第五章 高效毛细管电泳和电动色谱

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1.40 1.60 1.80 2.00 t/min 2.20 2.40 2.60 2.80
36
35
34 32 33
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30
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18 17 16
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9
13 10
11
12
786
5 2
3Leabharlann 101三、毛细管凝胶电泳
毛细管凝胶电泳 CGE）：按照试样中各个组 分相对分子质量的大小进行分离的方法。 用途：常用于蛋白质、寡聚核苷酸、核糖核 酸、DNA片段的分离和测序及聚合酶链反应产 物的分析。CGE能达到CE中最高的柱效。
• 毛细管等电聚焦是基于不同蛋白质或多肽之 间等电点的差异进行分离的电泳技术。 • 毛细管等电聚焦最具特色的应用是测定蛋白 质的等电点。在异构酶鉴定、单克隆抗体、 多克隆抗体、血红蛋白亚基等研究中，经常 用毛细管等电聚焦。
五、亲和毛细管电泳
亲和毛细管电泳是利用配体与受体之间存在特异性 相互作用，可以形成具有不同荷-质比的配合物而达 到分离目的。
梯度升压方式对毛细管电泳分离的影响 A. 2kV至25kV，0min，一步升压；B.2kV至25kV，5min，线性梯度 升压. 样品：β-乳球蛋白A，溶菌酶，细胞色素C，肌红蛋白，微白蛋白
二、毛细管及其温度控制
毛细管电泳柱作为分离分析的载体，其材料、 形状、内径、柱长、温度对分离度和重现性都 有影响。
缓冲液中加入添加剂，并让缓冲液与毛 细管充分平衡.如加入阳离子表面活性剂 十四烷基三甲基溴化铵(tetradecyl trimethyl ammonium bromide ,TTAB)， 能在内壁形成物理吸附层，使EOF反向. 添加剂还有聚乙烯亚胺、甲基纤维素 (MC)、十六烷基溴化铵(CTAB)等。
一、电泳电压
电泳电压是控制柱效、分离度和分析时间的重要因素。
电泳分离体系的最佳工作电压，与缓冲液浓度、毛细 管内径及长度有关。 除选择工作电压外，还应选择电压施加方式.通常有恒 压、恒流、恒功率、梯度升压、梯度降压等工作模式。
A
B
14.50
17.25
20.00 t/min
22.75
25.50
第五章 高效毛细管电泳和毛细管电 动色谱分析法
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概述 毛细管电泳的基本原理 毛细管电泳装置
毛细管电动色谱
实验技术 应用
第一节 概述
• 电泳：带电粒子在电场作用下于一定介质 中发生定向运动的现象。
• 高效毛细管电泳：以毛细管为分离通道， 以高压直流电场为驱动力进行高效、快速 分离的一种电泳技术。
与电泳类似，常用电渗淌度表示电渗流大小， 如下式所示：
eo E
式中，ν为电渗淌度；μeo为电渗速度.
在电渗流存在的情况下，组分的迁移速度是它的 电泳速度和电渗流速度的总和，可以用下式表 示：
e eo E
二、毛细管区带电泳 特征：是整个系统都用同一种电泳缓冲液充满. 缓冲液由缓冲试剂、pH调节剂、溶剂和添加剂组 成。
1、毛细管的选择
目前多用圆管形弹性熔融石英毛细管，俗称融硅毛 细管。 同样电压下，毛细管孔径越小，电流越小，产生的 焦耳热越少。
毛细管内壁的表面特性对CE的行为有显著影响。
2、 毛细管温度控制
电泳温度的选择应考虑热效应控制、重现 性控制、分离效率控制和分离介质对温度 的限制等因素。 可以用空气循环或水循环的方式降温。
填充柱毛细管电动色谱(PCCEC） 分类 胶束电动毛细管色谱（MECC）
阳极
阴极
溶质
表面活性剂
电泳
电渗流
第五节 实验技术
一、毛细管涂层技术
7种蛋白质在五氟代芳基涂层A和未涂层B毛细 管中的CZE图谱。
A 1 6 8 4 3 2 5 7
16 B
20
24
28
32
36
27
31
35 t/min
39
43
分离原理：当电流通过时，缓冲液中的阳 离子、阴离子分别以恒定的速度向阳极和 阴极移动，由于试样中各个组分间荷质比 的差异，以不同的速度在分立的区带内进 行迁移.如果试样中各个组分的迁移率差别 较大，就能将各个组分分离。
特点：速度快、分辨率高、消耗低等。 水中无机阴离子及有机酸根的分离图谱。
36种阴离子的CZE分离图谱 1.S2O32-；2. Br-；3.Cl-； 4.SO42-；5. NO2-；6. NO3-；7. 钼酸根；8. 叠氮（化物）；9. WO42-；10.一氟磷酸根； 11.ClO3-；12.柠檬酸根；13. F-； 14.甲酸根；15. PO43-；16. 亚磷 酸根；17. 次氯酸根；18. 戊二酸 根；19. 邻苯二甲酸根；20. 半乳 糖二酸根；21. 碳酸根；22. 乙酸 根；23. 氯乙酸根；24. 乙基磺酸 根；25. 丙酸根；26. 丙基磺酸根； 27. 天冬酸根；28. 巴豆酸根；29. 丁酸根；30. 丁基磺酸根；31. 戊 酸根；32. 苯甲酸根；33. L-谷氨 酸根；34. 戊基磺酸根；35. d-葡 萄糖酸根；36. d-半乳糖醛酸根.
