运用ITC表征蛋白质的交互作用
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法
检测蛋白相互作用的方法主要有酵母双杂交技术、免疫共沉淀和GST pull-down实验。
1. 酵母双杂交技术：主要用来进行互作蛋白的筛选，缺点就是假阳性较高，所以需要进行结果验证，一般可采用免疫共沉淀或GST-pull down实验进行验证。
2. 免疫共沉淀：是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质-蛋白质间的相互作用被保留了下来。
当用预先固化在argarose beads上的蛋白质A的抗体免疫沉淀A蛋白，那么与A蛋白在体内结合的蛋白质B也能一起沉淀下来。
再通过蛋白变性分离，对B蛋白进行Western blot检测，进而证明两者间的相互作用。
3. GST pull-down实验：是一个行之有效的验证酵母双杂交系统的体外试验技术。
其基本原理是先构建靶蛋白-GST融合蛋白载体，然后进行体外表达及纯化。
将得到的靶蛋白-GST（Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶）融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上，充当一种“诱饵蛋白”，然后将目的蛋白溶液过柱，可从中捕获与之相互作用的蛋白，将目的蛋白洗脱下来，通过SDS-PAGE电泳及Western blot分析证实两种蛋白间的相互作用。
以上内容仅供参考，建议查阅相关文献获取更专业的信息。
等温滴定量热仪(ITC)在分子相互作用中的应用
非特异性结合
ITC 技术的应用领域
分子相互作用：
溶液中的几乎所有天然状态分子： 包括蛋白质、核酸、多肽、药物分子、 脂类、金属离子、小分子等等；
工艺过程的开发和控制
酶动力学 药物研发 非生物系统
抗生素抗性的菌种为什么能更好的 消灭抗生素
Tobromycin binding to aminoglycoside nucleotidyltransferase(2”)
量热池
样品池
对照池
∆T1：样品池温度反馈
神奇的微量热控制—功率补偿
SR
The DP is a measured power differential between the reference and sample cells to maintain a zero temperature between the cells
酶反应动力学的研究 (不一般的ITC曲线）
Kcat：催化速率常数 KM：米氏常数
酶反应动力学应用
测量PP1-γ磷酸酶水解PNPP
ITC测量PP1-γ磷酸酶水解 PNPP速度的原始数据
PP1-γ磷酸酶水解PNPP的MichaelisMenten曲线
ITC Applications Enzyme Kinetics
研究所
中科院生化细胞所 中科院生物物理所 北京生命科学研究所 诺华制药研发中心……
Thanks!
陈雍硕
E-mail: Yongshuo.chen@ Mobile: 13918729620
令人郁闷的公式说明了什么？
1. 相同的KD有着相同的∆G； 2. 相同的∆G却有着不同的∆H与∆S组合。
泛素蛋白连接酶Itch生物活性及其免疫调节作用
唐冰, 等. 泛素蛋白连接酶 Itch 生物活性及其免疫调节作用
345
使免 疫 突触 寿 命降 低, T 细 胞 与抗 原提 呈 细 胞 ( APC) 的结合变得不稳定, 从而使 T 细胞反 应性 降低甚至无反应性, 维持 T 细胞的失能。It ch 缺 失大鼠会出现脾大、淋巴细胞浸润等自身免疫综合 征的表现, 其分子机制可能是 T 细胞过度活化, 即失能缺失。 1. 3 Notch 受体 N ot ch 蛋白( 哺乳动物含有四种) 是一种保守的 型跨膜受体[ 6] , 对 T / B 淋巴细胞 的分化具有重要作用, 其中包括 T h2 的分化。另 外, 通过上调抗凋亡蛋白 A KT 、Bcl 2 以及活化凋 亡蛋白抑制因子( IA P) , No tch 能够增加外周成熟 T 细胞的活性和寿命。
收稿日期: 2011 03 01 作者简介: 唐冰( 1977 ) , 男, 主治 医师, 博 士, 主要 从事临 床麻 醉药理的机制研究。 通讯作者: 王俊科( E mail: junke45@ yah oo. com )
肺泡蛋白沉积引发的低氧血症。 1. 1 Jun 蛋白家族 是 It ch 调节 T 淋巴细胞分化 的分子基础。T 细胞受体( T CR) 激活后, JunB 能 够启动 IL 4 启动子, 使 T 细胞向 T h2 分化。现已 证实, c Jun 和 JunB 均是 It ch 的底物蛋白[ 4] 。在 生理条件下, It ch 的 WW 域可与 c Jun 和 JunB 结 合, 催化其泛素化并经溶 酶体和蛋白酶 体途径降 解, 使 IL 4 等细胞因子持续处于相对较低活性, 减少 T 细胞向 T h2 分化。在 It ch 基因突变或表达 下调时, JunB 表达紊乱, IL 4 等细胞因子表达增 加, T 细胞向 T h2 分化增加, T 细胞过度增 生, 发生异常免疫反应, 如血清 IgG 1和 Ig E 持续升高。 因此, It ch 缺失大鼠多存在 CD4+ T 淋巴细胞的功 能紊乱。 1. 2 PLC 和 PKC Itch 是 T 细胞失能的决定 子。所谓失能( anergy ) 是指 T 细胞遭遇 抗原时处 于功能失活状态, 在这种低反应状态下 T 细胞仍 能长时间保持细胞活力。泛素介导免疫反应中关键 信号分子的降解, 能够打 破细胞免疫突 触的完整 性, 从而保证 T 细胞受到再次刺激时表现为免疫 耐受。
SPR技术和ITC技术在结构生物学中的应用
SPR技术和ITC技术在结构生物学中的应用摘要生物大分子的活性是通过不同分子或相同分子之间的相互作用来实现其生物学功能。
在结构生物学研究领域中，单纯解析生物大分子的结构已不能满足现代科研的基本要求，所以研究其生物学功能受到了越来越多的重视。
本文主要介绍现在常用的SPR技术和ITC技术以及它们在结构生物学中的应用。
关键词SPR技术ITC技术结构生物学前言结构生物学是前个世纪后半叶才蓬勃发展起来的重要学科，通过研究核酸、蛋白质等生物大分子的空间结构，可以为生物大分子发挥生理功能的机理提供关键解释[1]。
生物分子之间的相互作用奠定了生物生命现象的基础，因此研究生物分子之间的相互作用可以在分子水平上更加精细地阐述生物反应发生的机理，揭示生命现象的本质[2]。
关于蛋白质相互作用的检测手段已有很多，但是其缺点也很明显。
SPR（表面等离子共振）生物传感技术作为一种新兴的光学生物化学检测技术，与传统的生化分析方法相比，具有无需标记、灵敏准确、快速、能够实现在线连续检测等优点[3]。
此外，在生物体中的各种生物分子之间的相互作用并不像化学反应那样剧烈。
通过热力学研究，它能够在结合机制的阐明中起重要作用，为药物的设计提供合理的理论模型[4]。
为了研究分子间弱的相互作用力，ITC（等温滴定量热分析）技术便应运而生，它在生物热力学模型的建立、蛋白质和配体的结合以及表面活性剂和聚合物的相互作用中都扮演了关键角色[5]。
SPR技术SPR（表面等离子共振）是指在光波的作用下，在金属和电介质的交界面上形成的改变光波传输的谐振波[6]。
在介质（一般为玻璃）表面涂上一层金属薄膜（一般为金属），入射光在界面处发生全内反射时，产生的消逝波渗透到金属薄膜内，可以激发金属表面等离子体使之产生等离子波。
当入射光的入射角和波长在某一适当值时，表面等离子波与消逝波的频率和波数相等，此时两者将发生共振，入射光能量被吸收，反射光强大幅度减弱，可以从反射光强响应曲线看到一个最小的尖峰，此为共振峰，对应的入射角为SPR角[2]。
蛋白质相互作用的生物学特性和应用
