石蜡切片的制作.
石蜡切片制作流程
石蜡切片制作流程以石蜡切片制作流程为标题，写一篇文章。
石蜡切片制作是一项常见的实验技术，在生物学、医学和材料科学等领域广泛应用。
石蜡切片可以用于显微镜下的观察和分析，能够提供关于细胞和组织结构的详细信息。
下面将介绍一下石蜡切片的制作流程。
1. 组织固定：首先，需要从感兴趣的样本中取得组织样本，并将其进行固定。
固定是为了保持组织的形态结构和化学成分，常用的固定剂有福尔马林、乙醛等。
固定过程中，需要确保样本完全浸泡在固定液中，通常需要数小时至数天的时间，以确保组织被充分固定。
2. 脱水：固定后的组织样本需要进行脱水处理，以去除其中的水分。
脱水是将样本中的水分逐渐替代为有机溶剂，常用的有乙醇、丙酮等。
通常采用递增浓度的有机溶剂，从低浓度逐渐提高到高浓度。
每个浓度的脱水液中，样本需要浸泡一定的时间，以确保脱水彻底。
3. 渗透：脱水后的组织样本需要进行渗透处理，以使其与石蜡更好地结合。
渗透剂通常为石蜡溶液，可以将样本浸泡在石蜡溶液中，以使其逐渐渗透进入组织内部。
渗透过程中，需要注意控制温度和时间，以确保渗透均匀。
4. 包埋：渗透后的组织样本需要进行包埋处理，即将其嵌入到石蜡中。
首先，将组织样本放置在石蜡模具中，并加入适量的石蜡。
然后，将模具放入石蜡包埋机中，利用加热和真空等处理，使石蜡与组织样本充分结合。
包埋过程中需要严格控制温度和时间，以确保石蜡固化完全。
5. 切片：包埋后的组织样本需要进行切片处理，以获取薄片供观察。
首先，使用切片机将石蜡块切割成薄片。
然后，将薄片置于载玻片上，并加热使其与载玻片结合。
最后，使用刮片等工具将石蜡薄片修整成所需的形状和大小。
6. 然后，对切片进行染色处理，以增强对组织结构的观察。
常用的染色方法有血液学染色、免疫组化染色等。
染色后，可以使用显微镜观察和分析切片中的细胞和组织结构。
总结起来，石蜡切片制作流程包括组织固定、脱水、渗透、包埋、切片和染色等步骤。
每个步骤都需要严格控制条件和时间，以确保制作出高质量的石蜡切片。
第二节石蜡切片制作(共48张PPT)
材料：小鼠的组织（小鼠肝脏）。 切片完毕，应及时用氯仿将切片机的有关部分擦净。 染色后的切片须再次经过脱水、透明。
2．刀口倾斜度太大； ❖ 若过深则进行适当分化。
冲洗的目的在于弃去组织中过剩的固定剂，以免固定剂沉淀于组织之中影响切片的质量。 3．移动刀片，改用新的刀口；
❖ 4%多聚甲醛-磷酸盐缓冲液：4g多聚甲醛+100ml磷酸盐缓冲液（适用于 免疫组化学技术）。
不同浓度梯度酒精配制
梯度酒精的作用： 将组织中的水分经过梯度酒精的作用，置换出 来，以达到组织脱水的目的。
配制：例如70%的酒精配制，70ml（100%纯 酒精）+30ml蒸馏水混匀即可。
石蜡切片所需的实验器材
使上下两面修成平行面，常保留组织周围附着宽2～3mm的 石蜡，而修好的蜡块呈长方形。还可削去一角以便于 在蜡带上识别切片。
实验室是用来作各种组织切片的一种专门设计的精密 机械，常用的是旋转式切片机，它的夹物部分是上下 移动前后推进的，而夹刀部分则固定不动。主要部件 是安装切片刀的刀台、安装包埋块的标本台和控制切 片厚度的微动装置。切片时切片刀固定不动，转动转 轮，标本台上下运动并按调好的切片厚度向前推进一 定的距离，组织块上下运动一次，便在刀片上得到一 张合乎厚度要求的切片。
100%的酒精
95%的酒精
80%的酒精 70%的酒精
蒸馏水 苏木精染色
自来水洗（在显微镜下检查细胞核的颜色是否 合适，若太浅，可经蒸馏水洗后放回重染，
若过深则进行适当分化。）
0.5%的盐酸水分色数秒钟在显
石蜡切片的制作
石蜡切片的制作石蜡切片法即用石蜡作为支持剂进行切片的方法。
石蜡切片法是一般组织学、病理学等常规制片方法，它有很多优点，例如，比较省时间，容易操作，可切成极薄的切片，能制作连续切片，组织块可包埋在石蜡中永久保存等。
缺点是只能用于较小的组织块，较大的组织块不易切好容易破碎，组织在脱水透明过程中产生收缩并易变脆，制片时间太长。
一、石蜡切片的制作过程石蜡切片的制作过程主要是：取材→水洗→固定→水洗→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→贴片→染色。
（一）取材及水洗根据实验要求选取材料来源及部位，取要求部位的小块组织成为组织块，组织块的大小以不超过0.5立方厘米为宜。
切去组织块时动作要轻，切忌用力牵引或挟持，以免组织内部发生变化。
由动物身上切取的组织必须是新鲜的，材料越新鲜越好，一般不应超过死后24小时，因此一般情况下，将动物处死后立即取需要的材料。
组织块取下后，先用相应的生理盐水漂洗以洗去血液、污渍以及粘液等。
如果是管状组织则必须把管腔中污物洗净，可用注射器自一端向管腔中注射生理盐水数次，使其管腔冲洗干净，切忌不可用刀或其他器具刮之。
（二）固定材料由动物体取下后应当迅速固定，固定的目的是尽快使固定液渗入组织内部，将组织固定以保持其原有的结构。
不同的组织应选用适当的固定液。
