植物生物反应器的研究进展及发展方向

植物生物反应器的研究进展及发展方向
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（内蒙古科技大学生物技术系）
摘要利用转基因植物作为生物反应器生产外源蛋白,包括抗体、疫苗、药用蛋白等较之其他生产系统具有很多优越性。

本文简介了植物生物反应器的研究发展历史和现状, 并对植物生物反应器领域的发展作了一定的展望和讨论。

关键词植物抗体; 口服疫苗; 药用蛋白;转基因; 生物反应器
植物生物反应器是生物反应器研究领域中的一大类, 是指通过基因工程途径, 以常见的农作物作为化学工厂，通过大规模种植生产具有高经济附加值的医用蛋白、工农业用酶、特殊碳水化合物、生物可降解塑料、脂类及其他一些次生代谢产物等生物制剂的方法[1]。

1 植物生物反应器研究内容
1.1植物抗体(plantibody)
抗体(antibody) 是动物体液中的一系列球蛋白,称为免疫球蛋白(Ig) 。

它们可介导动物的体液免疫反应。

在植物体内表达编码抗体或抗体片段(如Fab 片段和Fv 片段) ,获得的产物就称为植物抗体。

植物抗体最大的优点是使生产抗体更加方便和廉价。

尤其在生产单克隆抗体方面,利用植物生产要比杂交瘤细胞低廉的多。

据估计,在250 m2 的温室中利用苜蓿生产IgG的成本约为500～600美元/ g ,而利用杂交瘤细胞生产抗体的成本约为5 000 美元/g 。

因此,利用植物生产抗体具有广阔的市场前景。

目前,利用转基因植物表达的抗体包括完整的抗体分子、分泌型抗体IgA、IgG、单链可变区片段(scFv) 、Fab 片段、双特异性scFv 片段以及嵌合型抗体等不同类型的抗体。

植物不仅作为生物反应器器生产抗体用于医药产业,而且植物抗体介导的免疫调节在植物抗病育种上也很值得研究。

Fecker 等将抗甜菜坏色黄脉病毒(BNYVV) 的外壳蛋白基因的scFv 转化烟草,产生的scFv 定位于细胞质中或通过末端的连接信号肽而分泌到质外体,结果发现转scFv 的植株出现症状的时间明显迟于对照。

Tavladoraki 等将抗菊芋斑驳病毒(AMCV) 的外壳蛋白基因的scFv 转入烟草后,发现感病率下降50～60 % ,出现症状的时间也明显迟于对照。

LeGall 等将针对僵顶病植原体主要膜蛋白的scFv 转入烟草中,并通过细菌信号肽把scFv 定位到质外体,将转基因烟草接穗嫁接到被植原体侵染的砧木上,没有表现病症,而对照的非转基因接穗却出现严重的僵顶病症状甚至死亡。

另外,在植物细胞中表达具有催化或钝化酶和激素作用的抗体,从而对细胞代谢进行调节,这对于植物代谢机理的研究非常有用。

Owen 等将植物光敏色素单链Fab 抗体转入烟草中,转基因烟草光敏色素下降40 % ,而且该转基因烟草种子表现出异常的依赖光敏色素萌发的能力。

Shimada等在烟草内质网中高效表达了抗赤霉素前体分子A19/ 24 的scFv ,A19 和A24 分别是A1 和A4 的前体,转基因烟草中A1含量降低并表现矮化[2]。

1.2口服疫苗(edible vaccine)
传染病严重威胁人类的生命和健康,一直以来人类获得免疫预防主要通过疫苗接种。

但在发展中国家,昂贵的疫苗造成数百万人尤其是儿童依然死于传染病。

目前利用植物作为生物反应器生产口服疫苗,极大降低了疫苗的生产成本,并且研究表明植物疫苗确实可以使人和动物产生相应的免疫应答,因此这一新技术将有助于疫苗的普及从而改善发展中国家人民的健康状况。