蛋白质相互作用的生物学特性和应用蛋白质是维持细胞结构、功能和传递信息的重要分子。
蛋白质的功能不仅依赖于其本身的结构，还与其相互作用的其他蛋白质有关。
蛋白质相互作用的生物学特性是一个重要的研究领域，也是许多医学和生物工程应用的基础。
蛋白质相互作用的生物学特性蛋白质是大分子，通常由一条或多条多肽链组成。
多肽链之间可以形成各种化学键和相互作用，导致蛋白质的不同结构和功能。
蛋白质之间的相互作用也是通过这些键和相互作用实现的。
蛋白质之间的相互作用种类繁多，包括静电相互作用、氢键、疏水效应和范德华力等。
静电相互作用是指由于正负电荷之间的相互作用力而产生的相互作用。
氢键是指在两个分子之间共享氢离子的共价键。
疏水效应是指由于蛋白质内部氨基酸侧链的疏水性质而导致的相互作用。
范德华力是指由于电荷的偶极子相互作用而产生的相互作用。
这些相互作用会影响蛋白质的构象和稳定性，进而影响蛋白质的功能。
例如，静电相互作用会影响蛋白质的电子云分布，进而影响蛋白质的空间结构和热稳定性。
氢键和疏水效应会影响蛋白质内部的氢键和疏水晶体，进而影响蛋白质的构象和稳定性。
应用基于蛋白质相互作用的生物学特性，我们可以开发出许多医学和生物工程应用。
例如：1. 新药发现许多疾病的发病机制与蛋白质相互作用有关。
因此，我们可以通过研究蛋白质相互作用，发现新的疾病关键靶点，并开发出针对这些靶点的新药。
2. 蛋白质纯化许多生物制品需要从复杂的混合物中分离出纯的蛋白质。
蛋白质相互作用的生物学特性可以帮助我们选择适当的分离方法，以提高分离效率和纯度。
3. 蛋白质工程蛋白质工程是指通过改变蛋白质的结构和功能，来实现一系列的生物、医学和工程应用。
蛋白质相互作用的生物学特性是蛋白质工程的重要基础，可以帮助我们设计出新的蛋白质工程方案。
4. 生物传感器生物传感器是指利用生物分子作为传感器部件，通过检测特定的生物分子来实现信号转换的一种技术。
蛋白质相互作用的生物学特性可以帮助我们设计出高灵敏度和高选择性的生物传感器。
蛋白质与脂质相互作用的研究技术
生成、改变能量代谢途径等， 以增加氧的利用率、 减少氧的消耗， 同时通过调控细胞周期调节蛋白 的基因和凋亡相关基因的表达改变细胞周期、抑
ＰＬＯ 主 要 用 来 检 测 与 特 定 蛋 白 质 相 互 作 用 的 脂质， 同时也可以通过纤维素薄膜上蛋白质和脂 质的作用半径分析两者的相对亲和能力。其基本 原理是： 将已知脂质梯度点在纤维素薄膜的特定 位置， 或者是相同浓度的不同脂质顺序点样在纤 维素薄膜上， 再加入被检测的蛋白质， 保温后充 分洗涤， 其中目标蛋白质与脂质发生相互作用而 结合在膜上， 在未达到饱和之前结合量呈明显梯 度， 显示不同的作用半径， 再结合免疫学方法进 行进一步检测， 可以直观地鉴定两者的相互作 用 。 Ｍｕｒｐｈｙ 等 ［３］ 用 ＰＬＯ 法 结 合 梯 度 实 验 ， 对 昆 虫杆状病毒系统重组表达的凝集素样氧化低密度 脂 蛋 白 受 体 ＬＯＸ－ １（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ／ｉｎｓｅｃｔ ｃｅｌｌ－ ｅｘｐｒｅｓｓ－ ｅｄ ｌｅｃｔｉｎ－ ｌｉｋｅ ｏｘｉｄｉｚｅｄ ｌｏｗ－ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ）与 磷 脂 酰 胆 碱 （ＰＣ）和 磷 脂 酰 丝 氨 酸 （ＰＳ）两 种 脂 质 的 结 合 情况进行了比较， 发现它与 ＰＳ 的 相 互 作 用 明 显 ， 而 且 受 到 Ｃａ２＋的 调 节 。 该 方 法 可 以 快 速 方 便 地 检 测蛋白质与脂质的特异性相互作用， 特别是对目 的蛋白质及其突变株与脂质的相互作用可以进行 分析比较， 也可以结合免疫学方法进行直观检测； 只需要少量的目的蛋白质和脂质， 简便快捷， 所 需试剂经济易得， 专业要求不高， 在实验中广泛 应用； 有荧光标记的蛋白质还可以用荧光方法检 测。但 ＰＬＯ 仅限于定性分析蛋白质和脂质物质的 相互作用， 在定量检测方面还需要结合表面等离 子共振技术和等温滴定量热法等相关技术。 ２． 脂质微矩阵法
蛋白质相互作用
2、功能型蛋白芯片
它的识别分子主要是通过高通量的蛋白纯化、人工合成多 肽或化学分子制备而成，然后将其点在合适的固相基质表面。 这类芯片主要适用于蛋白质的生化功能以及相互作用研究， 如蛋白质的结合特性、酶的催化活性、蛋白质转录后修饰的 研究、小分子药物和药物靶标的筛选和鉴定等，即蛋白质与 蛋白质及其他分子相互作用谱图的研究网
ELISA的类型 的类型
1、双抗体夹心法
将已知抗体吸附于固相载 体，酶标记一抗。 检测液相中的可溶性抗原。
ELISA的类型 的类型
2、间接法 将已知抗原吸附 于固相载体，酶 标记二抗。 检测液相中未知 抗体。
ELISA的类型 的类型
3、直接法
将已知抗体或抗原吸 附于固相载体，酶标 记抗原或抗体 检测液相中的可溶性 抗体或抗原。
ITC
ITC 获取的结果示意图
上图：峰底与峰尖之间的峰面积为每次注射时释放或吸收的总热量。 下图：以产生或吸收的总热量为纵坐标，以加入杯中的两反应物之 摩尔比为横坐标作图，可得整个反应过程的结合等温曲线。
ITC具有的特点
1、它不干扰蛋白质和核酸的生理功能，具有非特异性的独 特优势，即对被研究蛋白质和核酸体系的溶剂性质、光谱性 质和电学性质等没有任何限制条件。 2、样品用量小,方法灵敏度高，测量时不需要制成透明清澈 的溶液。 3、实验完毕的样品未遭破坏，还可以进行后续生化分析。
蛋白质相互作用 蛋白质相互作用
2012-5-22
FRET ELISA 蛋白质芯片 SPR ITC
FRET现象
当供体荧光分子的发射光谱与受 体荧光分子的吸收光谱重叠，并 且两个分子接近到一定距离（110nm）时，就会发生一种非放射 性的能量转移，激发供体而产生 的荧光能量正好被附近的受体吸 收，使得供体发射的荧光强度衰 减，受体荧光分子的荧光强度增 强。
蛋白质交互作用的生物学意义
蛋白质交互作用的生物学意义蛋白质是生命体中最为重要的分子之一，它们在维持生命过程中发挥着重要的作用。
蛋白质通过与其它生物分子发生相互作用来完成其生物学功能。
其中蛋白质与蛋白质之间的相互作用称为蛋白质交互作用。
蛋白质交互作用在生物学中具有重要的意义。
蛋白质交互作用的种类蛋白质交互作用是指蛋白质与其它生物分子之间的相互作用过程。
这些生物分子包括其它蛋白质、核酸、糖类等。
蛋白质交互作用主要包括以下几种形式：1. 蛋白质-蛋白质相互作用。
这是指两个蛋白质之间的相互作用过程。
例如，酶-底物相互作用就是一种典型的蛋白质-蛋白质相互作用。
2. 蛋白质-核酸相互作用。
这是指蛋白质与核酸之间的相互作用过程。
在基因表达过程中，转录因子与DNA之间的交互作用就是一种典型的蛋白质-核酸相互作用。
3. 蛋白质-小分子相互作用。
这是指蛋白质与小分子之间的相互作用过程。
例如，酶与它的辅助因子之间的交互作用就是一种典型的蛋白质-小分子相互作用。
4. 蛋白质-膜相互作用。
这是指蛋白质与细胞膜之间的相互作用过程。
在细胞信号传递过程中，受体与细胞膜之间的交互作用就是一种典型的蛋白质-膜相互作用。
蛋白质交互作用对生命过程的影响蛋白质交互作用在生物学中有着广泛的影响。
其主要表现在以下几个方面：1. 蛋白质交互作用参与基因表达调控。
转录因子是调控基因转录的关键蛋白质，它们与DNA之间的交互作用能够激活或抑制基因的转录。
2. 蛋白质交互作用参与信号传递。
蛋白质与膜之间的相互作用能够触发细胞信号传递过程，从而调节各种生物学过程。
例如，蛋白质激酶的活性调节就是一种通过蛋白质交互作用实现的信号传递过程。
3. 蛋白质交互作用参与细胞周期调控。
蛋白质间的相互作用可以控制细胞周期的进程，例如，细胞分裂素通过激活特定蛋白质的活性来调节细胞周期。
4. 蛋白质交互作用参与免疫反应。
