5-感受态细胞的制备与连接产物转化克隆菌株-PPT课件
合集下载
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化ppt课件
（3）1.5mol/L pH8.8 Tris-HCl缓冲液：称取Tris18.2g，
加入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.8， 最后用蒸馏
水定容至100ml。
（4）1.0mol/LpH6.8Tris-HCl缓冲液：称取Tris12.1g，加
入50ml水，用1mol/L盐酸调pH6.8， 最后用蒸馏水
SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （PAGE）测定蛋白质分子量
பைடு நூலகம்
一. 实验目的
学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量 的原理。
掌握垂直板电泳的操作方法。
运用SDS-PAGE测定蛋白质分子量 及染色鉴定。
2008
分 子实 生验
物 学
二 .实验原理
带电质点在电场中向带有异相电荷的电极移动，这种现 象称为电泳。
1) 溶液中SDS单体的浓度，当单体浓度大于 1mmol/L时大多数蛋白质与SDS结合的重量比 为1:1.4，如果单休浓度降到0.5 mmol/L以下 时，两者的结合比仅为1: 0.4这样就不能消除蛋 白质原有的电荷差别，为保证蛋白质与SDS的充 分结合，它们的重量比应该为1:4或1:3
2) 样品缓冲液的离子强度。SDS电泳的样品缓冲液 离子强度较低，通常是10～100mmol/L
定容至100ml。
（5）0.05mol/LpH8.0Tris-HCl缓冲液：称取Tris0.6g，加
入50ml水，用1mol/L盐酸调pH8.0，最后用蒸馏水定
容至100ml。
2008
分 子实 生验
物
学
（7）10%过硫酸铵(AP) （8）TEMED（四甲基乙二胺） （9）样品溶解液：SDS（100mg）+巯基乙醇（0.1ml）+
大肠杆菌感受态细胞的制备与质粒DNA的转化ppt课件
• 电转化法：使用低盐缓冲液或水洗制备 的感受态细胞，通过高压脉冲的作用将 载体DNA分子导入受体细胞。
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以
满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
21
感受态细胞(Competent cells)
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击 法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜 的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的 载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化（transformation）
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使 受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基 因工程等研究领域的基本实验技术。
2.抗生素使用错 策
用正确的抗生素
误
3.转化后温浴30min左
3.转化后立即涂 板忘记温浴
右，让抗性基因得 以表达
七、问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质 量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体 细胞？各有什么优缺点？
图1
图2
如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性 基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不 成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图2。
• 克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生 素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、 四环素、链霉素等。
重组DNA转化 细菌过程示意图
• CaCl2 法是目前常用的感受态细胞制备方 法，简便易行，且其转化效率完全可以
满足一般实验的要求，制备出的感受态 细胞暂时不用时，可加入占总体积15％ 的无菌甘油于-70℃保存(半年)，因此 CaCl2法使用更广泛。
此课件下载可自行编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
21
感受态细胞(Competent cells)
受体细胞经过一些特殊方法（如：电击 法， CaCl2等化学试剂法）的处理后，细胞膜 的通透性发生变化，成为能容许外源DNA的 载体分子通过的感受态细胞(competent cell) 。