固定液的用量与组织块体积之比一般在20:1，不应使组织块贴于容器壁上。
材料固定完毕后，保存于严密紧塞或加盖的容器里，同时在容器外上标签，应记录固定液的名称，材料的种类，动物品种及开始固定的时间。
固定的时间长短依据材料大小而定。
固定液有许多种，在固定的过程中应该根据需要选取合适的固定液，一般固定液都以新配为好，配好后应贮存在阴凉处，不宜放在日光下，以免引起化学变化而失去固定作用。
有些混合固定液的成份之间会发生氧化还原作用，一定要在使用前才混合，如果混合太早固定时就没有作用了。
（三）水洗固定后的组织块在进行脱水前必须用流水洗去固定液。
，主要目的是洗去固定液的颜色以便后续的染色。
石蜡切片的制作
石蜡切片的制作试验药品和仪器试验药品：酒精、二甲苯、石蜡、番红、固绿、冰醋酸、甲醛、明胶、甘油、石碳酸、中性树胶。
试验仪器：石蜡切片机、组织包埋机、水浴锅、染缸、烘箱。
试验方法1 叶片组织结构的观察对叶片组织结构的观察采用石蜡切片法。
具体操作步骤如下：1. 取材。
选取生长良好的叶片，用水清洗干净，擦干，沿主脉切取2mm x 5mm 的小段。
2. 固定。
将切取的植物材料立即放入FAA 固定液中（材料与固定液比例1:20），用真空泵抽气（使固定液尽快渗入材料中，并排除材料内气泡的干扰），固定时间48h以上。
FAA固定液配方：50%酒精、冰乙酸、甲醛（37%-40%）按18:1:1的比例配置。
3. 冲洗。
材料从固定液中取出后，用70%的酒精冲洗3次，每次间隔2h,并在70%酒精中过夜。
4. 脱水。
酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序进行：70%酒精一80%酒精一95%酒精一无水酒精一无水酒精，每级酒精中放2h，无水酒精分2次，一次2h。
5. 透明。
纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒精。
材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过程称透明。
通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液浸渍1〜2小时，再转入纯透明剂中浸渍。
具体为：1/3二甲苯+2/3无水酒精（加番红染色，以便透明后找到材料）一1/2二甲苯+1/2无水酒精一2/3二甲苯+1/3无水酒精一二甲苯一二甲苯，每级二甲苯中放2h，纯二甲苯分2次，每次放1h。
材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到前面一级无水的脱水剂中再次脱水。
6. 浸蜡。
夏季采用熔点较高的石蜡（56-58）,冬季宜选用熔点较低的石蜡（52-54）。
新蜡应溶一次，增加密度，反复溶的旧蜡包埋效果更好。
在溶蜡箱中进行55-60C，恒温。
石蜡切片的主要制备程序
石蜡切片的主要制备程序
石蜡切片的主要制备程序可以概括为以下几个步骤：
1. 准备样品：选择需要切片的样品，如组织样本、细胞样品等，并采取相应的固定、处理和染色等预处理步骤，以保证样品的稳定性、可观察性和对比度。
2. 材料准备：准备好所需的石蜡、切片盒、切片刀、载玻片等材料，并进行清洁和消毒处理，以避免污染和交叉感染。
3. 石蜡浸透：将处理好的样品转移到石蜡中进行浸透。
首先将样品置于温度逐渐升高的浸透剂（如正己烷）中，以去除组织内水分和其他溶质，然后置于石蜡中进行浸透。
4. 切片制备：将石蜡浸透的样品固定于切片盒中，将石蜡块剪碎成适当大小，并放置在切片刀的刀脊上。
调整切片机参数（如温度、角度、速度等），并逐个切割出薄片。
5. 切片贴片：将切好的薄片浮于温水中或使用其他方法，如电离子器、热平台等，以使切片展平并附着于载玻片上。
6. 干燥固定：将切片连同载玻片一起进行干燥固定处理，以去除水分并保持切片的形态稳定。
7. 切片染色：根据实验需求，对切片进行适当的染色处理（如组织学染色、免疫组化染色等），以增强样品的可视化效果和区分感兴趣的结构。
8. 封片封装：将切片封装至封片盖玻片上，使用透明化导电胶或其他封片剂固定切片，并尽量排除气泡、保证封片质量。
9. 切片质控：对制备好的切片进行质量控制，使用显微镜观察和评估切片的清晰度、结构完整性、染色效果等。
最后，制备完成的石蜡切片可以用于显微镜观察、组织形态分析、病理学研究等应用。
需要注意的是，在整个制备过程中，应遵循标准实验操作规程、注意安全，以及依据实验要求进行相应的优化和调整。
怎样制作石蜡切片
怎样制作石蜡切片制作石蜡切片需要一系列的步骤和材料。
以下是一种常见的制作石蜡切片的方法：1.准备材料和设备：-石蜡块：石蜡是一种透明且易于切片的材料，可以在化学试剂供应商或实验室设备供应商处购买。
-刀片：使用一把锋利的微创刀片来切割石蜡。
确保刀片是干净的，滴一滴乙醇或其他清洁溶液在刀片上擦拭，然后用干净的纸巾擦干。
-切片盒：选择适合的切片盒来放置切割好的石蜡切片。
