食品微生物检测方法的研究进展

食品微生物快速检测方法的研究进展
【摘要】本文从食品安全与卫生的角度出发，介绍了分子生物学方法中的核酸探针检测法、基因芯片检测法、PCR技术检测法的检测原理及优缺点、在食品微生物检测中的应用。

【关键词】食品微生物、快速、检测、分子生物学
随着世界食品开发、生产、销售的迅速发展与人们生活水平的不断提高，研究和建立食品微生物快速检测方法以加强对食品卫生安全的监测越来越受到各国科学家的重视，其关键是及时、准确地检测出食品中的微生物。

传统的检测方法准确性、灵敏性均较高，但有涉及的实验较多、操作繁琐、效率低等缺点。

近年来，微生物的快速检测和自动化研究进展声速，主要包括微生物学、分子化学、生物化学、生物物理学、免疫学和血清学等方面及其它们的结合应用。

本文主要介绍分子生物学方法中的核酸探针检测法、基因芯片检测法和PCR技术检测法
分子生物学方法
随着微生物学、生物化学和分子生物化学的飞速发展，对微生物的鉴定已不再局限于对它的外部形态结构及生理特性等一般检验上，而是从分子生物学水平上研究生物大分子，特别是核酸结构及其组成部分。

在此基础上建立的众多检测技术中，核酸探针和聚合酶链反应，以其敏感、特异、简便、快速的特点成为世人瞩目的生物技术革命的新产物，已逐步应用于信源性病原菌的检测。

1 核酸探针法
细胞核酸DNA 和RNA 是唯一一类可以传递遗传信息的大分子，而每一种病原体都有独特的核酸片段，核酸探针是带有将已知核苷酸DNA或RNA片段用同位素或其它方法标记的基因特异片段，它主要利用碱基配对原理，使互补的2条核酸单链形成双链。

根据核酸探针中核苷酸成分的不同，可将其分为DNA探针或RNA探针；根据选用基因的不同又可分为两种，一种探针能同微生物中全部DNA分子中的一部分发生反应，它对某些菌属、菌种、菌株有特异性，另一种探针只能限制性同微生物中某一基因组DNA发生杂交反应，它对某种微生物中的一种菌株或仅对微生物中某一菌属有特异性。

美国GENE-TRAK公司研制出了脱氧核糖核酸杂交筛选比色法，主要利用特异的基因探针对沙门菌、李斯特菌和大肠杆菌的rRNA进行检测。

检测步骤如下：先设计出与细菌rRNA互补的基因探针，待检样经过增菌培养后，溶解细菌并加入带有标记的探针进行液相杂交：如果待检样中存在靶细菌rRNA、荧光素标记的检测探针和多聚脱氧腺嘌呤核苷酸末端捕获将与目标rRNA序列杂交；此后，把包被多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸的固相载体测杆插入杂交溶液中，利用多聚脱氧腺嘌呤核苷酸与多聚脱氧胸腺嘧啶核苷酸间的碱基配对将杂交核酸捕获于固体载体中，并将固相载体真培养于过氧化酶-抗荧光素接合剂中，使探针上的荧光素与结合剂结合；最后，将固相载体置于酶底物-色原溶液中，使过氧化酶与底物反应，在450nm处测量吸光度值，以确定样品中是否存在靶细菌。

总的来说，核酸探针技术是一种理想的快速检测技术，它最大优势是特异性和敏感性，而且兼备组织化学染色的可见性和定位性，主要用于食品致病性病原微生物的检测。

但是也存在一定问题，如每检测一种菌就需要制备一种探针，而且目前尚未建立所有菌种的探针；要达到检测量还要对样品进行一定时间的培养；对毒素污染的食品有时因样品中不含产毒菌而无法检测出，所以该技术还有待进一步发展。

2基因芯片技术
基因芯片的基本原理是将各种寡核苷酸点样于芯片表面，微生物样品DNA经PCR扩增制备荧光标记探针，然后再与芯片上寡核苷酸点杂交，最后通过扫描仪定量和分析荧光分布模式来确定检测样品是否存在某些特定微生物。

该技术可检测各种介质中的微生物，在一次实验中检出所有潜在的致病原，也可用同一芯片检测某一致病原的各种遗传学指标，研究复杂微生物群体的基因表达。

与传统的检测方法相比，基因芯片技术的先进性主要体现在：第一基因芯片可以用实现微生物的高通量和并行检测，一次实验即可得出全部结果；第二操作简便快速，整个检测只需4h基本可以出结果（传统方法一般4～7天）；第三特异性强，敏感性高。

