶上的蛋白质精确转移到NC膜上，滤纸、凝胶、NC膜需要精确对齐，
去除气泡，并在恒流1mA/cm2下转移小时。
4. 免疫检测：在转移后的膜上，利用抗体进行检测。
这一步通常包括一抗和二抗的结合，以及通过化学发光检测或其他方法检测到结合的抗体。
5. 结果分析：通过对比染色结果和标准条带，可以分析出样品中特定蛋白质的表达情况。
此外，阴性对照是以1%BSA取代一抗，其余步骤与实验组相同。
以上信息仅供参考，具体步骤可能会根据实验需求和条件有所不同，建议咨询专业人士获取具体信息。
Western blot免疫印迹
整个Western blot实验步骤：一、蛋白提取（采用博奥森公司的试剂盒）将组织裂解于200 L含有蛋白酶抑制剂(100 g/mL PMSF, 2 g/mLAprotinin)的RIPA裂解液中[0.1%SDS, 1%脱氧胆酸钠, 1%Triton-100, 150 mmol/L NaCl, 1 mmol/LEDTA(pH 8.0), 10 mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)],4 ℃裂解1 h, 4 ℃15 000 r/min, 离心30 min, 取上清, 至新管. 二、蛋白定量（采用碧云天公司的试剂盒）采用brad-ford法进行蛋白定量。
三、SDS-PAGE电泳条件1.样品处理：5 loading dye混合，短暂离心，100℃5min，短暂离心。
2.最好用10ul的枪上样3.电泳条件：Caspase-3（上样量80ug/孔10%分离胶）浓缩胶（80V）分离胶（120V）Bcl-2 bax （上样量100ug/孔12%分离胶）浓缩胶（80V）分离胶（100V）四、转膜条件10×转膜缓冲液（Tris-base19.3g ；Glycine 90g加去离子水至1L）1×转膜缓冲液（10×转膜缓冲液：甲醇：去离子水=1:2:7）经SDS-PAGE凝胶进行电泳分离后, 转移至硝酸纤维素膜上,转膜（半干转）条件为10%分离胶：β-actin（0.45nm 20V 25min）caspase-3（0.45nm 20V 25min）12%分离胶：β-actin（0.45nm 23V 36min）bcl-2（0.22nm 20V 36min）注意：滤纸、凝胶、PVDF膜等大，剪好的膜要放入甲醇中浸泡3-5min，滤纸、凝胶、PVDF 膜要在转膜液中平衡15min以上才可使用；滤纸（三层）+凝胶+PVDF膜+滤纸（三层）之间无气泡。
湿转条件：260mA 1.5h五、封闭条件+加入一抗+加入二抗将膜取出，TBST洗涤3次，每次5min，在含50 g/L脱脂奶粉的TBST中室温封闭1h. 倒掉封闭液, 加入用杂交液(1%BSA, 0.1%Tween20, 1×TBS)稀释的目的一抗和β-actin一抗, 摇床上4℃杂交过夜后室温孵育30min，用TBST洗膜3次, 每次10 min. 然后分别加入用杂交液稀释的二抗(1∶5 000), 室温杂交1 h。
做Weston blot 操作步骤
免疫印迹（Western blot）1.蛋白样品的制备（尽量冰上操作）1.1提取蛋白：EP管和金属浴架子预冷，按说明书在蛋白酶抑制剂中加裂解液RIPA，将细胞洗液用吸纸吸干净，否则会影响蛋白浓度测定（需要确认洗液？和操作顺序？）向各组样品中添加等量的裂解液RIPA，冰上放置10分钟超声，对于200ul的样品，超声25-30s，振幅35%，上中下液层各10s离心，12000rpm，10min，4度取上清，即细胞总蛋白1.2 蛋白定量（测蛋白浓度）BCA(1)配溶液：将BCA溶液的A液与B液（50:1）配成混合液，(2)把BSA稀释成0.5mg/ml，0.4mg/ml，0.3mg/ml，0.2mg/ml，0.1mg/ml，0.05mg/ml,Tips：每个浓度3个孔*20ul，在第一排的第一个孔里配80ul，分别取20ul加到下面的3个孔，弃掉第一个孔。
(3)对于待测样品，2ul蛋白样品（上清）+18ul PBS，每个样3个孔做重复，可根据蛋白样品的体积调整稀释比例(4)加显色液200ul/孔（避光操作）(5)把96孔板放入37℃恒温箱30min；(6)用酶标仪检测蛋白浓度：562nm，制作标准浓度曲线（插入散点图，求线性函数），计算各样品蛋白浓度，求平均值，用裂解液调所有蛋白样品浓度一致（在Excel中计算所有）(7)加SDS（SDS容易析出，在液态时添加），用蛋白样品将SDS（5X）稀释为SDS（1X），提前打开金属浴100℃10 min(蛋白变性前后要顺离)2.配胶（先安装好制胶夹）步骤：(1)玻璃板清洗干净，底部要齐（可底部涂抹凡士林），否则容易漏胶，短玻璃板在前，与大玻璃板正面相接。
(2)沿大玻璃板加分离胶（12%，10-100kDa，原则：小分子量高浓度），加至玻璃夹上分界线上方一点。
（枪头贴紧大玻璃板一侧，防止产生气泡。