目前在植物中表达的疫苗有几十种,包括乙肝病毒表面抗原、诺沃克病毒外壳蛋白、大肠杆菌热不稳定肠毒素B 亚基(L T - B) 、霍乱毒素的A ,B 亚基(CT - A ,B)、冠状病毒(Coronavirus) 的免疫原糖蛋白S 多肽、狂犬病毒糖蛋白、口蹄疫病毒(foot - and mouth disease virus) 抗原、水貂肠炎病毒抗原、犬细小病毒抗原。

植物疫苗在动物实验中已证明能够成功激发动物黏膜免疫应答和血清免疫应答,使动物对致病原产生了抵抗力,但在人体中的免疫检测还不多,只有少数几种植物疫苗进行了人体试验。

Mason 实验小组让志愿者服用了包含Lt - B 的去皮马铃薯片,受试者表现出黏膜和全身性免疫反应。

Tacket 等将转诺沃克病毒外壳蛋白基因的马铃薯让20 个志愿者服用,结果19 个人产生特异性IgG,6 个人产生特异性IgA ,说明95 %的人对诺沃克病毒产生了抵抗力。

目前,科学家正在进行植物源性的抗癌疫苗、抗艾滋病疫苗、抗糖尿病疫苗以及利用植物生产加强免疫效应的辅助佐剂方面的研究。

研究人员用于表达疫苗的植物多为烟草、马铃薯、西红柿,但这些植物都存在作为口服疫苗的缺点,如烟草不能食用、马铃薯不易生食、而西红柿不易长期贮存,因此更宜于生产口服疫苗的是那些含有大量可溶性蛋白,耐贮运种子植物,特别是水稻、小麦、玉米,其胚乳中含有丰富可溶性蛋白能够与种子其余部分分开,从而降低植物疫苗服用剂量。

此外,植物必须高水平表达疫苗才能达到口服免疫的效果[3]。

1.3利用植物生产药用蛋白
植物作为生物反应器除了可以生产抗体疫苗外,还可表达细胞因子、酶及其它药用蛋白和生物活性肽等。

但是利用植物生产上述细胞因子、酶,药用蛋白和生物活性肽等需要下游纯化, 只有它占总可溶性蛋白(TSP) 的1 %以上才具有商业开发的价值。

Verwoerd 等将黑曲霉的肌醇六磷酸酶(即植酸酶) 基因转入烟草,在成熟种子中植酸酶占总可溶性蛋白的1 % 。

Witcher 等利用转基因玉米生产重组的β - 葡萄苷酸酶( GUS) ,表达水平高达种子总可溶性蛋白的0. 7 % ,且生物活性与天然的的GUS 相同。

Hood 等在转基因玉米中成功表达了重组抗生物素蛋白,其表达量占总可溶性蛋白的2 %。

与从鸡蛋清中提取的相比具有相同的功效而成本却大大降低了。

现已成为Sigma - Aldrich 的商品。

Moloney 等将人的亮氨酸脑啡肽基因导入油菜中,先以种子贮藏蛋白2S清蛋白的形式表达,再用胰蛋白酶水解,获得的脑啡肽产量达到220 nmol/ g 种子,脑啡肽是临床可作为止痛剂或镇定剂。

此外,在转基因油菜种子油体中高效表达的水蛭素目前已经在加拿大投入商业生产,这是第一个用来商业开发的范例。

Sijmous 等人将人血清白蛋白(human serum albumin,HSA) 编码区与烟草的一个蛋白分泌信号肽序列的融合基因转入马铃薯,表达的融合蛋白占总可溶性蛋白的0. 02 % ,此外在植物中表达的其它人源蛋白的含量也很低。