蛋白质交互作用可以调节免疫细胞的功能，帮助机体对抗病原体。
例如，抗体与病原体之间的相互作用能够识别和清除病原体。
TA Instruments – 蛋白质 蛋白质交互抑制剂探测与特征分析的ITC方法说明书
TA Instruments – Application Note__________________________________________________________________________________ Discovery and Characterization of Inhibitors of Protein/ProteinInteractions by ITC.Arne Schön, PhD and Ernesto Freire, PhDDepartment of Biology, Johns Hopkins UniversityThe inhibition of protein-protein interactions is a major goal in the therapy of different pathological conditions including cancer, inflammation, autoimmune diseases, diabetes, osteoporosis, infection, etc. Since protein-protein interactions play a critical role in biological signaling, the identification and optimization of molecules that inhibit those interactions is a major research objective in the pharmaceutical industry. The number of targets of interest is continuously increasing and range from a vast number of cell surface receptors, such as EGFr, TNFr, and IGFr to other proteins involved in signaling and regulation (1, 2). In the case of HIV infection, for example, the first event is the binding of the viral envelope glycoprotein gp120 to the cell surface receptor CD4 (3, 4). Until now, biologics, i.e. monoclonal antibodies or recombinant versions of ligand proteins and/or soluble regions of the receptors, have defined the therapeutic arsenal aimed at targeting protein/protein interactions. The identification of small molecules that accomplish the same goals has become a new frontier in drug research.Isothermal Titration Calorimetry (ITC) plays a critical role in the identification and characterization of inhibitors of protein/protein interactions (PPI). The identification of PPI inhibitors is fundamentally different to the identification of enzyme inhibitors for which inhibition assays are relatively easy to implement using a variety of approach. For PPI, functional or cell based assays do not reveal the molecular target(s) of molecules identified as active. On the other hand, binding assays alone cannot tell if a binder is also a PPI inhibitor. For PPI inhibitors it is necessary to implement an assay that measures directly the association between the two proteins and its inhibition by the inhibitor candidates. This is the assay where ITC excels.The identification of PPI inhibitors by ITC requires:1. Measuring the binding of the two proteins. This experiment is performed onceand serves as the reference.2. Measuring the binding of the two proteins in the presence of a fixedconcentration of the inhibitor candidates.TA Instruments – Application Note__________________________________________________________________________________3. The characterization of those molecules that score favorably in the PPI inhibitorsscreen is performed by directly measuring the binding of the selected compounds to the target proteins.Measuring Protein/Protein BindingIn this Application Note we will use the binding of the envelope glycoprotein of HIV-1gp120 to the soluble form of the cell surface receptor sCD4 as an example.The reaction cell of the Nano ITC Low Volume (LV) (TA Instruments, New Castle, DE) is filled with 0.17 mL of 4.5 µM of gp120. The injection syringe is filled with a 45 µM solution of sCD4. These protein solutions are equivalent to 0.25 and 2.0 mg/mL respectively. Injection volumes are 2µL in all experiments presented here. In