-石蜡模具：这是一个用于制作石蜡块的模具，可以在实验室设备供应商处购买。
2.制备石蜡块：-首先，将石蜡块加热至约60-70°C，直到完全融化。
-将石蜡块从加热器中取出，小心地倒入石蜡模具中。
-等待石蜡冷却和凝固。
你可以将石蜡模具放入冷却台上以加快冷却过程。
3.切割石蜡块：-将已冷却和凝固的石蜡块从模具中取出。
-使用清洁干燥的刀片将石蜡块切成适当的大小。
你可以根据实验需求来确定切割的尺寸。
4.制备石蜡切片：-准备一张玻璃载玻片。
-小心地将切割好的石蜡片放在玻璃载玻片上。
5.烘干石蜡切片：-将玻璃载玻片连同石蜡切片放入干燥炉。
-设置炉温为50-60°C，保持1个小时以消除任何残留的水分。
6.染色和封片：-如果需要，可以将石蜡切片进行染色以便更好地观察。
- 使用适当的染色剂，如伊红（Eosin）或伊红-兰红（Eosin-Methylene Blue）来染色石蜡切片。
-染色后，将石蜡切片放入一盒有封盖的容器中，以便保存和保护切片。
制作石蜡切片需要一定的实验室技巧和经验，同时注意安全，避免烫伤和刀片伤害。
在操作过程中，务必佩戴手套和护目镜，确保实验室处于通风良好的环境中进行操作。
石蜡切片的制作
石蜡切片的制作1. 固定卡尔诺氏(Carnoy's)固定液：纯酒精15ml，冰醋酸5ml混合液，固定时间为1h-2h.。
2. 洗涤固定后的材料即用95%的酒精冲洗2-3次，在材料不能立即处理时，需转入70％酒精保存。
3. 脱水硬化（酒精）85%→95%Ⅰ→95%Ⅱ→100%Ⅰ→100%Ⅱ20min 20 min 20 min 20 min 20 min4. 脱酒精（透明）酒精（纯）：二甲苯→二甲苯→二甲苯→二甲苯1：135 min 35 min 35 min 35 min5. 浸蜡和埋蜡材料脱酒精后，要进行浸蜡，再进行埋蜡。
在操作第4步时就可以开始溶蜡，溶蜡时烘箱温度设为80℃，但不能超过80℃，浸蜡时温度为58-60℃，也不能超过此范围。
浸蜡石蜡：二甲苯→纯蜡→纯蜡1：12h 2 h 2 h浸蜡后，须将材料封埋在蜡块中，通常以磅纸折成纸盒(如图所示)。
在盒内底上，用软铅笔反书材料及日期等，然后把蜡倒入盒内，将材料移入纸盒中，依将所要切的方向，妥善排列，再以两手平持纸盒，移至冷水中，用口在蜡面上吹气，促其凝结，待蜡面凝成簿层时，将纸盒全部沉入。
水冷凝后，将纸撕去，即获蜡块，至此埋蜡完成。
折纸盒按下列顺序折叠：(1) 折AA'及BB'；(2) 折CC'及DD'；(3) 折CE'与AE'、向外夹出EE'。
同样折出FF'，GG'及HH'；(4) 使CE'E与E'IE两三角形相叠，并沿E'C和EI重叠的折痕向后转折。
同样折其余三只角；(5)折RIJF向外，同样折出GKLH，即折成所需的纸盒。
6. 切片石蜡切片，用旋转切片机。
一个旋转切片机，可分三个部分，一个是安装切片刀的部分，有调节刀片斜度和固着刀片的螺旋。
一个是安装材料的部分，也有螺旋可以调节材料的位置。
另一个是操纵在旋转中向前推进的部分，控制着切片的厚薄，是比较重要而复杂的部分。
生物显微技术 第一章 石蜡切片制作技术
三、包埋
是把被石蜡浸透的材料连同熔化的石蜡一起 倒入一定形状的容器内，并立即投入冷水中， 使它凝固成含材料的蜡块，以备切片。
从温箱中取出盛放纯石蜡的蜡杯，倒入包埋 用的纸盒中，取出存放材料的蜡杯，用温镊 子夹取材料平放于纸盒底部，使之排列整齐。 将纸盒两侧的把手提起，慢慢地平放在面盆 的水面，待石蜡的表面凝固，将 纸盒慢慢 浸入水中，待石蜡完全凝固（约30分钟） 后即可取出备用。
包埋前应先把必需的用具（恒温箱、温台、纸盒） 准备好。 包埋用的镊子要先放在温箱中预热。
第五节 切片、展片和贴片
一、切 片 是把包埋好的材料块用切片机切成所需厚度的切片带。 实验程序 1. 切片前的准备工作 （1）整修：用单面刀片将蜡块四周修整平行。 （2 ）石蜡块的固着：先将蜡块用刀片切成方形或长
四、注意事项
1 透明的注意事项
使用透明剂时，要随时盖紧盖子，以免空气中水 分进入； 更换透明剂，动作要迅速； 材料周围 出现白色雾状，应退回纯酒精中重新脱水。
2 透蜡的注意事项
动物材料常用的石蜡熔点为52-56ºC；植物材料 为54-60ºC。 透蜡温度要恒定，不可忽高忽低；
3 包埋的注意事项
第一节 动物的选择、杀死和取材
一、动物的选择 根据实验目的选择合适的动物和组织 如：健康状况的选择 观察不同组织、器官选择不同的动物（如：
肥大细胞、肝小叶、环层小体等）
二、动物致死法 根据动物的大小、种类和观察目的不同，进
行适当的选择。 1、麻醉法 2、空气栓塞法 3、断头法 4、击头法 5、股动脉放血法 要求动作迅速、及时取材、迅速固定
石蜡切片的制作及免疫组织化学标准化操作流程
石蜡切片的制作标准化操作流程1.取材固定1)取材必须新鲜，组织离体后迅速割取组织块，并随即投入固定剂福尔马林中。
切取材料时刀要锐利，避免因挤压细胞使其受到损伤。
2)固定完毕，用水冲掉残留的固定剂，以免固定剂形成沉淀，影响以后组织块的染色。