转化（transformation）
是将异源DNA分子引入一细胞株系，使 受体细胞获得新的遗传性状的一种手段，是基 因工程等研究领域的基本实验技术。
2.抗生素使用错 策
用正确的抗生素
误
3.转化后温浴30min左
3.转化后立即涂 板忘记温浴
右，让抗性基因得 以表达
七、问题与讨论
1.感受态细胞有何特点？如何保证它的质 量？
2.如阴性对照中长出菌，原因？
3.还有哪些方法可以将外源基因导入受体 细胞？各有什么优缺点？
图1
图2
如果转化成功，由于质粒DNA上带有Amp抗性 基因导致本来Amp敏感的菌株也可以在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图1。如转化不 成功则Amp敏感的菌株和阴性对照不会在含有 Amp的LB固体培养基上生长，如图2。
• 克隆的筛选：
主要用不同抗生素基因筛选。常用的抗生 素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、 四环素、链霉素等。
重组DNA转化 细菌过程示意图
实验感受态细胞制备及转化
DNA转化过程
准备感受态细胞
通过不同方法制备感受态细胞，如CaCl2法、 电穿孔法等。
转化反应
将混合物在适宜温度下进行转化反应，使 DNA进入细胞内。
DNA与感受态细胞混合
将DNA与感受态细胞混合，加入适量的转化 缓冲液。
细菌培养
将转化后的细菌在选择性培养基上培养，筛 选阳性克隆。
04
转化后处理
鉴定方法
采用适当的鉴定方法，如免疫荧光染色、PCR扩 增等，对筛选出的细胞进行鉴定，以确定其性质 和特征。
结果分析
对筛选和鉴定结果进行分析，比较不同实验条件 下的细胞性质和特征，为后续实验和应用提供依 据。
05
实验总结与讨论
实验结果分析
转化效率
实验结果显示，经过制 备的感受态细胞在转化 过程中表现出较高的转 化效率，成功将外源 DNA导入细胞内。
实验设备
01
培养箱
用于细菌培养。
02
离心机
用于细菌收集和洗涤。
03
冰盒
保持低温环境。
04
转化仪或电击器
用于感受态细胞的转化。
实验试剂
无菌水
用于洗涤和稀释细菌。
抗生素
用于抑制细菌生长，如Ampicillin。
抗性培养基
适合筛选转化子的培养基，如X-Gal、IPTG等。
02
感受态细胞制备
细胞培养
细胞生长状态
观察细胞生长状态发现， 感受态细胞在转化后能 够迅速恢复生长，表明 外源DNA已成功整合到 细胞基因组中。
分子鉴定
通过分子生物学手段对 转化子进行鉴定，证实 外源DNA已成功导入细 胞并表达。
实验结论
01
本实验成功制备了用于DNA转化 的感受态细胞，并验证了其高效 的转化能力。
实验-大肠杆菌感受态细胞的制备与转化26页PPT
10、一个人应该：活泼而守纪律，天 真而不 幼稚， 勇敢而 鲁莽， 倔强而 有原则 ，热情 而不冲 动，乐 观而不 盲目。 ——马 克思
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
实验-大肠杆菌感受态细 胞的制备与转化
6、纪律是自由的第一条件。——黑格 尔 7、纪律是集体的面貌，集体的声音， 集体的 动作， 集体的 表情， 集体的 信念。 ——马 卡连柯
8、我们现在必须完全保持党的纪律， 否则一 切都会 纽斯
谢谢
11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升自我。——迈克尔·F·斯特利
实验-大肠杆菌感受态细 胞的制备与转化
6、纪律是自由的第一条件。——黑格 尔 7、纪律是集体的面貌，集体的声音， 集体的 动作， 集体的 表情， 集体的 信念。 ——马 卡连柯
8、我们现在必须完全保持党的纪律， 否则一 切都会 纽斯
课件：大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
实验材料与耗材
➢ 实验材料：大肠杆菌菌株JM109细胞，待转化的重 组DNA分子（含有Ampr）。
➢ 耗材：培养皿，三角瓶，玻璃推子，移液器（规 格1000μl、100μl、10μl），1.5ml离心管。
➢ 试剂：CaCl2，胰蛋白胨，酵母提取物，NaCl， NaOH，氨苄青霉素
实验步骤
菌株活化 ➢ 用接种环直接取冻存的大肠杆菌DH5α，体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,其它 操作与上面相同。此组正常情况下在含抗生素的LB 平板上应没有菌落出现。 对照组2: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液,但 涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上， 此组正常情况下应产生大量菌落。
实验步骤
转化率统计 转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
实验目的
1、学习和掌握CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞的实验技术。 2、掌握热激转化实验技术。
