如何预防细胞培养中的黑胶虫污染

如何预防细胞培养中的黑胶虫污染污染是细胞培养的大敌。

预防和避免污染是细胞培养成功的关键之一。

一开始就要十分重视，防止污染，否则会前功尽弃，不仅浪费时间，而且浪费人力、物力，甚至造成无法弥补的损失。

细胞培养中常见的生物污染类型有7种，分别是细菌污染、支原体污染、原虫污染、黑胶虫污染、真菌污染、病毒污染以及非细胞污染。

他们在细胞培养中污染的特点如下：1、细菌：细菌在普通倒置显微镜下为黑色细沙状，根据感染细菌的不同，可有不同的外形，培养液一般会浑浊变黄，对细胞生长影响明显。

2、支原体：黑色的，好象多为多形，培养液一般培养液一般会浑浊，原体感染，国内血清很多都没有做支原体阴性检测，而支原体是牛血清中最常见的微生物之一。

而且它不能用过滤的办法除去。

支原体感染细胞以后，细胞病变不很明显，只是慢慢死去。

3、黑胶虫：可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去，培养液也是不浑的，一般不会太影响，细胞还是可以用的。

常常是细胞生长状态良好，且观测到的运动物无明显增多，且培养液颜色、透明度无明显变化，可在同一批号的血清养的细胞中发现类似现象。

对细胞生长状态不会有明显影响，在细胞增殖旺盛之后会自然消失，除更换血清外无须特殊处理。

4、真菌：一般培养液清亮，不变色，镜下有丝状物，有些真菌开始很像死细胞碎片，只是它很多很多的小块很清楚，象珊瑚状，不象细胞碎片分不清，慢慢的会长出很细的黑色丝状物。

真菌生长的比较慢，不象细菌那么容易被发现，但是一旦发现有它的存在细胞就被污染了，也很难救活了。

5、原虫：培养液可轻微浑浊，显微镜下那些细小的点状物数量非常多，轻微活动，细胞虽然可以生长但繁殖速度却明显减慢，而且细胞状态不好，边缘不清楚，细胞不透亮。

他们与细胞可共生但会与细胞争夺营养。

这种共生是非常普遍的，但他们的数量小，细胞站优势所以不会影响到细胞的正常生长，只有当他们到达一定的数量时就会影响到细胞的生长，最终形成恶性循环。

6、病毒：组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。

目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。

尽管病毒污染的细胞不影响原代培养，但生产疫苗是不安全的。

因此，潜在病毒是细胞大量生产和疫苗、干扰素等生物制品制作中的难题7、非同种细胞污染：即是细胞交叉污染，由于细胞培养操作时各细胞株所需的器材和溶液没有严格分开，往往会使一种细胞被另一种细胞污染。

目前，世界上已有几十种细胞都被HeLa细胞所污染，致使许多实验宣告无效。

非细胞培养物所造成的化学成分的污染也偶有发生，大多是由于细胞培养所需物品清洗消毒不彻底而带入一些有毒化学物质所致。

在上述的八种污染物中，黑胶虫是现代细胞培养中讨论比较多的，但大多数文献未对其进行描述或一带而过，就像上面关于描述黑胶虫的情况是不完整，还有很多不明的情况。

对其身份有多种猜测，到现在都没有权威地对黑胶虫进行分类学上的归类。

黑胶虫到底是不是一种生物，如果是那黑胶虫会是何种生物，如果不是，那黑胶虫会是什么?一系列的问题都悬在奋斗在细胞生物学领域的学者们的心中。

一、关于黑胶虫的描述1、分类上的描述对于黑胶虫的分类，学术界没有明确给予说法。

关于黑胶虫的分类，目前大部分人认为黑胶虫污染是微生物感染。

在一些文章论述上把黑胶虫归为生物污染类型，但是没把它归为确定的生物分类类型，只是把黑胶虫独立为一种未知生物。

而根据中国病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，但是由于课题经费不够而不能继续下去，最终也没有有力证明黑胶虫是属于原虫。

也有一些学者不认为所谓的黑胶虫污染是一种生物污染，而认为是细胞碎片类物质，是在细胞培养时，细胞衰亡破裂产生的;也有在文献中报道说是玻璃瓶中类似氧化硅的物质，那个文献很少人找得到;还有报道黒胶虫是一种纳米级的细菌。