2.脱水脱水步骤应从低到高以一定的浓度梯度来进行，一般从30％乙醇开始，经过50％、70％、80％、95％、100％至完全脱水，各级乙醇中放置45min到1h，如果中间须停顿，应使材料停留在70％乙醇中，因为低浓度乙醇易使组织变软、解体，高浓度乙醇有脆化组织作用，放置时间不能过长，另外，脱水必须在有盖瓶中进行，以防止高浓度乙醇吸收空气中水分导致浓度降低而使脱水不彻底。
需要保存的材料可脱水至70%乙醇时停留其中，如需长期保存，可加入等量的甘油。
3.二甲苯透明组织块用非石蜡溶剂脱水后必须经过透明。
透明剂能同时与脱水剂和石蜡混合，它取代了脱水剂后，石蜡便能顺利地渗入组织。
将组织块先放入纯乙醇与二甲苯的等体积混合液，再进入纯二甲苯，。
透明时间一般各级停留时间在30min至2h，在纯二甲苯中应更换2次，总时间则以不超过3h为宜。
4.透蜡和包埋包埋用的石蜡，熔点在60℃左右。
透蜡须在恒温箱中进行，恒温箱的温度调节至高于石蜡熔点3度，使经过透明的组织块依次用石蜡与二甲苯的等量混合液、纯石蜡处理。
纯石蜡应处理2-3次，透蜡的时间依材料性质而定，一般每次需15-30min。
透明的关键是控制温度的恒定，切忌忽高忽低，温度过低石蜡凝固无法渗透，温度过高使组织收缩发脆。
包埋是使浸透蜡的组织块包裹在石蜡中。
具体做法是；先准备好纸盒，将熔蜡倒入盒内，迅速用预温的镊子夹取组织块平放在纸盒底部，切面朝下，再轻轻提起纸盒，平放在冷水中，待表面石蜡凝固后立即将纸盒按入水中，使其迅速冷却凝固，30min后取出。
5.切片方法是：右手转动转轮，左手持毛笔在刀口稍下端接住切好的片子，并托住切下的蜡带，待蜡带形成一定长度后，右手停止转动，持另一枝毛笔轻轻将蜡带挑起，平放于衬有黑纸的纸盒内，注意切片速度不宜太快，摇动转轮用力应均匀，防止切片机震动厉害引起切片厚薄不均匀，还应注意转动的方向，以防标本台后移而切不到片子。
常规石蜡切片标本制作流程
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石蜡切片的制作过程
石蜡切片的制作过程（一）花药切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。
3．脱水：经70％乙醇、85%乙醇，每级3~4h，含1%伊红的95％乙醇中3~4h（可以过夜），无水乙醇2次，每次1~2h。
4．透明、加蜡：5级氯仿透明，每级3~4h，纯氯仿2次，每次2h，加碎蜡，然后置36℃温箱中1~2d5．浸渗、包埋：50%、70%蜡各3h，再经纯蜡A、纯蜡B、纯蜡C三杯，每杯1h，包埋。
6．修蜡块、切片：粘蜡块时组织块直立于台木上，并用单面刀片切除先端石蜡，浸水软化后放在切片机上坐横切片，切片厚12μm。
7．展片、粘片、烘片：蜡片先镜检，每张载玻片上放2个蜡片，展片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃温箱中烘干。
8．脱蜡、透明：二甲苯脱蜡、透明各1次。
9．染色（番红-固绿双重染色）：在已脱蜡的材料上滴注无水乙醇、95%乙醇、85%乙醇、70%乙醇、50%乙醇、30%乙醇、蒸馏水各4~5s，苯胺番红染色5~10min，用蒸馏水洗去浮色。
10．脱水、透明：各级乙醇脱水（30%乙醇、50%乙醇、70%乙醇、85%乙醇、95%乙醇），苯胺固绿复染30~40s，再经95%乙醇，无水乙醇，1/2无水乙醇+1/2二甲苯、二甲苯2次，各约4~5s，最后置二甲苯缸中。
11．封片、烘片：加拿大树胶封片。
封片后将材料平放在摊片盘上，放置36℃左右的温箱内烤数天即可烤干。
最后，将干燥好的切片上的浮色擦净，并在玻片的左端粘上标签，注明组织切片的名称、染色方法、固定方法、年月日。
制片日程（二）花芽纵切片制片法1．取材2．固定：FAA液中固定24h，并保存在其中。
3．整染：经70％乙醇、50%乙醇各2~4h，转入爱氏苏木精稀释液（爱氏苏木精原液1份，加入50%乙醇及乙醇各半的混合液1份）中整染2~3d。
4．水洗、反蓝：蒸馏水浸洗，勤换水至无浮色渗出，再转入自来水中，换1~2次水，至样品由紫色变深蓝色为止，共需时约1d。
石蜡切片制作
石蜡切片操作一、试剂配制1固定剂：36% ~40%福尔马林液5ml ;冰醋酸5m1; 50%酒精89ml;2、1%番红染液：番红2g，乙醇100ml，水100ml3、0.5%固绿溶液：固绿0.5g，乙醇95ml，水5ml4、各级浓度酒精的配制70% ；85%；95% ；100%酒精。
70%和85%酒精用95%酒精配制；（取70ml95%酒精，加水至95ml，即为70%酒精）6、粘片剂：鸡蛋清一个，打碎，除去泡沫，加入等量的甘油二、实验步骤1固定：组织块大小：1.5X 1.5X 0.2 CM 固定液＞ 4倍组织体积福尔马林固定液12 —24 h后用蒸馏水洗2、脱水：70% 乙醇1h ----------- ►85% 乙醇1h -------- ►95% 乙醇1h ---------- 100% 乙醇0.5 —1h --------- ► 100% 乙醇0.5-1h3、透明：100%乙醇：二甲苯（1 : 1）2h （加少量番红）--------- ►二甲苯1.5h ------------ ►二甲苯1.5h （溶液占瓶子1/3，不倒掉，直接加小蜡块透明）注意：时间太长变脆4、浸蜡：材料和蜡块不相接触，置换组织中的透明剂，为包埋做准备。
