茶树EST序列中微卫星标记的特征分析及应用

茶树EST序列中微卫星标记的特征分析及应用摘要：从NCBI数据库中获得47 913条茶树（Camellia sinensis）EST序列，通过Cd-hit-est除去冗余序列后得到26 185条非冗余序列，利用Misa软件分析后共发现8 244个微卫星标记分布于6 283条EST序列中，平均相隔1.52 kb出现1个SSR，EST-SSR序列出现频率为23. 99%。

其中，单、二和三核苷酸重复为主导类型，占EST-SSR 总数的97.83%。

A/T、AG/CT和AAG/CTT作为单、二和三核苷酸的优势重复基元，分别占所属类型的92.99%、85.11%和26.99%。

利用Primer 5.0软件，设计了76对引物进行多态性检测，发现其中59对引物可以扩增出明显的条带，34对引物具有多态性，多态性比率高达57.63%，表明茶树EST-SSR中的多态性位点比较丰富，比较适合进行大规模的EST-SSR多态性标记的筛选。

关键词：茶树（Camellia sinensis）；EST-SSR；分布特征微卫星DNA又称简单重复序列（Simple sequence repeat，SSR），是基因组中由1～6个核苷酸组成的基本单位重复构成的一段DNA序列。

与其他分子标记相比，微卫星DNA多态性高、数量丰富并重复性好，而且具有遗传共显性、对基因组有很好的覆盖性和操作简便等特点[1-3]。

根据SSR标记来源的序列性质不同，SSR标记可分为基因组SSR（Genomic SSR，gSSR）和表达序列标签SSR（Expressed sequence tag SSR，EST-SSR）两种。

gSSR标记是来源于整个基因组的，而EST-SSR标记则来源于基因组的转录区域即表达区，可以直接反映功能基因的多态性，为功能基因的直接鉴定提供了可能性，具有通用性更高的优点[4]。

我国是茶树（Camellia sinensis）的原产地，茶树也是我国目前非常重要的经济作物。

截至2013年5月，在GeneBank中可获得47 913条茶树EST序列，相比2010年5月时，增加了3倍[5]。

基于茶树EST序列信息的快速扩增，本研究对已有的茶树EST序列中SSR信息进行了全面的发掘，对其组成、特征及分布进行了分析，同时设计了76对EST-SSR引物，并对19份茶树样品材料进行了多态性分析，从而开发了可以用于茶树的EST-SSR标记，为开发新的茶树功能基因组SSR标记提供了理论依据，为建立茶树EST-SSR标记和探索其在功能基因发掘、种质鉴定、遗传多样性分析中的应用奠定了基础。

1 材料与方法1.1 EST序列的获得1.2 EST-SSR的搜索与预处理1.3 EST-SSR引物的设计与合成1.4 基因组DNA提取与PCR扩增试验中所用的19份茶树样品材料来自中国农业科学院茶叶研究所和湖北省农业科学院果树与茶叶研究所。

采用天根生化科技（北京）有限公司植物基因组DNA提取试剂盒提取每个样品材料的基因组DNA，用1%琼脂糖凝胶电泳检测其基因组DNA质量，-20 ℃下保存备用。

PCR反应体系为15 μL，包括2×PCR Master Mix 7.5 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.6 μL，基因组DNA 1.0 μL，ddH2O 补至15 μL。

PCR 反应在Bio-Rad S-1000TM PCR仪上进行。

反应程序为：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，最适退火温度退火30 s，72 ℃延伸 1 min，35个循环；最后72 ℃延伸10 min，结束后将产物置于4 ℃保存。

PCR 扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性，250 V 电泳 2.5 h，电泳结束后银染显色，并记录。

2 结果与分析2.1 EST-SSR分布频率及特点47 913条茶树EST 序列经拼接处理后共获得26 185 条无冗余、高质量的EST序列。

运用Misa软件对26 185条共12 552 726 bp的非冗余EST序列进行SSR 搜索得到6 283条微卫星序列，占EST总数的23.99%。

经过统计分析发现，1～6个碱基的排列组合重复均能被检出，但各种类型的EST-SSR 出现的频率数量大不相同，共有4 153个单核苷酸型SSR、2 935个二核苷酸型SSR、977个三核苷酸型SSR、76个四核苷酸型SSR、41个五核苷酸型SSR 及62个六核苷酸型SSR。

如图 1 所示，从微卫星数目的角度分析，以单核苷酸重复的数目最多，占50.38%；其次是二核苷酸重复和三核苷酸重复，分别占35.60%和11.85%；五核苷酸重复所占比例最低（0.50%）。