general, with the current instrument precision the protein concentrations can be reduced 3-fold and still obtain accurate results.All protein solutions are in PBS (Roche Diagnostics GmbH, Mannheim, Germany), pH 7.4 with 2 % DMSO. Figure 1 shows the titration of sCD4 into gp120. It is consistent with an association constant, K a, of 1.2 × 108 M-1 or equivalently a dissociation constant K d = 1/K a of 8.3 nM. Furthermore, the binding enthalpy, ΔH, is -38.0 kcal/mol and the entropy contribution to the binding Gibbs energy, –TΔS, is 27.0 kcal/mol (1 cal = 4.184 joules). The thermodynamic signature in the inset provides a visual representation of the magnitude of those contributions to binding. Figure 1. ITC titration of sCD4 into gp120TA Instruments – Application Note__________________________________________________________________________________ The binding of sCD4 to gp120 is characterized by large favorable enthalpy and large unfavorable entropy changes, indicative of a binding reaction associated with a large structuring process. In this case, the binding of sCD4 triggers the folding of intrinsically disordered domains in gp120 (5, 6). Protein/protein binding not associated with large refolding processes are characterized by favorable enthalpy and entropy changes.Screening for InhibitorsThe identification of PPI inhibitors is accomplished by performing the same experiment shown in Figure 1 except that the reaction cell also contains a fixed concentration of an inhibitor candidate. Since initial leads are usually active in the low micromolar range, a good concentration is in the hundreds micromolar range. If a compound inhibits the protein/protein interaction, it will be observed as a decrease in the observed or apparent binding affinity, K app. The magnitude of the decrease can be expressed in terms of the ratio A = K app/K a. If A = 1, then the compound has no effect on the protein/protein interaction. If A<1, then the compound has an inhibitory effect. If all the compounds are screened at the same concentration, then the parameter A suffices to rank them in terms of their inhibitory potency. Sometimes a compound is found that exhibits an A value greater than one. This compound actually increases the binding affinity acting as an agonist of the protein/protein interaction. While most of the time drug developers are searching for inhibitors, we should emphasize that this technology also allows for the identification of PPI agonists.Figure 2 shows a titration similar to the one shown in Figure 1 except that the reaction cell also contains 200µM of NBD-556, a small molecular weight (MW = 337.84) low affinity sCD4/gp120 inhibitor (5, 6). This experiment is consistent with an apparent association constant, K app, of 7.7 × 106 M-1 or equivalently an apparent dissociation constant K d,app = 1/K app of 130 nM, indicating that the presence of the compound significantly reduces the affinity of sCD4 for gp120. The apparent binding enthalpy is -23.0 kcal/mol and the apparent entropy contribution to binding is 13.6 kcal/mol. The thermodynamic signature for this experiment is also displayed in the inset. Most importantly, the A value is 0.064 indicating that this compound is a PPI inhibitor.TA Instruments – Application Note__________________________________________________________________________________ Figure 2. ITC