2. 压力进样
管中溶液流动，将试样带入。
3. 扩散进样
利用浓度差扩散原理将样品分子引入毛细管
四、检测器
紫外检测器
激光诱导荧光检测器
质谱检测器
电化学检测器
第四节 毛细管电动色谱
毛细管电动色谱：以电渗流为驱动力的一种色谱技 术，并且将CE的高效和HPLC的高选择性相结合，除 可以分离离子化合物外，可以分离不带电荷的中性 化合物。
当电场强度一定时离子的电泳淌度不同，在 电场中的移动速率不一样，利用这个原理 可以将不同的离子彼此分离。
2、电渗流 电渗流是指毛细管中的溶剂在轴向直 流电场作用下而发生的定向流动现象。
界面
N
管 壁
N N N N
扩散层
N
吸附层 紧密层
毛细管内壁的双电层模型 电渗流与高效液相色谱的流型对比 -.荷负电粒子； +.荷正电粒子； N.电中性粒子
一、发展历史
1930年，瑞典化学家Tiselius（1948年荣获诺贝尔化学奖）
1981年，Jorgenson和Lukacs成功地对丹酰化氨基酸样品 进行了快速、高效分离。
目前：分析化学领域中发展最快的分离技术
二、优缺点
样品量少、操作简便、分离效率高、分 析成本低、应用面广。 但CE制备能力差，在进样的准确性和检 测灵敏度等方面比高效液相色谱法略逊。
第六节 应用
• • • • • 离子分析 DNA分析 肽和蛋白质分析 手性分离 药物分析和临床检测
还有一种固体恒温方式，采用热传导系数 高的合金材料制成电热控制器，可以快速 散发焦耳热。
电 流 （μ/A） 50
1
40
2
30
3
0
5
10 t/min
15
20
毛细管电流随时间变化曲线 1.空气自然对流；2.空气强制对流；3.固态 电热冷却。
三、进样
1. 电动进样 试样因离子迁移和电渗作用进入管内。
三、分类
毛细管区带电泳（CZE） 毛细管等速电泳（CITP） 毛细管等电聚焦（CIEF） 毛细管电动色谱（CEC） 亲和毛细管电泳（ACE）
第二节 毛细管电泳的基本原理
一、电泳分离基础 1、电泳淌度
i e e e E E d
式中，ue为电泳淌度；E为电场强度；为组分的分 离度；为组分的电动电位；ε为介质的介电常 数；η为介质的粘度；d为与离子大小有关的常 数
2
1
1 3
2 4 t/min 6 8 2
2
3
4 t/min 6
8
缓冲液加Ca2+ 缓冲液加EDTA 微白蛋白的亲和毛细管电泳分离图谱 1. 电渗峰；2. 蛋白峰；3. 未知组分
第三节 毛细管电泳装置
2
高 压 电 源
3
6 7 4
1 5
毛细管电泳装置示意图 1. 高压电极槽；2. 毛细管；3. 检测器；4. 铂丝电极； 5. 低压电极槽；6. 恒温系统；7. 记录/数据处理.
二、凝胶毛细管制备
聚丙烯酰胺凝胶毛细管制备技术 分为凝胶管结构设计及单体溶液的配 制、毛细管预处理、单体溶液的灌制与控 制、聚合及其速度与方向控制、后续处理 等五个过程。
凝胶管结构设计： 主要包括凝胶浓度、梯度、性质等。 结合分离对象，考虑是否需要使用尿素、 SDS或环糊精等添加剂，是否需要涂层毛细 管内壁，并考虑毛细管的尺寸等。毛细管 结构确定后，即可配制单体溶液。
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蛋白质在APF涂层 和未涂层毛细管中 的CZE图谱 1. 溶菌酶；2. EOF指示剂；3. 核 糖核酸酶；4. 胰 蛋白酶原； 5. 鲸肌红蛋白；6. 马肌红蛋白；7. 人碳酸酐酶B；8. 牛碳酸酐酶B.
毛细管涂层技术通常采用动态修饰和表面 涂层两类方法。 动态修饰方法 表面涂层方法
包括物理涂布、化学键合、溶胶-凝胶法等.最常用的是Si-O-Si-R 键合 方式，采用双官能团的偶联剂，如聚甲基丙烯基硅二醇、3-氨丙基三 甲氧基硅烷等，亲水官能团与管壁表面的硅羟基进行共价结合，使其 牢固地附着于管壁上，再用疏水官能团与涂渍物发生反应形成均匀稳 定的涂层.常用的涂层剂是聚丙烯酰胺、聚乙烯醇、五氟芳基、聚乙二 醇(polyethylene glycol,PEG )等。
线形聚丙烯酰胺溶液分离混合DNA的电泳图谱。
5 6 4 3 2 1 10 15 t/min 20 7
DNA在线形聚丙烯酰胺溶液中的电泳图谱 1. 564bp；2. 2.0kbp；3. 2.3kbp；4. 4.4kbp； 5. 6.6kbp；6. 9.4kbp；7. 23.1kbp.