方法一：石蜡熔点52—56 C温箱：56C 二甲苯：石蜡（1 : 1）1-2小时；石蜡1-2小时；石蜡1-2小时方法二：1）常温加蜡至饱和（大概加6-7快）；2）35C加蜡块3-6h，不溶为止，可过夜3）60C盖瓶盖2h（3-4块）,开盖6h （溶液是原来的2倍，占瓶子2/3）,至二甲苯完全挥发，可过夜4）纯蜡（60C -65C）2h5）纯蜡（60C -65C）2h5、包埋准备包埋蜡：硬蜡（56~58C或60~62C）为好，所用的石蜡要求透明无杂质，新的石蜡要反复熔凝，并有一定的粘韧性。
②折纸盒，写好标签。
③点燃酒精灯，准备好无齿尖镊子④在纸盒中倒入56C -58C的石蜡，然后用无齿镊子取组织块放入石蜡中，置好方向。
石蜡切片的制作及HE染色课件
取材的大小和厚度也会影响后续 的切片制作，一般而言，组织块 的大小应为2-3cm³，厚度在24mm之间。
固定
固定是为了防止组织自溶和腐败，保 持组织细胞的形态和结构。常用的固 定剂有甲醛、乙醇、丙酮等。
固定时需要将组织放入适当的固定液 中，固定时间一般为1-24小时，具体 时间根据组织类型和大小而定。
04
石蜡切片制作及HE染色的质量控制
切片厚度控制
切片厚度
石蜡切片的厚度应控制在2-5微米之间， 过薄或过厚都会影响染色效果和显微镜 观察。
VS
切片均匀度
确保切片厚薄均匀，无裂痕或气泡，以提 高染色和观察的准确性。
染色浓度与时间控制
染色浓度
根据组织类型和染色需求，选择合适的染色浓度，以达到最佳染色效果。
01
02
03
04
防止脱片
在染色过程中要保持切片的湿 润，避免脱片。
控制染色时间
染色时间不宜过长或过短，应 根据实际情况进行调整，以达
到最佳染色效果。
注意染液浓度
染液的浓度要适中，过浓或过 淡都会影响染色效果。
避免污染
在染色过程中要保持染缸的清 洁，避免污染影响染色效果。
03
石蜡切片HE染色结果分析
浸蜡
浸蜡是为了将石蜡渗透到组织中，使组织变得硬固，以便 切片。常用的石蜡有固体石蜡和液体石蜡。
浸蜡时需要将组织放入适当的石蜡中，时间一般为1-2小 时，具体时间根据组织类型和大小而定。
包埋
包埋是将组织用石蜡包裹起来，以便 切片。包埋时需要将组织放入包埋盒 中，并确保组织平整、无气泡。
包埋盒需要用标签标记清楚，以便后 续的切片和观察。
染色时间
染色时间的长短也会影响染色效果，时间过短会使染色不明显，时间过长则可能导致染 色过度。
石蜡切片制作
石蜡切片制作及HE染色取材→固定→冲水→脱水→透明→浸蜡→石蜡包埋→切片→染色→封固1、取材：大小：1cm× 1cm×0.5cm2、固定：固定液的量要充足，应为固定组织的10倍。
组织固定的时间要足够，根据标本体积大小不同，固定时间应有所不同，组织越大越厚，固定时间应越长，反之。
一般4—12小时或更长。
在温箱内将固定液稍加温，可使固定作用加快而缩短固定时间。
在甲醛溶液中短时固定的标本，冲洗时间在10分钟至2小时即可，但固定时间较长的标本需要较长时间的流水冲洗。
一般要冲洗24小时，甚至延长48小时，否则，由于甲酸的沉淀将会影响染色的结果。
10%福尔马林的组成系；甲醛溶液：10ml、水：90 ml3、脱水、透明：（先洗涤固定的组织）脱水:应该先从浓度较低的酒精开始，然后递增其浓度，这样可以避免组织过度收缩。
70%乙醇I 、II（各30min）→80%乙醇I 、II（各30min）→90%乙醇I 、II（各30min）→100%乙醇I 、II （各30min）透明:组织在二甲苯中时间不宜过长，否则组织容易变脆变硬，一般是达到组织的透明为度，小块组织在半至一小时内透明。
二甲苯， I 、II 各30min4、浸蜡：组织经媒剂的透明作用之后，移入熔化的石蜡内浸渍，石蜡逐渐浸入组织间隙，取代透明剂，这一程序就叫浸蜡.石蜡不应含有尘粒，杂质及其他异物，不含水分，质地均匀成半透明状，触之感觉滑而不腻，结晶及颗粒少。
组织浸蜡时间也应视组织种类大小和结构不同而异。
为了尽可能排除透明剂，浸蜡可以分两级或三级进行。
以熔点较低的软石蜡作为第一步，然后再换为熔点较高的石蜡作为第二步，第三步。
浸蜡时间1－4小时，或更长，并使之过夜则较易切割，如此浸渍的组织切片在干燥箱内干燥也不易卷曲和龟裂。
软蜡（1h）硬蜡（1h）5、包埋：硬蜡※手工包埋的步骤如下：1）.组织浸入石蜡后，包埋前将组织移入包埋用石蜡杯内。
从恒温箱取出置于三角架上，其下点燃酒精灯，以保持石蜡的溶解状态。
石蜡切片的制作
石蜡切片的制作1、取材根据实验要求从标本中切取适当位置和大小的组织块，大小以1.5cm×1.5cm×（0.2-0.3）cm为宜。