titration of sCD4 into gp120 in the presence of 200µM NBD-556Characterization of PPI InhibitorThe experiments in Figures 1 and 2 identify a compound as a PPI inhibitor. A more complete characterization of the compound is obtained by measuring its binding thermodynamics to the target protein. If the target protein is not known, separate ITC experiments with each of the two proteins need to be performed. The A parameter is related to the affinity of the inhibitor to the target by the following equation:(1)where β is the degree of competitiveness of the inhibitor. If β = 0 the inhibitor is absolutely competitive, i.e. either the inhibitor or the protein is bound but not both. If β = 1 the compound does not affect the binding affinity of the protein. This situation can be observed for allosteric inhibitors of protein signaling in which binding of the inhibitor does not affect the binding of the two proteins. For small molecular weightTA Instruments – Application Note__________________________________________________________________________________ compounds β can assume a value between 0 and 1 (7). This situation is possible because the binding footprint of a small molecule is very small when compared to the entire protein/protein interface which can make it possible for both molecules to bind simultaneously. The presence of the small molecule can be thought off as a mutation that lowers the affinity but not abolishes the binding of the protein for its partner. The parameter β can be calculated from the ITC da ta by rearranging equation 1:(2)where A is obtained for the experiments in Figures 1 and 2 and K I from the ITC titration of the inhibitor into the target protein.Figure 3 shows the ITC titration of NBD-556 into gp120 which is the target protein in this particular example. In this experiment, the reaction cell contained 5 uM gp120 and was titrated with 2 µL injections of a 300 µM NBD-556 in the syringe. This experiment is consistent with an association constant, K I, of 3.3 × 105 M-1 or equivalently a dissociation constant K d,I = 1/K I of 3.0 µM. The binding enthalpy is -20.4 kcal/mol and the entropy contribution to binding is 12.9 kcal/mol. The thermodynamic signature for this inhibitor is also displayed in the inset. Equation 2 indicates that the binding of NBD-556 is characterized by a β value of 0.05 which is characteristic for a moderately competitive inhibitor. The optimization of protein/protein inhibitors requires maximization of the binding affinity and modulation of the degree of competitiveness, β, in order to develop more or less competitive inhibitors according to the specific design needs. The results presented here demonstrate the unique capability of ITC to guide the optimization of protein/protein inhibitors.TA Instruments – Application Note__________________________________________________________________________________ Figure 3. ITC titration of the small molecular weight inhibitor NBD-556 into gp120.ConclusionsThe inhibition of protein/protein interactions is a major frontier in the pharmaceutical and biotechnological industries. The identification and optimization of protein/protein inhibitors require accurate measurements of their binding affinity as well as the efficiency with which they compete with the target protein. ITC is uniquely suited to perform this task as it can provide both