丹参毛状根生物反应器大规模培养的研究_邱德有

分子植物育种 !!""# 年 ! 第 ! 卷 ! 第 $ 期 ! 第 %&&’ (") 页 *+,-./,0123,045261--7849:2!""#:2;+,<!:2=+<$:2%&&’ (")
研究报告
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丹参毛状根生物反应器大规模培养的研究
邱德有 FG2 宋经元 !2 马小军 !2 祁建军 !2 张荫麟 !2
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分子植物育种
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丹参 C!"#$%" &%#’%())*%+"D 是我国传统中 药 ! 具 有 活血化淤 ! 通经止痛的功能 " 丹参中含有二类活性 成分 # 脂溶性二萜类化合物和水溶性酚酸类化合物 $ E$$*$.*(’FB?GHIJK?L"M"N(O(?$.?(’FB?GHHP% & 二萜类化 合物 ! 如丹参酮 Q’ 丹参酮 QQR ’ 隐丹参酮 等 ! 具 有 抑 制血小板 聚 集 ’ 耐 缺 氧 ’ 改 善 冠 状 动 脉 供 血 等 药 理 作用 ! 是治疗心血管系统疾病的重要药物 " 酚酸类 化合物 ! 如丹酚酸 R’ 丹酚酸 @ ’ 紫草酸 ’ 迷迭香酸 ’ 原儿茶醛 ’ 丹参素等 ! 具有很强的抗脂质氧化 ’ 抗肝 纤维化 ’ 改善尿毒症 ’改善肾功能等作用 " 但是由于 丹参有效成分在原植物根中含量低 ’ 生长周期长 B? 加之近年来产地环境污染和为防病虫喷施农药等 原因 ! 使得原料药的供应在数量和质量上都不能满 足临床应用的需要 " 在短时间内大量繁殖有效成分 含量高且无污染的绿色丹参原料药就成为丹参这 种重要中药资源开发与利用的当务之急 " 毛状根培养是 IP 年代发展起来的基因工程和 细胞工程相结合的一项新技术 ! 它是将发根农杆菌 的 S1 质 粒 中 含 有 的 TU9VR 转 化 到 植 物 细 胞 的 是分化程度较高的器官 ! 具有一定的形态结构 ! 因 此它的培养与悬浮细胞培养不同 & 丹参毛状根培养 研究B 目前处于实验室三角瓶摇瓶培养阶段 & 利用生 物反应器大规模培养丹参毛状根 ! 至今尚未见有报 道 & 为了尽快实现丹参毛状根的工业化大量生产的 目标 ! 解决了当前丹参生产中存在的产量不足 ’ 质 量难以控制等问题 ! 很有必要进行丹参毛状根生物 反应器培养的研究 & 为此 ! 我们利用球状气升式反 应器进行了丹参毛状根大规模培养的试验 ! 对丹参 毛状根在球状气升式反应器和三角瓶培养中总丹 参酮的含量进行了比较研究 ) 而且我们以水溶性成 分 ( 原儿茶醛和丹酚酸 @% 为监测对象 ! 利用 J\E 的 气升式反应器进行了进一步的放大试验 & 这些试验 均获得了令人满意的结果 ! 为今后丹参毛状根的工 业化生产奠定了基础 ! 对于丹参这一名贵植物资源 的持续开发与利用以及绿色原料药的生产具有十 分重要的意义 & 现将有关方法及结果报道如下 #
关键词
丹参 !毛状根 !生物反应器 !大规模培养
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TU9VR 上 ! 使 植 物 细 胞 诱 导 产 生 毛 状 根 WX,1)=? )"".>D! 这种由发根农杆菌感染药用植物形成的毛状
根 ! 生长速度快 ! 遗传性稳定 ! 成为颇具潜力的培养 系统 " 据不完全统计 ! 已有 YG 科 GPP 余种植物建立 了毛状根培养系统 ! 其中不少是药用植物 " 至今 ! 黄 花烟草 ’ 曼陀罗 ’ 颠茄 ’ 莨菪 ’ 长春花 ’ 紫草 ’ 辣根 ’ 孔 雀草毛状根的小规模培养已经成功 ! 人参皂甙 ’ 黄 连素等已通过毛状根培养法得以工业化生产 " 利用 毛状根培养技术大规模生产有用药物呈现出十分 诱人的前景 " 利用丹参毛状根生产其有用成分已经有人做 过尝试 !<& 和 R’Z$)[,-( GHHY% 曾从丹参中诱导出 毛状根并对其脂溶性活性成分进行了详细的研究 & 接着 ! 黄炼栋等人 WGHHJD 还证明 丹 参 毛 状 根 能 产 生 水溶性酚酸类化合物 ! 张荫 麟 等 人 WGHH\D 也 成 功 地 建立了丹参毛状根的三角瓶培养系统 ! 并利用诱导 子技术 ! 使丹参酮的含量已接近生药水平 & 这些工 作为今后丹参毛状根培养的中试乃至工业化生产 奠定了一定的基础 & 植物毛状根大规模培养的关键在于其生物反 应器培养技术 ( 邢建民等 B?GHHJ% & 由于丹参毛状根
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丹参毛状根生物反应器大规模培养的研究
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ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
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采用原位高温蒸汽灭菌法进行灭菌 ! 当反应器中的 培养基冷却至室温后 " 用火焰接种法将丹参毛状根 切段接入反应器中 ! 反应器的通气量为 !"!#$$% ! 有 关培养也在 &#’ 中进行 ! 培养 #!( 后收获毛状根 " 测定其鲜重 " 并经 )!* 烘干至衡重时测定其干重 量 ! 采用孙丕和何丽一 # +,,)$ 报道的高效液相色谱 # -./0$ 法测定丹参毛状根中的原儿茶醛和丹酚酸
为上大下小 " 当球状气升式反应器中培养的丹参毛 状根生长出大量的白色毛状根并逐渐分枝交织成 一定大小的毛状根球后 " 促使一部分毛状根开始露 出液面 " 而一部分仍然没在培养基中 " 这既能够得 到足够的营养供应 " 又可使其通气条件大为改善 ! 而三角瓶中培养的丹参毛状根由于一直浸没在培 养液中 " 通气状况明显不如球状气升式反应器中培 养的丹参毛状根 " 所以增殖速度不如前者 ! 利 用 )#/ 的 气 升 式 反 应 器 进 行 进 一 步 的 放 大 培养试验后 " 发现在 )#/ 的气升式反应器 8 图 35#9 培 养 #!( 时 所 获 得 的 丹 参 毛 状 根 : 图 35;9 中 原 儿 茶 醛 和 丹 酚 酸 1 的 含 量 可 占 根 干 重 的 !"!&!6< 和