2、固定标本从活体取下后应及时固定，根据组织块大小确定固定时间。
固定液为10%中性福尔马林，一般固定时间为24小时内。
其作用主要有一、能防止细菌的腐蚀和组织的自溶；二、保存细胞固有的物质，能凝固或沉淀细胞内或组织液，糖元等；三、使组织硬化，便于切块。
3、脱水把含于组织内或细胞内的水份用脱水剂把其置换出来的过程称组织脱水。
现在大多数用的是酒精来脱水，但是酒精容易使组织硬化和变脆。
因此在使用时，通常是从低浓度至高浓度，浓度系列一般是70%、80%、90%、95%和100%。
水与二甲苯不互溶，因此水未脱完全进入二甲苯会出现白雾状现象。
操作步骤如下：①75%乙醇：1h。
②85%乙醇：1h。
③95%乙醇Ⅰ：1h。
④95%乙醇Ⅱ：1h。
⑤无水乙醇Ⅰ：1.5h。
⑥无水乙醇Ⅱ：1.5h。
4、透明组织经过一系列酒精的处理后，虽然组织里所含有的水分已基本上被脱去，但是组织脱水时机里可残留着许多酒精，酒精不能溶解石蜡，必须寻找一种既能与酒精混合，又能溶解石蜡的试剂，方能使石蜡浸入到组织中去，这类物质被称为透明剂。
二甲苯是目前最常用的透明剂。
二甲苯对组织的硬化程度特强，如果在其放置过长，就会引起组织的硬脆，难切片。
操作步骤如下：①二甲苯Ⅰ：20min。
②二甲苯Ⅱ：30min。
5、浸蜡组织经过透明剂的完全透明后，被放于65 c左右熔化的石蜡中浸渍的过程称为浸蜡。
操作步骤如下：①石蜡Ⅰ：30min。
②石蜡Ⅱ：1h。
③石蜡Ⅲ：1h。
6、包埋包埋前必须确定包埋机中的石蜡已融化，并打开冷冻台。
①将待包埋的标本至于包埋机两侧的槽内（避免标本石蜡凝固），仔细看清号码，从最前面的号码开始包。
②将包埋模具放于包埋机出蜡口。
③用镊子将包埋盒从脱水篮中拿出。
④用手将包埋盒盖子打开。
⑤更换镊子。
⑥将组织放入包埋模、压平。
石蜡切片和HE染色详细步骤
石蜡切片和HE染色详细步骤
一、石蜡切片制备
1、收集样品：根据样品的性质和形状，选择适当的采样工具和采样
容器，将样品采集到容品中并制冷处理，以防止样品发生腐败。
2、石蜡制备：在制作石蜡切片之前应先量出所需的石蜡，并将其放
入容器中，然后加入酒精等助剂加热溶解，当石蜡完全溶解熔融后，用桶
或温度控制的水浴加热，随着温度的升高，搅拌均匀，使石蜡液完全熔化，熔化后即可用于制作石蜡切片。
3、制备切片：将样品置于熔融石蜡中，用切片机将样品切成指定的
厚度，以便用于染色；将薄片分类清洗，用干净的棉棒涂上几滴石蜡，使
其连接牢固，然后放在凉爽的干燥地方。
二、HE染色
1、润湿：将样品片放入石蜡解决液，轻轻摩擦，使其充分润湿。
2、酒精消切：将石蜡解决液滴入被润湿的样品片，轻轻摇晃，完成
样品的酒精消切。
3、甲醛处理：将样品片放入含醛的苯乙酮溶液中，经摇晃后再放入95%乙醇中搅拌，使样品片可以完全吸收醛，促使样品受醛处理，使样品
片充分脱脂，加快染色效果和特殊部位的显示。
4、HE染色：将脱脂的样品片放入无菌玻璃容器内。
石蜡切片制作过程(番红固绿)
番红固绿染色法制取水稻茎穗部石蜡切片1.苯胺番红溶液配制：番红：5g；95%酒精：50ml；苯胺油：20ml；蒸馏水：100ml先将番红溶于95%酒精，使其充分溶解后加入苯胺油，充分搅拌，再加入蒸馏水，过滤备用。
2.苯胺固绿染色液配制：固绿：1g；无水酒精：100ml；苯胺油：4ml 先将固绿溶于无水酒精中，使其充分溶解后过滤，再加入苯胺油即成。
（苯胺油具毒，不能与粘膜接触）3.番红——固绿双重染色法适用于高等植物根，茎，叶的染色，染色结果是木质化的细胞壁及核呈红色，薄壁细胞，细胞质等呈绿色。
步骤如下：固定后的水稻茎穗部流水冲洗24h番红苯胺液染色3天系列脱水，透明，包埋切片，粘片，烘片纯二甲苯脱蜡（蜡脱完为止）1/2二甲苯+1/2纯酒精对半混合液5-10分钟纯酒精5分钟饱和苦味酸95%酒精溶液分色（镜检适度）纯酒精冲洗1分钟固绿酒精苯胺溶液复染1分钟纯酒精冲洗1分钟1/2二甲苯+1/2纯酒精对半混合液5分钟纯二甲苯5分钟封片4.脱水：按照以下乙醇质量分数梯度进行脱水，括号里面的是每一级的时间：30%（15min）→50%（15min）→70%（15min，如果当天做不完可将材料放入其中过夜，第二天再处理）→83%（30min，用83%代替85%是因为83%正好处于85%与95%之间，效果最好）→90%（30min）→100%（15min）→100%（15min）→1/2酒精+1/2二甲苯35.透明：（1）滴加纯二甲苯至与100%乙醇等量，此时二甲苯占总体积的1/2；（若此时溶液变浑浊，证明脱水不彻底，要重新退回到100%乙醇中）；（2）再滴加二甲苯超过100%乙醇的量，此时乙醇占总体积的1/3，二甲苯占总体积的2/3；（3）换纯二甲苯直到材料变得透明为止。
6.浸蜡与包埋：（1）室温浸蜡：往含有二甲苯及已经透明材料的坩埚中加入蜡屑至过饱和，放置3d或者更长（“更长”的意思是做到这一步可以停下来，以后可以想什么时候做下面的步骤都行）。
石蜡切片制备基本步骤