the binding affinity and the degree of competitiveness of an inhibitor. Contrary to traditional enzyme inhibitors in which the degree of inhibition is proportional to binding affinity, for protein/protein inhibitors binding affinity is not sufficient. Due to the large size of the protein/protein binding footprint when compared to the size of a ~500 MW molecule, inhibitor optimization also requires tracking of the degree of competitiveness since binding affinity alone does not reflect inhibitor potency. The experiments presented here demonstrate the critical role of the Nano ITC LV in the development of protein/protein interaction inhibitors.TA Instruments – Application Note__________________________________________________________________________________ References1. Wells, J. A., and McClendon, C. L. (2007) Reaching for high-hanging fruit in drugdiscovery at protein-protein interfaces, Nature450, 1001-1009.2. Zinzalla, G., and Thurston, D. E. (2009) Targeting protein-protein interactions fortherapeutic intervention: a challenge for the future, Future Med Chem1, 65-93.3. Dalgleish, A. G., Beverley, P. C., Clapham, P. R., Crawford, D. H., Greaves, M.F., and Weiss, R. A. (1984) The CD4 (T4) antigen is an essential component ofthe receptor for the AIDS retrovirus, Nature312, 763-767.4. Klatzmann, D., Champagne, E., Chamaret, S., Gruest, J., Guetard, D., Hercend,T., Gluckman, J. C., and Montagnier, L. (1984) T-lymphocyte T4 moleculebehaves as the receptor for human retrovirus LAV, Nature312, 767-768.5. Schӧn, A., Madani, N., Klein, J. C., Hubicki, A., Ng, D., Yang, X., Smith, A. B.,3rd, Sodroski, J., and Freire, E. (2006) Thermodynamics of binding of a low-molecular-weight CD4 mimetic to HIV-1 gp120, Biochemistry45, 10973-10980.6. Zhao, Q., Ma, L., Jiang, S., Lu, H., Liu, S., He, Y., Strick, N., Neamati, N., andDebnath, A. K. (2005) Identification of N-phenyl-N'-(2,2,6,6-tetramethyl-piperidin-4-yl)-oxalamides as a new class of HIV-1 entry inhibitors that prevent gp120binding to CD4, Virology339, 213-225.7. Schӧn, A., Lam, S. Y., and Freire, E. (2011) Thermodynamics-based drugdesign: strategies for inhibiting protein-protein interactions, Future Med Chem3, 1129-1137.。
ITC
微量量热技术(Microcalorimetry)吕卓远常莹李蒙萌安健博北京大学医学部基础医学院医学实验04级摘要我们知道生物大分子，如蛋白质、核酸的特殊空间构象的形成绝大多数是可逆的热力学反应，因此对此过程的热力学研究有着很大的意义。
这个过程需要利用目标分子直接测量伴随生物大分子反应的热效应。
实现这一程序需要具有很高灵敏度的量热技术，即差示扫描量热技术（DSC）和等温滴定量热技术（ITC），得以测量在固定溶液环境下，随温度变化放出的热量。
或测量在固定温度下，随溶液环境变化放出的热量。
在本篇综述中，我们主要介绍DSC和ITC的主要原理，以及它们在生物医学领域中的应用。
关键词微量量热技术差示扫描量热技术等温滴定量热技术生物大分子正文1．前言在升温和降温的过程中，物质的结构和化学性质会发生变化，其质量、几何尺寸、光、电、磁、热、力等物理性质也会发生相应的变化。
微量量热技术被定义为在温度程序控制的条件下测量物质的物理性质和温度关系的一类技术。
微量量热技术是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续和准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，同时提供热力学和动力学信息。
微量量热技术的一个重要特点就是，它可以作为任意反应净变的传感器，具有连续性和抗干扰性。
因此它是一个用于发现和估测反应未知步骤或过程的先进分析技术。
2．差示扫描量热技术（DSC）差示扫描量热技术是20世纪60年代以后研制出的一种热分析方法。
在样品和参比物同时程序升温或降温且保持两者温度相同的条件下，测量流入或流出样品和参比物的热量差与温度关系的技术。
DSC仪器结构包括温度程序控制系统；测量系统，用于样品物理量转换成电信号并放大；数据记录、处理和显示系统；样品室，提供适当环境。
DSC分析生物大分子结构变化的基础：由于在给定温度下每个体系总是趋向于达到自由能最小的状态，所以样品升温或降温的过程中，它可以转变成具有不同自由能的另一种结构状态。
生命现象中蛋白质相互作用的机制
生命现象中蛋白质相互作用的机制生命现象中的蛋白质相互作用是生命体系中基本的分子交互方式之一。
蛋白质互相作用能够调控细胞的信号传导、代谢途径、基因表达和细胞周期等重要生命过程。
因此，了解蛋白质相互作用的机制对于研究生命科学是至关重要的。
蛋白质相互作用的类型和特点生命现象中的蛋白质相互作用一般分为几种类型。
其中，蛋白质-蛋白质相互作用是指两种或多种蛋白质之间的相互作用。
蛋白质-核酸相互作用则是指蛋白质与核酸之间的作用，同时还有蛋白质-小分子相互作用，通常是指蛋白质与小分子之间的非共价或共价相互作用。