2、形态上的描述形态上类似与杆状细菌，但长度比细菌长，直径约在0.5~1微米，不染色观察为黑色;胶虫成熟后呈线状，而且形态是椭圆形。

3、运动形式在400X倒置显微镜小，有典型的布朗运动(不规则的原地小距离抖动)，即很多细胞培养者看到的，像黑色的小虫游来游去。

可以穿透滤膜，也可以通过空气传播，低倍下为黑色点状，高倍下可看见黑色的小虫游来游去。

但是在物理学上来说，颗粒足够小，在液体中也是做布朗运动的，这不足以说明黑胶虫的布朗运动就证明它是生物。

4、生理上的描述(1)抗性抗细菌和抗霉菌的药物对黑胶虫均无效，可以保守的判定黑胶虫不属于细菌。

(2)环境抗逆性将培养器材150度烘烤8小时，可以消除，这个黑胶虫高压灭菌泡酸都不死。

可见黑胶虫可以耐高温高压，而且还有点嗜酸，如果证实它是生物的话，那它很有可能是极端微生物，一种古菌。

(3)营养条件“黑胶虫”可寄生于动物细胞，也可以生存于培养基中，依靠细胞和培养基中的营养为生，并随细胞传代而传代。

可见“黑胶虫”是一种异养生物。

二、对黑胶虫的各种猜测及相应的处理1、非生物类(1)细胞碎片类在细胞培养的时候，由于细胞代谢、物质交换、周边环境变化，尤其是在从37度培养箱中拿出来观察的过程中，由于液体培养基的比热较大，液内温度高于外界温度，造成冷热交换、小范围内形成液体流动加剧，当然这些小岁末就会被搅动起来形成似乎“游动”的感觉;随着细胞培养的继续，部分细胞开始衰亡，细胞膜结构破裂，破裂之后的细胞内容物泄露到培养液中。

尤其是溶酶体的破坏，连续性地造成其他细胞和细胞器的损伤，如果换液不很勤，又会出现进一步破坏和残渣的出现;再者，“黑焦虫”问题是很多细胞培养者已经发现的问题，但到目前为止尚未找到其监测和排除的试剂和手段，这首先是由于所谓“黑焦虫”病原体根本难以收集和捕捉，这也从另一个侧面证明了“黑焦虫”问题的难以确定性;再说任何一种外来的微生物在微生物培养基中都会有生命活动的反应和表现，而不是简单地运动那样的外观性表现。

举一个例子：如果“黑焦虫”的运动状况已经到了用显微镜已经可以观察出的程度，其营养代谢和能量需求也就可想而知。

这样，培养液中的影响消耗、酸碱含量程度等都要发生明显变化。

比如说：迅速的、大含量的沉淀， pH值的迅速下降，细胞大量破碎死亡、引发其它类型微生物侵染等等。

而这些状况，在所谓的“黑焦虫”感染中，是很难观察到的。

同时“黑焦虫”的出现而影响细胞状态似乎得不到有力的证据。

倒是细胞状态下降的时候，“黑焦虫”明显增多了。

很有可能是细胞状态下降时，细胞衰亡产生的细胞碎片。

所以黑胶虫属于细胞碎片是比较可能和合理的。

(2)玻璃培养瓶中的类似氧化硅的东西网上有一篇文章说，黑胶虫其实不是一种生物，是无机物，其本质是玻璃培养瓶里的硅颗粒。

可影响细胞生长，细胞状态好时，不明显。

细胞状态较差，数量少时才容易看到，最好的办法是用一次性培养瓶，可消除黑胶虫影响。

(3)血清聚合物产物gibco公司的血清说明，此物为血清聚合产物，而不是微生物。

2、生物类(1)支原体有人曾认为黑胶可能是支原体污染，因为相对比较权威的网站文章指出，黑胶虫可以通过滤膜，可以在空气中传播。

而恰巧口腔支原体为人体口腔中之正常菌丛，所以实验室之操作人员的污染亦可能为支原体的污染源。

但有人为此做了实验证明黑胶虫不会是支原体，原因如下：光镜下可见, 因为体积不对，支原体在普通显微镜下不能看到;多种染色后可见，甚至hoechst即能将它染色,一般来说支原体用普通染色法不易着色，用姬姆萨染色很浅，革兰染色为阴性。