石蜡切片制备基本步骤一、准备工作（一）（一）洗涤实验所需器皿：（玻璃器皿的清洗）1、用洗衣粉将玻璃器皿表里擦洗干净反复洗刷2、将器皿在自来水下冲洗干净3、将器皿倒扣在铺有吸水纸或纱布的桌子上控干注：一般情况下，经以上步骤后，用蒸馏水洗过1~3次即可烘干备用，如果做特殊染色还需浸泡在酸性清洁液内12~24小时，再经自来水彻底冲洗，再用蒸馏水过洗1~3次烘干备用。
（二）配制：硫酸洗液的配制清洁液（洗液）的配制：成分强酸液次强酸液弱酸液浓硫酸（ml）1000 200 100重铬酸钾（mg）63 120 100蒸馏水（ml）200 200 1000重铬酸钾1200g蒸馏水2000ml将2000ml浓硫酸缓缓倒入上述溶液中，边倒边用木棒轻轻搅拌（三）载玻片与盖玻片的处理1. 将所需载玻片与盖玻片清洗后，放入硫酸重铬酸钾溶液中浸泡24小时2. 流水冲洗，再用蒸馏水冲洗3遍3. 95%~100%酒精浸泡24小时，用绸布擦干备用注：在将载玻片与盖玻片放入清洁液中时，要一片片地投入，使其不致重叠。
二、准备工作（二）常用液体的配制（一）缓冲溶液：1．磷酸盐缓冲液A液：0.1mol/L磷酸二氢钠B液：0.1mol/L磷酸氢二钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（3：7≈PH7.0）2．枸椽酸缓冲溶液A液：0.1mol/L枸椽酸B液：0.1mol/L枸椽酸钠A液与B液按比例混合调整到所需的PH值（6.2：42.8≈PH6.2）（二）固定剂：1．甲醛：10%甲醛福尔马林100ml蒸馏水900ml注：实际甲醛含量只有3.6~4.0%但习惯上都将其视为10%。
2．10％中性福尔马林钙固定液甲醛液10ml蒸馏水90ml加碳酸钙至过饱和(以容器底部碳酸钙沉淀1~2cm厚为适度)充分振荡混合后，放置24小时取上清液使用。
3．4%多聚甲醛：8%多聚甲醛多聚甲醛8g蒸馏水100ml加温至60℃左右，不时搅拌，成为乳白色溶液。
滴加1N NaOH，并不停搅动至液体清明。
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3.洗涤与脱水
• 固定后的组织材料需除去留在组织内的固 定液及其结晶沉淀，否则会影响以后的染 色效果。 • 水和透明剂不能互溶，只有脱去水分后， 才能让透明剂进入。
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• 凡用酒精配制的固定液，一律用同浓度的酒
清洗。
• 酒精为常用脱水剂，它既能与水相混合，又
能与透明剂相混，为了减少组织材料的急剧
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名称 戊二 醛
优点
缺点
常用的非凝固型固定剂。 特点：固定蛋白质；可以部分 保持酶和蛋白质的活性。 固定能力比甲醛强。 常用于电镜制片的固定。 锇酸 能良好固定细胞的细微构造， OsO4 是脂肪类的唯一固定剂。用于 电镜的超薄切片中作为主要的 固定剂。
不能保存脂肪， 对细胞膜的显 示较差。
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取材原则： • 动作------快，轻，用力均匀 • 体积合适 • 刀要锋利
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• 2.固定 • 目的---保持原来的结构
• 固定液 • 固定时间 • 固定后的处理
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名称 优点 缺点 95%酒精 材料固定后无需冲洗就 原生质收缩，但仍 可以脱水，使用简便， 然能保持细胞壁 固定糖原和核酸 的形状 甲醛 市面出售为饱和液，浓 材料易收缩。渗透 福尔马 度为40%，又称福尔 力慢。与酒精混 林 马林，是很好的硬化 合，可以阻止材 剂， 料过于坚硬 渗透力强而快，能溶解 组织发胀，可阻止 冰醋酸 脂肪，可保存蛋白质 酒精、甲醛等引 H3COOH 不变质，是染色体很 起的收缩 好的保存剂
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ.浸蜡与包埋
• 用石蜡取代透明剂，使石蜡浸入组织而起 支持作用。 • 通常先把组织材料块放在熔化的石蜡和二 甲苯的等量混合液浸渍1～2小时或者过夜， 再先后移入熔化的石蜡液中浸渍几天 • 浸蜡应在高于石蜡熔点3℃左右的温箱中进 行，以利石蜡浸入组织内。
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• 石蜡特点：熔点：45-50℃ 软蜡 • 55-60℃ 硬蜡 • 材料较硬的，用熔点较高的石蜡包埋； • 切片较薄时（在8微米以下），用熔点较高 的石蜡包埋； • 夏季采用熔点较高的石蜡（56,58）,冬季宜 选用熔点较低的石蜡（52,54）。
收缩，应使用从低浓度到高浓度递增的顺序
进行.