在这些相互作用中，蛋白质之间的相互作用无疑是其中最常见、最重要的一种。
存在于生命系统中的基本蛋白质相互作用包括蛋白质-蛋白质相互作用、蛋白质-核酸相互作用和蛋白质-小分子相互作用。
其中，一些最基本的特点包括: - 多样性：生物体内存在数量巨大、差异性极明显的蛋白质，每种蛋白质都具有不同的结构和功能，且其相互作用关系也千差万别。
- 特异性：大多数蛋白质之间的相互作用都具有非常强的特异性，这是由蛋白质表面的某些区域所决定的。
- 稳定性：许多蛋白质之间的相互作用是比较稳定的，常常是靠非共价键力（例如静电作用、范德华作用和氢键等）和共价键力（例如二硫键、互钩酯键等）相互作用而形成。
- 動态性：蛋白质之间的相互作用具有时态性和动态性，这是生命现象的一个重要特征。
蛋白质相互作用的驱动力生命现象中的蛋白质相互作用通常都是由分子间的吸引力和排斥力所驱动的。
通俗的说，就是“喜欢和不喜欢”。
吸引力主要包括静电作用、范德华力以及氢键作用等力，排斥力则是由排斥受限作用所驱动。
对于酶促反应，还有电子转移和质子转移等驱动机制。
其中，静电作用是蛋白质相互作用中最普遍的一种力。
它是由于相互作用蛋白质间引起的静电荷的相互作用所导致的。
这种相互作用的优势在于它非常常见，并且往往是相对稳定的。
但是，由于静电作用并不总是存在于同样的程度，因此它也可能是相互作用中最难以预测的一种。
蛋白质定量与定性分析报告
蛋白质定量与定性分析报告蛋白质定量分析与定性分析报告此次“蛋白质定量分析与定性分析”报告总共包括蛋白定量、蛋白简单定性、蛋白功能定性三个部分组成。
师兄的报告内容翔实，介绍生动，让我受益匪浅。
1. 蛋白质定量分析蛋白质定量分析是确定样品中总蛋白含量，或者某种单一蛋白的含量。
蛋白质的定量分析一般可从三个方面入手，一是基于蛋白质的元素组成特点，二是基于蛋白质的化学显色反应，三是基于蛋白质的光吸收特性。
蛋白质定量分析的方法有:280紫外吸光比色法、经典Bradford与Lowry检测法、BCA(二喹啉加酸)检测法、疏基测定检测法。
280紫外吸光比色法这一方法可用来快速检测溶液中是否含有蛋白质成分及其含量，通常用于柱层分析过程中检测蛋白质的洗脱峰。
如下图，蛋白质中的Trp、Tyr、Cys残基含有共轭双键，在280nm有一紫外吸收高峰。
在一定浓度范围内，蛋白质的A280与其浓度成正比，所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值是分析溶液中蛋白质含量的快速简便的方法。
可以通过A280与A260的差值来计算出蛋白质浓度，如:蛋白质浓度(mg/l)=1.45×A280-0.74×A260。
蛋白质的第二吸收峰在240nm以下，214nm最大，此峰是由肽键引起。
可通过214nm与225nm的差值来计算出蛋白质的含量。
较为精确的公式为: ε(280) (M-1 cm-1)= (#Trp)(5,500) + (#Tyr)(1,490) + (#cystine)(125).1.2 经典Bradford与Lowery检测法1.2.1 Bradford检测法这是一种迅速、可靠的通过染色法测定溶液中蛋白质含量的方法。
该法基于考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。
在一定浓度的乙醇及酸性条件下，可配成淡红色溶液，当于蛋白质结合后，产生蓝色化合物，反应迅速而稳。
蓝色复合物在595nm波长处具有最大光吸收值，并与溶液中蛋白质浓度成正比，因此可检测595nm的光吸收值大小计算蛋白的含量。
ITC
微量量热技术(Microcalorimetry)吕卓远常莹李蒙萌安健博北京大学医学部基础医学院医学实验04级摘要我们知道生物大分子，如蛋白质、核酸的特殊空间构象的形成绝大多数是可逆的热力学反应，因此对此过程的热力学研究有着很大的意义。
这个过程需要利用目标分子直接测量伴随生物大分子反应的热效应。
实现这一程序需要具有很高灵敏度的量热技术，即差示扫描量热技术（DSC）和等温滴定量热技术（ITC），得以测量在固定溶液环境下，随温度变化放出的热量。
或测量在固定温度下，随溶液环境变化放出的热量。
在本篇综述中，我们主要介绍DSC和ITC的主要原理，以及它们在生物医学领域中的应用。
关键词微量量热技术差示扫描量热技术等温滴定量热技术生物大分子正文1．前言在升温和降温的过程中，物质的结构和化学性质会发生变化，其质量、几何尺寸、光、电、磁、热、力等物理性质也会发生相应的变化。
微量量热技术被定义为在温度程序控制的条件下测量物质的物理性质和温度关系的一类技术。
微量量热技术是近年来发展起来的一种研究生物热力学与生物动力学的重要结构生物学方法，它通过高灵敏度、高自动化的微量量热仪连续和准确地监测和记录一个变化过程的量热曲线，同时提供热力学和动力学信息。
微量量热技术的一个重要特点就是，它可以作为任意反应净变的传感器，具有连续性和抗干扰性。
因此它是一个用于发现和估测反应未知步骤或过程的先进分析技术。
2．差示扫描量热技术（DSC）差示扫描量热技术是20世纪60年代以后研制出的一种热分析方法。
在样品和参比物同时程序升温或降温且保持两者温度相同的条件下，测量流入或流出样品和参比物的热量差与温度关系的技术。
DSC仪器结构包括温度程序控制系统；测量系统，用于样品物理量转换成电信号并放大；数据记录、处理和显示系统；样品室，提供适当环境。
DSC分析生物大分子结构变化的基础：由于在给定温度下每个体系总是趋向于达到自由能最小的状态，所以样品升温或降温的过程中，它可以转变成具有不同自由能的另一种结构状态。
生物物理化学实验报告——ITC
结构化学实验报告等温滴定量热法测定两种蛋白质间相互作用2012/5/5实验目的：了解MicroCal iTC200等温滴定量热仪在测量蛋白质相互作用中的应用，了解仪器基本工作原理，学习蛋白质相互作用的测定步骤和仪器操作，简要分析实验结果。
实验原理：在研究两种或两种以上的蛋白质的功能时，相关蛋白质之间常常存在相互作用（常常是氢键或范德华力），如果两蛋白可以彼此结合，则结合的过程中会放出一定的热量。
所以，通过测定蛋白质相互作用时放出热量的大小，可以得到蛋白相互作用时的结合常数K D、化学计量比N和焓变ΔH，从而由热力学公式ΔG = RT lnK D和ΔG = ΔH -TΔS可以进一步得到反应的自由能变化。
MicroCal iTC200等温滴定量热仪的基本原理就是实现了蛋白质之间的微量滴定操作和微小热量的精密测量。
通过滴定操作和热量的测量，量热仪可以给出热量-摩尔比曲线：图像中曲线的突跃中点对应的化学计量比就是两种蛋白质相互作用的化学计量数N ，突跃中点处曲线的斜率就是两种蛋白相互作用的结合常数K D 。
决定曲线形状的主要参数是C 值：C = 滴定池中的蛋白浓度/ KD = [M]tot/ KD × NC 值越大，曲线越陡；C 值越小，曲线越平缓，没有明显的突跃。
一般C 值在10-100之间实验效果最好。
实验材料：蛋白质tse1（17KD）蛋白质tsi1（16KD）实验步骤：1.使用紫外分光光度计在280nm检测波长下测定蛋白质溶液中蛋白质的浓度，根据所需要的蛋白质浓度比稀释蛋白质溶液。
2.在量热仪的注射器和样品池中分别加入两种不同的蛋白质样品。
⑴注射器加样①将装有约100微升样品的PCR管放入样品试管槽。
②注射器移到“Rest Position”；然后左手转动注射器上端，使注射器的连接孔对准支架上的孔。
右手将白色细管顶部的连接头水平对准注射器连接孔，先轻轻将乳白色连接头旋入连接孔，随后将乳白色连接头后的金属连接头轻轻拧紧即可。
生物大分子的互补作用与交互作用
生物大分子的互补作用与交互作用生物大分子是构成生物体内的化学物质，包括蛋白质、核酸、多糖等。
它们在生命活动中发挥着至关重要的作用，如蛋白质作为酶催化反应、核酸作为基因信息的载体等。
而这些巨大的分子之间的互补作用和交互作用，则是支撑生命体系稳定运行的关键。