）(3)迅速加入无水乙醇压平。
（等待30 min,倒掉无水乙醇，用吸水纸吸水）。
western blot 免疫印迹实验
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE）
转膜
封闭
加抗体
一抗
检测
可以看到目的条带
二抗上的酶：辣根 过氧化物酶，有其 底物存在时会发光
二抗：被标记了的 抗体（检测）
一个一抗可以和两 个甚至更多的二抗 结合
请老师与同学们指正
滤纸：维持transfer buffer稳定的流动 胶 膜 滤纸
海绵垫：固定整个系统
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE） 转膜 封闭 加抗体 检测
所有蛋白从胶转移到膜上，并 于膜紧密结合，封闭是指还空 白的结合位点，防止后面加的 抗体和膜结合（阻止非特异性 结合）
和蛋白高度亲和
胶
膜
把蛋白转移到膜上进行检测（为于表面更容易与抗体结合） 蛋白带负电，外加一个电场，蛋白从负往正
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE）
转膜 封闭
海绵垫
加抗体检测ຫໍສະໝຸດ 放入电泳槽中：胶靠近负极， 膜靠近正极，在transfer buffer中加入甲醇（甲醇促 使蛋白与SDS分离），使蛋 白更好的与膜结合。
western blot 免疫印迹实验
western blot 免疫印迹实验
目的（功能）：检测和分析蛋白
大分子量
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE）
转膜 封闭
小分子量
加抗体
检测
SDS带负电荷，与蛋白结合使蛋白带负电，从而能在电场作用下迁移
western blot 免疫印迹实验
步骤：蛋白电泳（SDS-PAGE） 转膜 封闭 加抗体 检测
Western印迹法原理、操作步骤及应用
Western印迹法的原理及应用一、原理免疫印迹法（Western印迹法）是将经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或放射性核素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
典型的印迹实验包括三个步骤：①蛋白质的电泳分离；②将电泳后凝胶上的蛋白质转移至固体膜上，用非特异性、非反应活性分子封闭固体膜上未吸附蛋白质区域；③免疫学检测。
免疫印迹法克服了聚丙烯酰胺凝胶电泳后直接在凝胶上进行免疫学分析的弊端，极大地提高了其利用率、分辨率和灵敏度，使其成为使用最广泛的免疫化学方法之一。
二、材料Western印迹法所需材料包括SDS-PAGE试剂，硝酸纤维素薄膜，匀浆缓冲液，转膜缓冲液，膜染色液，显色液，酶标二抗及其底物等。
三、操作步骤（一）样品制备培养细胞及组织样品加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5～1分钟。
细菌诱导表达的原核细胞，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞。
然后4℃，13 000g离心15分钟，取上清液作为样品。
（二）SDS-PAGE聚丙烯酰胺凝胶电泳是目前对蛋白质进行分离、纯度鉴定及分子量测定的主要方法之一。
十二烷基磺酸钠（SDS）是一种阴离子去污剂，可与蛋白质结合，使蛋白质变性并带上大量负电荷。
SDS-PAGE是最常用的凝胶电泳技术。
它通常采用不连续电泳系统，即用上层胶（成层胶）和下层胶（分离胶）两种不同浓度的凝胶灌制凝胶板。
SDS-PAGE通过其电荷效应、浓缩效应和分子筛效应，达到蛋白质高分辨率的分离效果。
抗原等蛋白样品经SDS处理后带负电荷，在聚丙烯酰胺凝胶中从阴极向阳极泳动，分子量越小，泳动速度就越快。
此阶段分离效果肉眼不可见（只有在染色后才显出电泳区带）。
wb实验流程及注意事项
wb实验流程及注意事项
WB实验是一种常见的免疫学实验，其流程大致如下：
1.制备细胞悬液：将需要研究的细胞通过离心、洗涤等操作制成含有约1×10^6个/ml的单细胞悬液。
2.孵育细胞：将细胞悬液加入含有10%腹水的RPMI1640培养基中（也可添加适量的FBS）进行孵育，通常孵育时间为24-48小时。
3.收获细胞：将孵育后的细胞通过离心等方式收获，以备进行下一步操作。
4.制备干标准物：将抗体或其他试剂制成干标准物（包括一系列浓度档次），通常冷冻保存备用。
5.制备稀释液：将PBS或其他缓冲液配成不同浓度的稀释液，可用于对干标准物的稀释。
6.加入样品：将步骤3中的细胞悬液加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
7.加入干标准物：将制备好的干标准物加入96孔板中，加入相等体积的稀释液。