• 30%--50%---70%---85%---95%--100%--100% 每步30-60分钟左右。
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要求及注意：
• 保证脱水梯度和每一步脱水时间，水要完全 脱净， • 不同大小的组织块脱水时间不同。 • 不能过度脱水（过久使组织变脆, 收缩） • 在酒精中加入曙红，用于染色。 • 材料可以放在70％酒精中保存， • 正丁醇、叔丁醇、丙酮等也可做脱水剂。
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卡诺氏(Carnoy‘s)固定液
有极快的渗透力， • 固定根尖和花药只需40-60分钟，时间太长不好(不 能超一天)。 • 固定后用95％酒精冲洗，在组织不能立即处理时， 需转入70％酒精中保存。配法有两种：
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• 4% 多聚甲醛
---0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）配制
• 该固定剂较适于光镜免疫细胞化学研究， 继续浸泡固定2～24h（4度）。 • 另外，该固定剂较为温和，适于组织标本 的较长期保存。
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配制方法
• 称取40g多聚甲醛，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液，加热至60℃左右， 持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，
通常需滴加少许1M NaOH才能使溶液清亮，
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4.透明
• 纯酒精不能与石蜡相溶，还需用能与酒精 和石蜡相溶的媒浸液，替换出组织内的酒 精。材料块在这类媒浸液中浸渍，出现透 明状态，此液即称透明剂，透明剂浸渍过 程称透明。 • 常用的透明剂有二甲苯、苯、氯仿、正丁 醇等，各种透明剂均是石蜡的溶剂。
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• 通常组织先经纯酒精和透明剂各半的混合液 浸渍1～2小时，再转入纯透明剂中浸渍。 • 材料进入无水的透明剂中后，若透明剂变浑 浊，说明材料中的水分未脱干净，必须回到 前面一级无水的脱水剂中再次脱水（但是效 果往往不好）。 • 透明剂的浸渍时间则要根据组织材料块大小 及组织特性而定。 • 如果透明时间过短或者过长，都不合适。
是目前最昂贵最好 的固定剂。 渗透力很弱，所以 材料越小越好。
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混合固定剂
• 固定组织时，单独使用一种固定剂很难对 组织成分有理想的固定效果。通常几种固 定剂混用，制成混合固定剂。以求得补偿 某试剂对组织所致的缺陷。
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F.A.A固定液
• 最常用的固定液。固定时间，不受限制，短 为24小时，长可延至数月或数年。 • [配法]－－－－ 50％或70％酒精－－90毫升 冰醋酸 －－－－－－5毫升 福尔马林－－－－－ 5毫升 柔软材料用50％酒精，坚硬材料用70％酒精 配制。
最后定容1000ml，充分混匀。
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固定组织时应注意：
• ①保持组织新鲜，勿使其干燥，尽快固定处 理。 • ②组织块不易过大过厚，厚度必须控制在 0.3cm以内。 • ③固定液必须有足够的量，一般大于组织20 倍以上。 • (4) 抽气：使固定液尽快渗入材料内部，并 排除材料内气泡的干扰
石蜡切片的制作
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植物制片的基本步骤 •1、取材 •2、杀死、固定、保存 •3、脱水、置换 •4、渗透、包埋 •5、切片、粘片 •6、染色、封固 需要时间长（十几天），但可长期保存。
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• 1.取材
• • • • • 材料来源及部位。 ①种类： ②部位： ③年龄或发育阶段 ④是观察横切面还是纵切面？
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固定时间的选择
• 不同的固定液。 • 材料的大小，组织的特性与致密度。 • 温度的不同。
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组织固定后的处理
• 冲洗或漂洗：组织固定后应充分水洗，去除 固定液造成的人为假象。 • 修块:大小合适、去除形态不好的部分， • 材料经过固定后，需要保存下来以备利用， 通常使用的保存剂是70%的酒精溶液，可以 使一般的材料保存较长的时间而不至于变坏。 • 通常在4度冰箱中存放。
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石蜡的处理：