但它还存在一些关键的问题：①基因芯片检测过程中需要专门的仪器设备，其费用高昂，这也是该技术在国内难以推广的主要原因之一；②基因芯片检测操作复杂、费时，对操作人员的专业素质要求比较高，这极大限制其普及应用；③在样品目标物放大反应的过程中，容易造成样品的污染，也会影响检测信噪比，从而影响测定结果的灵敏度；④样品制备和标记比较复杂，没有一个统一的质量控制标准，以至于不同的人得出不同的结果。

3 聚合酶链反应法（PCR 方法）
聚合酶链式反应PCR (Polymerase Chain-Reaction1)是美国科学家Mullis于1983年发明的一种在体外快速扩增特定基因或DNA 序列的方法，故又称为基因的体外扩增法。

它利用变性与复性原理，在体外使用DNA聚合酶，在引物（引物是指与待扩增核酸片段两端互补的寡核苷酸，其本质是ssDNA（单链DNA）片段）和胶氧核糖核苷酸的参与下将模板在试管中建立反应，数小时后能将极微量的目的基因或某一特定的DNA片段扩增数十万乃至千百万倍。

即可将皮克(Pg)水平的DNA特异地扩增到能够检测的微克( g)水平，无须通过繁琐费时的基因克隆程序。

便可以获得足够数量的精确的DNA 拷贝。

被等分转入第二轮P C R 引物，扩增靶D N A 。

PCR技术以其特异性强、灵敏度高和快速准确等优点在食品微生物检测领域得以广泛应用。

PCR技术有多种形式，主要有以下几种：
（1）常规PCR检测
常规PCR技术原理是在存在DNA模板、引物、dNTP、适当缓冲液等溶液的反应混合物中，在热稳定DNA聚合酶的催化下，对一对寡核苷酸引物所界定的DNA片段进行扩增。

这种扩增是通过模板DNA、引物之间的变性、退火、延伸等等3步反应为一个周期，循环进行，使目标DNA片段得以扩增。

由于第一周期产生的DNA片段均能成为下一次先王的模板，故PCR产物以指数形式增加。

（2）多重PCR
其原理与常规PCR相同，只是在同一反应体系中加入一对以上的特异性引物，如果存在与各引物对特异性互补的模板，则可同时在同一反应管中扩增出一条以上的目前的DNA 片段。

这种方法既保留了常规PCR的特异性与敏感性，同时减少了操作步骤及试剂，实现了一次扩增的同时检测多种微生物的目的。

利用这一方法可以同时检测多个目的基因或借助其交叉限制进行确认。

但多重PCR技术存在扩增效率不高、敏感性偏低；扩增条件需要模索与协调发展；出现引物干扰等缺点。

（3）逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）
RT-PCR技术的原理是提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mPNA作为模板，采用DT或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA，再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

（4）巢式PCR
巢式PCR是指先后用两套引物进行扩增的PCR技术，用内两对引物先后扩增靶基因片段。

通常是先用第一套引物扩增15～30个循环。

由于第二套引物设计片段位于第一套引物扩增片段内，所以将第一套引物称为外引物，而把第二套引物为内引物。

巢式PCR既可增加反应的特异性，又可得到丰产的特异性靶序列，增加敏感性。

其对微生物检测和单拷贝基因靶DNA的扩增都是非常有效的。

目前PCR 技术已应用于微生物检测有三种方法：
（1）使用一套特异性的引物或一套由一个特异引物和一个普通引物所组成的引物，此种PCR 技术仅产生一种产物。

（2）用任意引物，得到一群长短不一的DNA 片段混合物，即RAPD — PCR(随机扩增多态DNA 分析多聚酶链反应技术)，此方法可以鉴别出腐败菌的种及其亚种。

（3）嵌套多聚酶链反应技术，由于某些微生物会对PCR 产生干扰，研究者对PCR 技术做了进一步的开发，这就是嵌套多聚酶链反应技术的应用。

该技术区别于以上两种方法的机理在于操作中需要两套引物，第一套用于产生扩增的D N A 片段，此片段中含有第二轮PCR 引物的结合位点，第一轮反应产物被等分转入第二轮P C R 引物，扩增靶D N A。

结束语
随着食品领域的快速快速发展与人民对生活质量的要求起来起高，对食品微生物的检测要求与会起来起高。

从安全卫生与经济效益等方面出发，发展快速、准确的方法在所难免。

尽管分子生物学检测方法具有一定的优点，但目前仍存在一不定期的问题，而今后应进一步加快其研究步伐，使其能广泛的应用。

参考文献
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