生物存储构建美国生物资源库

生物存储：构建美国生物资源库

方宇宁/编译

一些规模较大的生物库投资建立了样本跟踪、存储和检索的自动化系统，同时确保样本保存在某个恒

定的温度条件下

●数据资料丰富的高品质生物样本是未来科学研究必不可少的。但是，获取和存储这些样本却并不如人们所想象的那么简单。对于生物库的建设来说，最困难的问题也许还是资金问题。

如今，世界各地的冰柜或橱架上放满了许多人体标本，这就是一般所称的“生物银行”或“生物库”：将各种生物组织保存起来，供以后研究之用。这样的生物库包罗万象，其规模和所涉及的范围无比庞大，有来自普通人群的，有来自手术患者或活检患者的，也有来自刚死亡之人的。有些样本收藏可追溯到几十年前。例如，对原住民基因测序的一绺头发就来自于上世纪20年代英国人类学家阿尔弗雷德·C·哈登（Alfred C.Haddon）之手。哈顿从世界各地收集到的许多样本如今都保存在英国剑桥大学。

样本多为干血样或冷冻血样，也包括其他一些机体组织，如眼睛、大脑和指甲等。生物库的样本收集是根据不同需求而有所侧重，例如，以不同人群为基础的生物库收集的干血样本和健康数据用于确定乳腺癌遗传危险因素，而疾病生物库收集的肿瘤样本则用于揭示乳腺癌的不同分子形式。

仅储存在美国生物库的组织样本其数量在世纪之交估计已超过了3亿，并以每年2 000万样本的速度在增加。明尼苏达大学生物资源保存中心负责人艾利森·胡贝尔（Allison Hubel）称，根据兰德公司的报告，这些数字很可能被低估了。

即使如此，许多科学家还是提出他们无法获得足够的样本。在2011年对700多名癌症研究人员的调查发现，47％的研究人员说很难找到他们需要的样本，81％的人称他们的研究范围因此而受到限制，60％的人则表示他们因此对自己的研究结果持怀疑态度。

过去，研究人员在显微镜下检查生物标本，或对少数化学成分进行测试分析，现如今，他们研究的对象是成千上百个分子，其中包括DNA、RNA、蛋白质和代谢物等。尤其是以基因组为基础的各种研究正在普及，研究人员需要从中寻找遗传标记，需要更多的样本进行测量。“在过去20年里，生物医学研究人员

利用生物标本的方式已发生了根本性的变化，”美国国家癌症研究所(NCI)的样本品质专家斯蒂芬·休伊特（Stephen Hewitt）说道。

温度之波动

“生物样本如果不经过适当的处理，其作用就可能受到限制，”马萨诸塞州剑桥博德研究所的克里斯汀·阿迪利（Kristin Ardlie）说道。她回忆起一个从胎盘组织样本分离RNA的项目，由于样本中含有太多的降解酶，经过多次分离均未能成功。原来研究人员起先将该样本放在-20℃的冰柜里，几个小时后再将样本转移到符合条件的-80℃的冰柜中。

液氮冷冻以阻止样本降解

“他们可能认为‘冷冻不就是冷冻嘛’，”阿迪利说道，但一般的冰箱温度并不足以阻止酶的降解。除了DNA之外，几乎没有生物分子能在-20℃的温度条件下保存完好。大多数样本可在-80℃的条件保存完好，但某些样本，如活细胞，必须保存在接近-200℃的温度条件下。只有在这样的低温条件下，酶的所有活动才会完全停止。

以不可预知的方式产生变化的分析物比没有任何分析物更为糟糕。一项研究表明，在对两个肿瘤标志物样本进行比较时发现，当场收集的血清与经过冷冻处理并在十年后解冻的血清比较，后者浓度增加了15％左右。在另一项模拟长期冷冻影响的实验中，研究人员检测了冷冻后再解冻其血清中多种肿瘤标志物的变化情况，一些蛋白质生物标记在几十年里，甚至经过多次冷冻解冻，似乎仍然保持稳定不变。然而，血管内皮生长因子——一种与糖尿病、关节炎和癌症等有关联的生物标志物，却是非常的不稳定，不适宜用冻结样本进行分析。

瑞士生物库顾问丹尼尔·S-杜巴切（Daniel S-Dubach）说道，样本是否已解冻过用以研究，然后再次保存，这不是所有的生物库都有记录的，对冷冻温度进行监测，也不是所有的生物库都能做到的。即使是短期的温度波动，都会使样本形成破坏性的冰晶。杜巴切曾看到研究人员为炫耀他们的样本，将冰箱门敝开了好几分钟。