实验原理
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指外 源DNA导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗 溶液中，菌体细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗 DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间 热激处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择 性培养基中保温复苏一段时间，促使在转化过程中获得的新 的表型（如Amp）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有 氨苄青霉素的选择性培养基上，进行转化结果的筛选。
预冷10min ➢ 4000rpm离心5 min,弃上清 ➢ 加入0.2ml预冷的0.1mol/l CaCl2,悬浮沉淀，即
可使用。也可加入总体积15％的甘油70℃长期 保存
实验步骤
转化 ➢ 取目的DNA加入大肠杆菌感受态细胞中，于冰上放
最新医学类-感受态细胞的制备与质粒DNA的转化精品课件
第十四页，编辑于星期六：十二点 三十分。
四、注意事项
➢ 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯 度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干 燥的冷暗处。
➢ 4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在 无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好 是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且 注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否 则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛 选、鉴定带来不必要的麻烦。
第九页，编辑于星期六：十二点 三十分。
二、材料、设备及试剂
菌种 :E. coli DH5a(空)、 E. coli K12(空) 设备 :eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl), 台式高速离心机, 涡旋振荡器 试剂:LB液体培养基 、 0.1mol/L CaCl2 、 Amp
第十六页，编辑于星期六：十二点 三十分。
五、质粒DNA转化常见问题
问题二:实验组只有白色菌落(没有蓝色菌落)
原因
1. 未加IPTG/X-Gal或
其失效
2. 抗生素失活,敏感菌 对
亦能生长
策
3. 用于制备感受态的
菌株退化,丢失了某
些重要因子
1. 检查平板是否含有IPTG/X-Gal 以及是否新鲜,如平板有问题, 重新制备新鲜平板
第十页，编辑于星期六：十二点 三十分。
一、感受态细胞的制备
(一)、受体菌的培养 (二)、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将1.5ml(每人)培养液转入离心管中, 于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上
四、注意事项
➢ 3. 试剂的质量: 所用的试剂,如CaCl2 等均需是最高纯 度的(GR.或AR.),并用超纯水配制,最好分装保存于干 燥的冷暗处。
➢ 4. 防止杂菌和杂DNA的污染:整个操作过程均应在 无菌条件下进行, 所用器皿, 如离心管, tip头等最好 是新的,并经高压灭菌处理,所有的试剂都要灭菌,且 注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染, 否 则均会影响转化效率或杂DNA的转入, 为以后的筛 选、鉴定带来不必要的麻烦。
第九页，编辑于星期六：十二点 三十分。
二、材料、设备及试剂
菌种 :E. coli DH5a(空)、 E. coli K12(空) 设备 :eppendorf管、微量取液器(20μl,200μl,1000μl), 台式高速离心机, 涡旋振荡器 试剂:LB液体培养基 、 0.1mol/L CaCl2 、 Amp
第十六页，编辑于星期六：十二点 三十分。
五、质粒DNA转化常见问题
问题二:实验组只有白色菌落(没有蓝色菌落)
原因
1. 未加IPTG/X-Gal或
其失效
2. 抗生素失活,敏感菌 对
亦能生长
策
3. 用于制备感受态的
菌株退化,丢失了某
些重要因子
1. 检查平板是否含有IPTG/X-Gal 以及是否新鲜,如平板有问题, 重新制备新鲜平板
第十页，编辑于星期六：十二点 三十分。
一、感受态细胞的制备
