电泳法和高效毛细管电泳法

第10章 毛细管电泳
3 毛细管凝胶电泳
10.1.3 分离模式
CGE 是毛细管自由溶液区带电泳派生出的一种电泳方 式
用多孔性的凝胶或其它筛分剂作介质，网状结构， 按分子的大小分离
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
毛细管凝胶电泳的特点： 综合了电泳技术和平板凝胶电泳的优点 ， 1. 电泳峰尖锐，柱效极高 2. 短柱上实现极好的分离 3. 试样容量为10－12g 主要缺点:制备柱较困难，寿命较短
6 毛细管等电聚焦
10.1.3 分离模式
CIEF: 建立在不同蛋白质或多肽之间等电点（pI值）差
异基础上的分离方法，通过建立pH值梯度。 蛋白质的等电点(pI):
指蛋白质分子的表观电荷数为零时的pH值。
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
毛细管等电聚焦的实验方法:
进样－等电聚焦－检测
1. 先将脱盐的试样（蛋白质）以≥1％的浓度与两性电 解质溶液混合，用压力进样充入毛细管柱(阳极端)， 置于阳极电解质溶液如H3PO4中，检测端为阴极端， 置于阴极电解质如NaOH中。
已成为分离分析生物大分子如蛋白质、多肽、核酸、DNA等强 有力的工具。例应用CGE分离与激光诱导荧光检测相结合，用 于DNA序列快速分析。
第10章 毛细管电泳
5 毛细管电色谱
10.1.3 分离模式
• CEC:以电渗流驱动流动相， 开管和填充两种，通常填充或涂布固定相
比高效液相色谱具有更高的柱效
第10章 毛细管电泳
区带电泳和等速电泳使用的电解质溶液的不同
• 在区带电泳中，整个系统都用同一种电解质充 满，这种电解质被称为背景电解质或支持电解 质。它运载电流并有一定的缓冲能力。
• 在等速电泳中，不加入这样的背景电解质。
2. 背景电流要小到足以克服区带电泳效应
在毛细管等速电泳中, 由于没有一个背景电解 质支持电流 (毛细管等速电泳要求溶剂的自身 电导可以忽略不计 ), 各区带互相连接.
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
• 毛细管等电聚焦特点:
1. 等电聚焦实际上也是一个试样浓缩过程，这 一过程可用于浓缩试样组分。
2. 具有极高的分辩率，可以分离等电点相差 0.01pH的两种蛋白质.
注意:电渗流的存在会破坏聚焦区带的稳定
第10章 毛细管电泳
7 毛细管等速电泳
10.1.3 分离模式
2. 施加电压，进行电泳实验。两性电解质离子形成pH的 位置梯度，而蛋白质在迁移时会在其等电点的pH区域 内停止移动。这样pI不同的蛋白质各组分会在毛细管 内很窄的不同pH区域内聚焦.
3. 在阳、阴极电解液中加入盐如NaCl或NaOH,破坏pH梯 度，使各组分蛋白质重新带电，在电场力作用下发生 迁移、检测，使不同组分的蛋白质得到分离。
第10章 电泳法和高效毛细管电泳法
(Electrophoresis and High Performance Capillary Electrophoresis, HPCE)
毛细管电泳是带电Baidu Nhomakorabea子在电场力的 驱动下，在毛细管中按其淌度或分 配系数不同进行高效、快速分离的 电泳新技术，也称为高效毛细管电 泳。
加入高于胶束临界浓度的 表面活性剂
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
胶束电动色谱的应用特点:
• 使毛细管电泳不仅能分离离子化合物，而且还能分离 中性化合物.
• 比高效液相色谱更为高效.
HPLC 分离柱效为5000－25000理论板数/m
MECC 可达到50000－500000理论板数/m
• 比高效液相色谱更为高速.MECC分离时间通常小于 30min，但达到相仿效率的毛细管LC，需要更长的时 间。
分离是建立在试样中各组分的电泳淌度不同， 等速电泳中被分析试样进样前后分别使用前导电解 质溶液和终结(后继）电解质溶液，分离后的各组 分区带以相同的电泳迁移速度通过检测窗口。
等速电泳所要求的条件:
1. 特殊的电解质系统:
在毛细管等速电泳中,用有效淌度比样品中任何离子 的有效淌度都大, 并具有一定缓冲能力的离子作为前 导电解质 ( leading electrolyte ), 加入到末端 ( 检测端) 电解槽和毛细管中, 用有效淌度比样品中任 何离子的有效淌度都小, 并具有一定缓冲能力的离子 作为尾随电解质 ( terminating electrolyte ) 加入 起始端电解槽中. 样品加在前导电解质和尾随电解质 之间. 系统中要加入对离子, 以满足电中性的要求.
10.2.3 理论效率及表示方法
1.理论塔板高
H=L/N
N=
5.54(tR/
W )2 ½
W 为电泳峰的半峰宽 ½
实验上可按上式求出理论塔板数
1 毛细管区带电泳（CZE）
也称为毛细管自由溶液区带电泳 毛细管电泳中最基本的操作模式，应用最广泛，是其它 各种操作模式的母体
第10章 毛细管电泳
2 胶束电动毛细管色谱
10.1.3 分离模式
胶束电动毛细管色谱:是以电渗流驱动的一种色谱技术 胶束电动毛细管色谱 MECC:是以胶束为假固定相的一种 电动色谱，是电泳技术和色谱技术的结合
毛细管
数据处理
试样
检测器
电极 缓冲液
高压电源
（可高至30KV）
第10章电泳法和高效毛细管电
10.1.3 分离模式
1 毛细管区带电泳 2 胶束电动毛细管色谱 3 毛细管凝胶电泳 4 亲和毛细管电泳 5 毛细管电色谱 6 毛细管等电聚焦电泳 7 毛细管等速电泳
第10章 毛细管电泳
10.1.3 分离模式
毛细管等速电泳一般用恒流操作模式.
分离开始后, 在电压的作用下, 各组分由于淌度 的不同被分离.
系统通电后, 样品中迁移速度最大的离子运动最快, 但慢于前导电解质. 迁移速度最小的离子运动最慢, 但快于尾随电解质, 具有不同淌度的离子得到分离。
恒稳态时所有区带具有相同的移动速度.
第10章 毛细管电泳
• 20世纪30－40年代 蒂塞利乌斯 (A.W.K.Tiselius） 建立了移动界面电泳，将电泳发 展成分离技术
• 获得1948年诺贝尔化学奖
•
1981,J.W.Jorgenson,K.D.Lu kacs实验上和理论上为毛细 管电泳的发展奠定了基础。
10.1.2 毛细管电泳的原理
1 装置
电极 缓冲液