8.孵育：将加入样品和干标准物的96孔板进行孵育，通常为2-3小时，使细胞与抗体结合。
9.洗涤：用PBS或其他缓冲液进行洗涤，去除未结合的试剂。
10.加入二抗：加入与干标准物匹配的二抗，并进行孵育。
经过一定时间，细胞与试剂结合形成免疫复合物。
11.用底物发光：加入底物，进行化学发光反应，根据发光量推算出样品中对应物质的浓度。
注意事项：
1.所有试验所用材料要保持洁净，尤其是培养皿和吸管，以避免污染。
2.在制备稀释液和样品时要准确称量，避免误差，同时要注意样品的体积和浓度，保证实验的可靠性。
3.在操作过程中，要规范操作流程，严格遵守实验规程，注意自身安全。
4.试剂保存要避免高温和阳光照射，同时要注意过期时间。
5.实验过程中要及时记录数据，以便后续分析。
wb实验的原理和步骤
wb实验的原理和步骤WB实验的原理和步骤。
WB实验是一种常用的蛋白质检测方法，它可以用来检测目标蛋白在细胞或组织中的表达水平，是生物学研究中常用的实验技术之一。
本文将介绍WB实验的原理和步骤，希望能够帮助读者更好地理解和掌握这一实验技术。
一、实验原理。
WB实验的原理主要基于蛋白质的电泳分离和免疫印迹技术。
首先，将待检测的蛋白样品进行SDS-PAGE凝胶电泳分离，然后将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，接着用特异性抗体与目标蛋白结合，最后通过化学发光或显色反应来检测目标蛋白的表达水平。
二、实验步骤。
1. 样品制备，将待检测的蛋白样品加入SDS-PAGE样品缓冲液，加热变性，然后进行电泳分离。
2. 凝胶电泳，将样品加载到SDS-PAGE凝胶孔中，连接电源进行电泳分离，直至蛋白样品分离完全。
3. 转膜，将分离后的蛋白转移到聚丙烯酰胺膜上，可以选择湿式转膜或半干式转膜的方法，转膜时间和电流密度需要根据蛋白的大小和数量进行调整。
4. 封闭，将转膜后的膜放入封闭液中，封闭蛋白质膜上的非特异性结合位点，减少后续免疫印迹过程中的非特异性结合。
5. 抗体结合，将封闭后的膜与特异性一抗抗体孵育，使抗体与目标蛋白结合。
6. 洗膜，将膜进行多次洗涤，去除未结合的抗体。
7. 二抗结合，将膜与辣根过氧化酶标记的二抗孵育，二抗与一抗结合形成复合物。
8. 洗膜，将膜进行多次洗涤，去除未结合的二抗。
9. 显色或发光，根据实验需要选择化学发光或显色反应，观察目标蛋白的表达水平。
三、实验注意事项。
1. 样品制备时需加入还原剂和变性剂，使蛋白完全变性并且带有负电荷，便于电泳分离。
2. 蛋白转膜时，需保持膜的完整性，避免出现气泡和损坏，影响后续的免疫印迹效果。
3. 免疫印迹过程中的抗体孵育和洗膜步骤需要严格控制时间和条件，以保证特异性结合和减少非特异性结合。
4. 显色或发光反应的时间和条件也需要根据实验情况进行优化，以获得清晰的实验结果。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
免疫印迹（WB）实验操作具体步骤及详细说明
一、试剂和溶液
转印缓冲液：0.025M Tris base , 0.187 M 甘氨酸, 25%甲醇氨基黑溶液：0.1% 酸性黑10B 1×TBST：25mM Tris-HCl ( pH 8.0 ) , 0.2 M NaCl , 0.1%Tween 20 封闭液：TBST 配制的5%牛奶抗体稀释液：TBST 配制的5%牛奶显色系统：ECL 显色
二、实验步骤
1.电泳：将裂解液进行SDS-PAGE 电泳，80v，30 分钟，120v，90 分钟；
2.转膜：PVDF 膜在甲醇中浸泡约30 秒左右，滤纸浸泡在转印缓冲液预湿，
半干法转印到PVDF 膜上，10v，150 分钟；
3.染色：氨基黑染色5 分钟，甲醇褪去背景色，观察条带；
4.膜活化：将PVDF 膜置于甲醇活化1min，用纯水洗膜2 次后再用TBST 洗
涤3 次；
5.封闭：将膜条置于5%牛奶或2% BSA 中，室温混摇2h；
6.一抗孵育：将待检抗体用3%牛奶或2% BSA 稀释到合适浓度（参照抗体说
明书，根据客户预实验结果，稀释度上下浮动一个数量级都为正常），将膜放入对应的已稀释待检样品中，置4℃混摇孵育过夜；
7.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；
8.二抗孵育：将膜取出放入稀释好的HRP 标记的二抗（参照二抗说明书进行
稀释）中，室温混摇2h；
9.洗涤：取出膜放在TBST 中洗涤3×5min；
10.ECL 显色：将膜取出放入混匀的ECL 显色液中，孵育3min，将膜取出贴在
有荧光角标的胶片上，迅速用保鲜膜包好；
11.曝光：把底片放在暗盒中，根据荧光强度分别对X 光胶片作不同时间段的曝
光，曝光结束后，将底片取出，1min 显影，30s 清洗，1min 定影，30s 清洗，晾干；
12.结果分析：用扫描仪将曝光后的X 光胶片扫描，做后续结果分析。