(一)、受体菌的培养 (二)、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将1.5ml(每人)培养液转入离心管中, 于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶液1ml轻轻悬浮细胞,冰上
感受态细胞制备ppt实用资料
LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
实验注意事项
1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃ 的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用 于制备感受态细胞的菌液。
L加再密B去将度液离 该 过体子菌高培水悬或养至液不基总以足：体均称1:积会取10影1蛋0L响-，白1:转高胨5化0压(T的效下ry比p率蒸to例。气n接e灭)1种菌0于2g0，1m0酵0inm母。L提L取B液物体(Y培ea养st基ex中tr，ac3t)75℃g振，荡N培aC2养l 120-g3，h 至溶O于D860000m为l去。离子水中，用 NaOH 调pH至，
2. 影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？
L感B受固态体细培胞养分基装：成液体20培0μ养L的基小中份每，升贮加存12于g琼-7脂0℃粉可，保高存压半灭年菌。。
② 弃去上清，用预冷的 mol/L 的CaCl 溶液10mL轻轻悬浮细胞， D感H受5α态菌细株胞的的O制D备600( 为Ca时C，l2细法胞) 密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。
③ 25溶0m液L重：蒸称水取中0.，28定g 容Ca至C1l20(0无m水L，,分高析压纯灭)菌，。溶于
实验仪器
台式高速冷 冻离心机
恒温摇床
制冰机
实验步骤
1. 菌体的培养
① 受 体 菌 的 培 养 从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α 单 菌 落 ， 接 种 于 3-5mL LB液体培养基中， 37℃下振荡培养 12h 左右，直至对数生长后期。
将经过转化后的细胞在筛选培养基中培养，即可筛选出转化子（Transformant，即带有异源DNA分子的受体细胞）。
进入受体细胞的DNA分子通过复制，表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
实验注意事项
1. 细胞生长状态和密度：不要用经过多次转接或储于４℃ 的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用 于制备感受态细胞的菌液。
L加再密B去将度液离 该 过体子菌高培水悬或养至液不基总以足：体均称1:积会取10影1蛋0L响-，白1:转高胨5化0压(T的效下ry比p率蒸to例。气n接e灭)1种菌0于2g0，1m0酵0inm母。L提L取B液物体(Y培ea养st基ex中tr，ac3t)75℃g振，荡N培aC2养l 120-g3，h 至溶O于D860000m为l去。离子水中，用 NaOH 调pH至，
2. 影响感受态细胞转化效率的因素有哪些？
L感B受固态体细培胞养分基装：成液体20培0μ养L的基小中份每，升贮加存12于g琼-7脂0℃粉可，保高存压半灭年菌。。
② 弃去上清，用预冷的 mol/L 的CaCl 溶液10mL轻轻悬浮细胞， D感H受5α态菌细株胞的的O制D备600( 为Ca时C，l2细法胞) 密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。
③ 25溶0m液L重：蒸称水取中0.，28定g 容Ca至C1l20(0无m水L，,分高析压纯灭)菌，。溶于
实验仪器
台式高速冷 冻离心机
恒温摇床
制冰机
实验步骤
1. 菌体的培养
① 受 体 菌 的 培 养 从 LB 平板上挑取新活化的E. coli DH5α 单 菌 落 ， 接 种 于 3-5mL LB液体培养基中， 37℃下振荡培养 12h 左右，直至对数生长后期。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
LB培养基（4mL，含12.5μg/mL Tet） 37 ℃ 、190rpm振荡培养过夜
扩 大 培 养: (今天早晨)
0.4mL预培养菌液
＋
40mL LB液体培养基（含12.5μg/mL Tet） 37 ℃ 、250rpm振荡培养2.5-3小时
收集细胞： 终止培养（OD600 0.4-0.5 ）
转移菌液到50mL离心管中，冰浴10min
表达宿主系统
大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、哺乳动物细胞、昆虫、酵母、植物 实验中，要根据所要表达的蛋白质的大小、蛋白质的需要量、 是否需要活性以及实验室的条件等综合考虑选择合适的宿主-载 体系统 大肠杆菌遗传图谱明确，容易培养，费用低，已有许多成功的 先例，是首选的表达系统，但大肠杆菌中缺少翻译后修饰系统， 一些修饰后才有活性的蛋白必需选择真核细胞为宿主 分离基因 构建重组载体 转化 筛选鉴定
Q&A