单、二和三核苷酸为主要重复类型，占EST-SSR 总数的97.83%，基元长度大于或等于4的核苷酸重复所占的比例极小，仅为2.17%。

2.2 EST-SSR 基元类型和比例从图2可以看出，单核苷酸重复类型中，A/T重复频率最高，占单核苷酸重复数目的92.99%；二核苷酸重复类型中AG/CT重复数目最多（2 498个），占二核苷酸重复数目的85.11%，AC/GT和AT/AT重复频率相当，没有出现GC/GC 重复类型；三核苷酸重复10 种类型中，AAG/CTT重复频率最高（26.99%），其次分别是ACC/CTG（21.29%）、ATC/ATG（13.20%），其他7种基元的频率均不高于10%；四核苷酸重复类型发现了14种，除AAAC/GTTT（14.47%）、AAAG/CTTT（23.68%）和AAAT/ATTT（13.16%）外，其他类型重复出现的频率均较低，重复数目低于10个；五、六核苷酸重复数目分别有41个和62个，但是出现次数都很少，均为个位数。

2.3 茶树EST-SSR引物的多态性分析利用Primer 5.0软件，在26 185条EST序列中随机选取了其中含有SSR位点的序列进行引物设计，共设计了76对EST-SSR引物。

利用这76对EST-SSR 引物对19份茶树样品进行分析，结果发现其中59对引物能够扩增出较清晰的条带，其余17对引物无明显条带，即未能扩增出产物。

在可扩增出的较清晰条带引物中，42对引物的扩增条带大小与预期片段大小相近，另外17对引物扩增条带大小明显与预期不符。

其中，34对引物能够扩增出多态性条带，多态性引物占扩增引物的57.63%，占所有设计引物的44.74%。

图3为引物A41、A58在19份茶树样品中的扩增结果，把这两个引物结合起来足以有效区分19份茶树样品。

3 小结与讨论本研究对47 913条茶树EST序列进行了EST-SSR特征分析。

结果表明，茶树EST序列中分布的微卫星序列相当丰富，含不同重复基元SSR的EST序列有6 283条，约占EST序列的13.11%，该筛出率高于已报道的高梁（Sorqhum bicolor L. Moench）（3.6%）、大麦（Hordeum vulgare）（3.4%）和小麦（Triticum aestivum Linn.）（3.2%），表明茶树EST-SSR标记具有一定的开发潜力。

其中共8 244个EST-SSR序列，平均相隔1.52 kb出现1个SSR，出现频率明显高于小麦[7] （1/15.6 kb）、柑橘（Citrus reticulata Blanco）[8]（1/5.7 kb）、大麦[9]（1/6.3 kb）和杨树（Populus L.）（1/14.0 kb）[10]等植物，这表明茶树转录组中SSR数量很丰富，这种差异可能与搜索SSR的算法（如参数设定）等多种因素有关。

当4种不同的碱基随机组合时，将可能分别产生2、4、10、33、102和350种单、二、三、四、五、六核苷酸重复[11]。

本研究中单核苷酸的2种重复和三核苷酸的10种重复均有出现，二核苷酸重复中仅缺乏GC/GC重复类型，但大多数四、五和六核苷酸重复均未出现，表现出明显的偏倚性，且每一种重复类型所占比例也各不相同。

单核苷酸重复是主导类型，其次是二核苷酸和三核苷酸。

单核苷酸中A/T出现频率最高，是所有单核苷酸重复类型的92.99%。

在二核苷酸重复类型中所占比列最重的是AG/CT，是所有二核苷酸重复类型的85.11%，没有出现CG/CG重复。

三核苷酸类型中，AAG/CTT、ACC/CTG和A TC/ATG等排列组合出现频率比较高，依次所占比列为26.99%、21.29%和13.20%。

这与金基强等[5]报道的茶树EST-SSR 中的优势重复类型是一致的。

本研究利用EST序列共设计了76对EST-SSR引物，并对19份茶树样品进行了检测分析，共筛选出具有多态性的SSR引物34对，多态性引物比例为44.74%。

有17对引物不能进行有效扩增，其原因可能是由于扩增区段存在较为复杂高级结构或者是上、下游引物含有内含子。

综上所述，茶树EST-SSR基元重复类型丰富，多态性位点也较丰富，因此，获得的SSR标记具有较高的可用性，对于丰富其分子标记类型及数量、建立遗传图谱及进行比较基因组研究都有重要意义。

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