一、蛋白质之间的互补作用蛋白质是由氨基酸组成的长链状分子，其中有些氨基酸具有极性，如羟基、羧基、胺基等。
这些极性氨基酸使得蛋白质之间可以通过氢键、离子键等方式相互作用，形成二级、三级结构，进而构成蛋白质的最终形态。
以酶为例，酶是一类在生命体系中广泛存在的蛋白质，通过催化生物中的化学反应，使反应速率快数千倍以上。
在酶与底物结合时，它们之间的互补作用起着至关重要的作用。
一方面，酶的催化活性与底物结合的亲和力是一对矛盾的关系，即催化作用要高，结合要低。
另一方面，酶表面的各种氨基酸残基与底物通过氢键、离子键等方式相互作用，形成具有精确空间结构的酶活性位点，进而实现酶催化作用。
二、核酸之间的互补作用核酸是生物体内储存和传递遗传信息的分子，包括DNA和RNA。
DNA由四种不同的碱基（腺嘌呤、鸟嘌呤、胸腺嘧啶和鳞状细胞素）组成，RNA则少了胸腺嘧啶，并以尿嘧啶代替。
这四种碱基之间是可以互补配对的：腺嘌呤与鸟嘌呤之间配对，胸腺嘧啶和尿嘧啶之间配对，形成G-C、A-T（DNA）或A-U（RNA）的配对，这就是DNA的双链结构和RNA的单链结构。
双链结构具有稳定性和准确性，可以保护DNA分子的遗传信息，并在复制和修复DNA过程中发挥重要的作用。
此外，形成双链结构的过程中，每个单链上的碱基也会与水分子产生氢键，形成非常稳定的茎-环结构，这种结构可用于制造DNA芯片、药物设计、生物检测等领域。
三、生物分子之间的交互作用在生物体系中，不同的分子之间常常会发生相互作用，这种交互作用是生命活动中必不可少的一环。
常见的交互作用有：蛋白质和核酸之间的互相识别和结合、蛋白质与小分子之间的结合、蛋白质和蛋白质之间的相互作用等。
itc 蛋白互作
itc 蛋白互作【最新版】目录1.蛋白质互作的背景介绍2.ITC 技术的原理3.ITC 在蛋白质互作研究中的应用4.ITC 技术的优缺点5.结论正文1.蛋白质互作的背景介绍蛋白质是生物体内最重要的分子之一，它们在细胞内承担着各种生物学功能。
蛋白质的功能往往通过与其他蛋白质相互作用来实现。
蛋白质互作在生物体内起着关键作用，它们可以形成酶 - 底物、信号传导、分子识别和细胞黏附等复合物。
因此，研究蛋白质互作对于理解生命过程的调控机制具有重要意义。
2.ITC 技术的原理等温滴定量热法（Isothermal Titration Calorimetry，ITC）是一种用于测量生物分子间相互作用的热力学参数的技术。
ITC 的原理是在恒定温度下，通过向一个含有待测蛋白质的溶液中连续加入另一个蛋白质，测量溶液的热效应，从而确定两者之间的结合常数和结合程度。
ITC 可以检测到微弱的相互作用，具有很高的灵敏度和精度。
3.ITC 在蛋白质互作研究中的应用ITC 在蛋白质互作研究中具有广泛的应用。
首先，ITC 可以用于筛选与某个蛋白质发生相互作用的分子。
通过检测蛋白质与潜在配体之间的结合热效应，可以筛选出与蛋白质发生相互作用的分子。
此外，ITC 还可以用于研究蛋白质互作的动力学过程，如结合速率和解离速率。
最后，ITC 可以用于研究蛋白质互作的热力学参数，如结合常数和自由能，从而揭示蛋白质互作的驱动力。
4.ITC 技术的优缺点ITC 技术具有以下优点：（1）高灵敏度和精度，可以检测到微弱的相互作用；（2）可以测定蛋白质互作的热力学参数，揭示相互作用的驱动力；（3）可以在较短时间内获得结果。
然而，ITC 技术也存在一些局限性：（1）需要专门的设备；（2）实验过程中可能受到温度、pH 等因素的影响；（3）对于大分子复合物的研究具有一定的局限性。
5.结论总之，ITC 作为一种研究蛋白质互作的热力学参数的技术，具有很高的灵敏度和精度。
检测两种蛋白质之间相互作用之欧阳术创编
检测两种蛋白质之间相互作用的实验方法比较1. 生化方法●免疫共沉淀免疫共沉淀是以抗体和抗原之间的专一性作用为基础的用于研究蛋白质相互作用的经典方法。
改法的优点是蛋白处于天然状态，蛋白的相互作用可以在天然状态下进行，可以避免认为影响；可以分离得到天然状态下相互作用的蛋白复合体。
缺点：免疫共沉淀同样不能保证沉淀的蛋白复合物时候为直接相互作用的两种蛋白。
另外灵敏度不如亲和色谱高。
●Far-Western又叫做亲和印记。
将PAGE胶上分离好的凡百样品转移到硝酸纤维膜上，然后检测哪种蛋白能与标记了同位素的诱饵蛋白发生作用，最后显影。
缺点是转膜前需要将蛋白复性。
2. 等离子表面共振技术（Surface plasmon resonance）该技术是将诱饵蛋白结合于葡聚糖表面，葡聚糖层固定于几十纳米厚的技术膜表面。
当有蛋白质混合物经过时，如果有蛋白质同“诱饵”蛋白发生相互作用，那么两者的结合将使金属膜表面的折射率上升，从而导致共振角度的改变。
而共振角度的改变与该处的蛋白质浓度成线性关系，由此可以检测蛋白质之间的相互作用。
该技术不需要标记物和染料，安全灵敏快速，还可定量分析。
缺点：需要专门的等离子表面共振检测仪器。
3. 双杂交技术原理基于真核细胞转录因子的结构特殊性，这些转录因子通常需要两个或以上相互独立的结构域组成。
分别使结合域和激活域同诱饵蛋白和猎物蛋白形成融合蛋白，在真核细胞中表达，如果两种蛋白可以发生相互作用，则可使结合域和激活域在空间上充分接近，从而激活报告基因。
缺点：自身有转录功能的蛋白会造成假阳性。
融合蛋白会影响蛋白的真实结构和功能。
不利于核外蛋白研究，会导致假隐性。
5. 荧光共振能量转移技术指两个荧光法色基团在足够近（<100埃）时，它们之间可发生能量转移的现象。
荧光共振能量转移技术可以研究分子内部对某些刺激发生的构象变化，也能研究分子间的相互作用。
它可以在活体中检测，非常灵敏，分辩率高，能够检测大分子的构象变化，能够定性定量的检测相互作用的强度。
蛋白质相互作用的研究方法
蛋白质相互作用的研究方法蛋白质相互作用（protein-protein interaction, PPI）研究方法可以分为生化方法、细胞生物学方法、生物物理化学方法和计算方法等多个方面。
以下将详细介绍几种常用的研究方法。
1. 酵母双杂交法（Yeast Two-Hybrid, Y2H）酵母双杂交法是一种广泛应用的PPI研究方法。
该方法利用酵母细胞中两个蛋白质结合后的活性报告基因表达，从而实现对蛋白质相互作用的筛选和鉴定。
该方法的优点是操作简单、高通量性能强，但也存在一些局限性，如可能存在假阳性结果和只能检测胞内相互作用。
2. 免疫共沉淀法（Immunoprecipitation, IP）免疫共沉淀法是一种常用的生化方法，用于鉴定蛋白质相互作用。
该方法基于抗体的特异性，将靶蛋白及其结合蛋白共同沉淀下来，通过蛋白质分析技术（如质谱分析）鉴定共沉淀的蛋白质。
该方法适用于研究细胞内和细胞间的蛋白质相互作用，但需要针对每个靶蛋白制备特异性抗体。
3. 原位近距离显微镜法（Fluorescence Resonance Energy Transfer, FRET）FRET是一种用于研究蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过将两个蛋白质分别与一对荧光染料标记，根据能量转移来检测蛋白质间的相互作用。
FRET可以在活细胞和组织中进行，具有高时空分辨率，但需要合适的显微镜设备和特定的染色体系。
4. 表面等离子体共振传感器法（Surface Plasmon Resonance, SPR）SPR是一种用于检测蛋白质相互作用的生物物理化学方法。
该方法通过检测表面等离子体共振信号的变化来定量分析蛋白质间的结合动力学和亲和性。
SPR具有高灵敏度和实时监测能力，可用于定量研究蛋白质相互作用，但需要具备专业的设备和表面修饰技术。
5. 结构生物学方法结构生物学方法包括X射线晶体学、核磁共振（Nuclear Magnetic Resonance, NMR）和电子显微镜（Electron Microscopy, EM）等。