•关于酶切/连接的结果
预期结果
P V0 V1 V1’ M
2000bp 1000bp 750bp 500bp
250bp 100bp
酶切产物的琼脂糖电泳（1%）
P:双酶切的PCR产物; V0：未酶切的质粒; V1：酶切不完全的质粒;
V1’:完全酶切的质粒; M:分子量标准（DL2000)
我们的结果
表达与优化表达条件
Inductive Expression -- Introduction
BL21是应用最广的宿主菌来源，具有lon和ompT蛋白酶缺陷的优点 . （DE3）宿 主菌是lDE3溶原菌，染色体上带有一拷贝由lacUV5启动子控制的T7 RNA聚合酶 基因。这类菌株配合pET载体一起表达。pLysS是带有可以与pET共存的、编码T7 溶菌酶（T7 RNA聚合酶的天然抑制物）的质粒。 pLysS 菌株在被诱导前T7 RNA 聚合酶的基础表达被抑制，这样可以使表达会影响宿主细胞生长和活力的重组 体在宿主中更稳定。带有pLacI质粒的宿主菌产生额外的抑制pETBlue和pTriEx 载体基础表达的lac阻遏蛋白。 NovaBlue是一种适合用作初始克隆宿主菌的K-12菌株，具有高转化效率、蓝/ 白斑筛选能力（与相应的质粒配合使用）和促进质粒DNA高产的recA endA突变。 由于存在F附加体编码的lacIq阻遏蛋白，NovaBlue的DE3溶原菌是一个非常有 用的严紧型宿主菌。 TunerTM菌株是BL21的lacZY缺失突变株，能够同时调整同一培养体系中所有细胞的 蛋白表达水平。lac通透酶（lacY）突变使得IPTG均匀进入群体所有细胞，从而获 得浓度依赖的、水平均一的诱导。通过改变IPTG浓度，表达可从极低水平调节到极 强的、完全诱导的表达水平（通常与所使用的pET载体相关）。低水平表达可以增 强难表达蛋白的溶解性和活性。Tuner（DE3）pLacI菌株可与pETBlue和pTriExTM载 体的配合使用。
Lane 10: 分子量标准（DL2000)
我们的结果
3组 4组
Байду номын сангаас
5组的PCR酶 切
6组
DL15000分子量分布（bp）：15000，10000，7500，5000，2500，1000
我们的结果
5组的质粒酶切
7组的质粒酶切酶切
没有切开？还是电泳行为异常？需要鉴定。
Q&A
• 关于酶切产物的回收 胶回收：更纯，相对回收率低； 液体直接回收：相对回收率高。 • 酶的量：酶的星号活力；
基因的克隆与表达专题之四
感受态细胞的制备 & 连接产物转化克隆菌株
Inductive Expression -- Introduction
pETBlue System：
蓝白筛选：其具有的大肠杆菌tet启动子是弱的组成型启动子，驱动
下游LacZ α -片段表达实现蓝白筛选； 高效可诱导表达：高效表达外源蛋白。pETblue系统可选用NovaBlue (λCE6,在λPL启动子的驱动下表达T7RNA聚合酶的噬菌体)或 TunerTM(DE3)pLacI菌株做宿主菌。这些宿主的基因组上带有
lacUV5启动子控制的 T7RNA聚合酶基因，可以实现IPTG诱导。
低本底表达：由于T7-lac启动子驱动的外源基因的表达方向与tet启动 子驱动的LacZ α -片段表达的方向相反，所以此系统基本没有外源基 因的本底表达。
Inductive Expression -- Introduction
Inductive Expression -- Introduction
pETBlue系统调控元件
IPTG诱导
大肠杆菌
RNA聚合酶
IPTG诱导
T7RNA聚合酶
LacO
T7 RNA聚合酶基因1 T7RNA聚合酶
LacO
靶基因
Lac启动子 DE3 Lac阻遏物 pLacI
T7启动子
Lac阻遏物
LacI
大肠杆菌基因组
LacI TunerTMDE3LacI
pETBlue
Α互补：
ω片段（无活性，宿主）
+ β-半乳糖苷酶（活性）
α片段（无活性，载体）
X-gal（无色） β-半乳糖苷酶
深蓝色
X-gal：5-溴-4-氢-3-吲哚-β -D半乳糖苷
无菌 轻柔
冰浴
制备感受态细胞
预 培 养: (昨天下午)
NovaBlue
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
真不 错
1 2 3 4 5 6 7 A B CD E FG H M
酶切产物的琼脂糖电泳（1%）
Lane1～4：双酶切的PCR产物 Lane6～9：双酶切的质粒 lane 5： 未酶切的质粒
酶切产物的琼脂糖电泳（1%）
Lane1～7：双酶切的PCR产物 LaneB～H：双酶切的质粒 lane A： 未酶切的质粒 Lane M: 分子量标准（DL2000)
离心（4℃， 4000rpm × 10min ）！！！
弃液: 倒出培养液，将管倒置使培养液流尽
制备感受态：
穿孔：加入预冷的CaCl2（ 0.1 mol/L，10mL） 轻柔吹悬菌体细胞（用5 mL枪头） 冰浴 30min 收集：离心(4℃，4000rpm × 5min)，充分弃上清 保存：预冷的CaCl2 （0.1 mol/L， 2mL） 感受 冰上轻柔吹悬菌体细胞 态 分装保存：200uL/份（ -20 ℃短期或-70 ℃稍长期冻存）