冷储与技术

马萨诸塞州霍普金顿的汉密尔顿存储技术公司可容纳25万至1 000万个样本，在存取样本时，研究人员不需打开冰柜门，只需将样本试管放置在冰柜的一个传递口处，机械臂会将其移至内部的存储架上。研

究人员甚至可以通过实验室的信息管理系统寻找所需的某个特定样本，根据他们的要求，系统进行检索并将检索到的样本存放在传递口处，完毕后，系统会通过电子邮件通知研究人员来取。温度保持在-80℃的

冷冻系统还能够记录样本的存取次数，以及使用多长时间。

即使不考虑配置这类先进的冷冻设备，冷冻储存的成本也是十分昂贵的。NCI生物样本库的吉姆·沃特（Jim Vaught）说道，一次典型的流行病学研究项目就有可能产生1万名患者的10万份样本，需要5个冰柜存放，单个冰柜每年正常使用的成本达6 000美元。虽然冷冻被认为是保存生物分子和活细胞的最好方式，但其外形却有可能被破坏。

为了降低存储成本，大多数研究人员采用的是一个多世纪前的保鲜技术：将取自病人的机体组织浸泡在防腐剂福尔马林中，一些固形组织则嵌放在石蜡块中。马里兰州银泉联合病理中心至今保存了2 800万件嵌放在石蜡块中的样本，有的样本可追溯到一战期间。然而，从石蜡块中取出一小片组织薄片经染色后在显微镜下观察的方法不能有效保存生物大分子，这些生物组织细胞因缺氧而导致RNA降解，蛋白质发生变化，包括福尔马林也会致RNA和DNA遭到破坏。当研究人员试图恢复生物大分子，在去除石蜡时还会造成更多的破坏。

虽然从石蜡中可以提取DNA和RNA，但无法保证质量。销售室温条件下存放DNA和RNA专用设备的加州IntegenX公司副总裁迈克·霍根（Mike Hogan）认为，生物分子退化的原因并非直接源自于福尔马林，而是因为水解和氧化。冷冻能够让样本长期保存，是因为在较低温度条件下降解作用变得更加缓慢。IntegenX目前正在改进这方面的技术，旨在去除水分以减缓水解和氧化作用。如果这项技术改良成功，研究人员就能够利用福尔马林保存的样本来研究生物分子。

其他的一些改进方法则着重于在样本使用过程中如何去除福尔马林。2009年德国Qiagen公司开发的PAXgene系统产品，采用以酒精为基础的固定剂来保存生物分子，并用石蜡嵌放组织标本。该技术可使生物组织样本在室温条件下保存7天，4℃条件下保存4周，-20℃条件下保存几个月，样本形态和生物分子都不会受到损害。

这种保存方法正在替代深度冷冻。一项规模庞大的组织收集项目中有一个试点项目，其目的是利用以四种不同方式保存的几十种类型生物组织样本，进行基因表达和常见的遗传变异研究。基因型组织表达（GTEx）是美国国立卫生研究院（NIH）进行的一项合作研究项目，参与这一项目的还有选择PAXgene系统的一些研究所。美国人类基因组研究所项目总监杰弗里·斯特鲁威（Jeffrey Struewing）解释道，PAXgene 系统不仅能够保护RNA，还可免除样本收集过程中超冷保存带来的运输上的麻烦。但PAXgene系统长期保存如蛋白质这样的大分子的效果究竟如何，现在断言还为时过早。“没有任何一种保存方法能够适用于所有样本或所有分析物的。”

样本之收集

一些最棘手的困难在样本保存之前就已经存在了。NCI所辖的生物样本库和生物样本研究办公室(OBBR)负责人卡罗琳·康普顿（Carolyn Compton）说道：“生物标本是人体的一部分，从体内分离时经历了前所未有的压力。”当血液供应被切断，并暴露在突然变化的温度条件下时，细胞的行为就变得很难预料。基因表达和蛋白磷酸化发生大幅度的变化，有可能激活细胞的自毁行为。康普顿指出，研究人员必须要弄明白，样本分析结果是否真实反映了来自患者的生物学状况，“在进行一次堪称完美的检测之后，得到的却有可能是错误的结果。”