所以，黑胶虫是一种支原体的可能性比较小。

(2)真菌有很多人发现类似黑胶虫的，但最后确定是真菌，二性霉素B对其有效。

那说明黑胶虫不存在只是细胞培养中的真菌感染，还是说明黑胶虫污染属于真菌类污染物。

如果黑胶虫是一种真菌，那么由此引起的污染是不会引起那么多人的关注，即使它很特殊。

但是这不能排除那些认为“黑胶虫”是真菌的细胞者，看到的只是一般真菌感染。

由于细胞被感染了，要进行拯救处理，不像理论上那么简单，稍有不注意都是很容易导致培养失败，所以黑胶虫是一种真菌也是不太可能。

(3)寄生类原虫黑胶虫属于寄生类的原虫，而不是细菌、支原体，也不是什么补体、细胞碎片或蛋白沉淀。

有人在400倍以上的高倍镜下可以清楚的看到胶虫有两种不同形态，一种较大，运动较慢，泛红光;另一种较小，运动较快，红中带绿，个小的围着个大的分布，很可能是公的围着雌的。

这种生物也并非离开细胞就不能存活，也有人做过这样的试验，单纯培养过污染胶虫的血清4周，直到满视野都是黑煤渣般的胶虫。

给人的感觉是胶虫和细胞一样有丛集性，如果胶虫密度低则生长缓慢，如果手懒，拖了几天没换液，待胶虫生长到一定浓度后便会飞速分生，细胞受感染的程度也大，这时除了培养基中可见外，细胞表面通常也象长满了粉刺，所以有人认为细胞旁分泌的某些因子可以抑制胶虫的生长。

据说，中国病毒所和军科院鉴定是一种寄生于牛血清内的一种原虫，似乎和草履虫和变形虫有类似之处，然而由于课题经费不够而不能继续进行下去。

由此黑胶虫属于原虫的有比较大的可能性。

三、关于黑胶虫出现的几种情况1、“黑胶虫”的出现常在培养条件改变、细胞接种密度降低、细胞状态不佳时显现并使实验中断，尤其在冻存细胞复苏时可造成大量细胞死亡。

就是在细胞生长状态不良时，黑胶虫容易出现。

“黑胶虫”生长与细胞的生长有此消彼长的关系，即当细胞状态好时小黑点会相应的减少;反之则增加，似乎有细胞竞争生长的关系，但总的来说它的出现似乎并不影响细胞的生长。

2、细胞刚用的时候，观察均生长良好，密度适中，培养液清亮，小黑点一般不出现，但是对细胞传代以后就陆续出现多少不等的小黑点，有时候在一夜之间暴长。

细胞进过多次传代的情况下，也会使黑胶虫出现。

3、换用了其他公司的血清，多是北方公司的血清，就出现了这种非常类似这里的”黑胶虫“的情况。

在北京医科大学/中国协和医科大学联合出版社出版的《现代实验血液学研究方法与技术》书中关于检查血清中写道，“我国北方小牛血清还多见黑胶虫污染”。

其实在很多，遭遇黑胶虫的案例中，大部分细胞培养者都认为黑胶虫来源于血清。

四、关于再细胞培养中出现黑胶虫后的几种处理建议1、换好一点的血清，当然最好是进口胎牛血清(国产血清太脏)，就是价格高的离谱，经济条件不允许，可以用进口新生牛血清代替。

建议如果使用的是Wisent或GIBCO的血清可不必灭活，这样可以有效减少“小黑点”的形成。

一般的血清都不要去灭活处理，为什么呢?我公司在上次(细胞培养注意事项，您懂的)详细介绍过：经过正确处理的热灭活血清，对大多数的细胞而言是不需要的。

经此处理过的血清对细胞的生长只有微小的促进，或完全没有任何作用，甚至通常因为高温处理影响了血清的质量，而造成细胞生长速率的降低。

而经过热灭活的血清，沉淀物的形成会显著增多，这些沉淀物在倒置显微镜下观察，像是“小黑点”，常常会让研究者误以为是血清遭受污染，而把血清放在37℃环境中，又会使此沉淀物更增多，使研究者误认为是微生物的分裂扩增。