例如β-干扰素的含量低于0. 03 %(鲜重) 、促红细胞生长因子( EPO)占总可溶性蛋白的0. 003 %、利用植物生产药用蛋白。

人工合成的人表皮因子在烟草中的表达量仅达到总可溶性蛋白的0. 001 % ,因此尚不具备开发价值,需通过进一步的研究来提高表达量[4]。

2 植物生物反应器存在的主要问题
2. 1 转基因沉默
是指转基因在受体植物中往往不能稳定表达,有时甚至完全不表达,或者说
利用遗传转化方法导入并稳定整合进受体细胞中的完整的外源基因在当代转化
体或在其后代中表达受到抑制的现象。

其可以通过以下途径解决: ①探明影响植物基因表达的基因调控元件,加以修饰和开启控制; ②了解转录过程,以便在转
录水平进行基因操作,提高转录效率; ③研究翻译过程,提高翻译效率; ④构建
一些新的植物高效表达系统,即各种载体及高效元件。

2.2 表达水平低
大多数转基因植物通过自交后可以选择出目的基因纯合的后代,可以稳定遗传,使表型得以延续。

但是大部分外源基因的表达水平在植物体内不高,目前没有得到很好的解决。

可以尝试用如下方法加以解决:采用适当的强启动子、增强子序列和前导序列,使用偏爱密码子,将转基因产物定向到合适的细胞分隔(如细胞质、质外体、内质网腔、叶绿体液泡等) ,组织器官特异性表达(如种子、块茎、果实、橡胶树乳管等) ,去除mRNA不稳定序列,同时表达有助于产物正确折叠的酶或蛋白质(如分子伴侣) 。

此外,还可用植物病毒作为载体提高表达量。

虽然这一问题可以解决,但要形成一套完整的外源基因在植物体内的高效表达体系还有待深入研究。

2.3 重组蛋白质中糖链结构的改变
植物表达蛋白质的氨基酸序列和它的原始序列通常是相同的,并且在植物中
能形成类似于人类等哺乳类动物的复杂型糖链结构,但是二者在高尔基体中的糖基化过程存在较大差异。

植物中糖蛋白缺少唾液酸和半乳糖残基,特异存在α2(1, 3) 2岩藻糖和β2(1, 2) 2木糖。

而唾液酸和半乳糖残基缺失会影响糖蛋白在人体内的稳定性及半衰期,使其活性降低;α2(1, 3) 2岩藻糖和β2( 1, 2) 2木糖的存在则易引起人体内的免疫原性。

为了避免植物高尔基体中特异的糖基化过程,人们发现在表达蛋白质的后面添加KDEL序列,可将蛋白质定位在内质网中,从而
形成对人无免疫应答的高甘露糖型糖蛋白质,同时还可以提高蛋白质的表达量。

2. 4 下游生产成本高
尽管植物生产体系具有许多优点,但如果产物需提纯,其费用还是比较昂贵的,因此有待降低下游生产成本,尽可能地避免或部分避免表达产物的纯化,如用转基因植物生产直接口服疫苗。

有时通过被修饰植物的直接消化运输生物药物产物可能不需要纯化,这种生物药物及可食用疫苗能以种子、块茎或果实的形式储存和分配,可以直接利用,这样就大大简化了下游的加工成本。

另外,也可将植物种子油脂体作为蛋白或肽类的载体,外源基因以融合蛋白的形式表达,油脂蛋白
具有亲脂性使其成为高效的多肽纯化系统。

2.5转基因药品的安全性问题
目前,虽然通过植物生物反应器生产外源蛋白相对于动物和微生物来讲安全性更高一些,但是转基因产品的安全性仍存在争议,如在口服药物和口服疫苗方面,植物是否含有对直接口服蛋白有影响的因子。

公众对转基因产品的接受和认可程度还不够,从而使转基因产品的市场化进程受到影响。

因此,一方面要加大宣传普及力度,另一方面还要对转基因产品的潜在危险性进行充分评价,开发清洁
载体,防止目标产物受到污染,同时还要制定相应的安全和管理法规。

展望
尽管转植物生物反应器仍存在一些问题尚待解决,但利用植物表达系统已成功地表达了多种具有生理活性的外源多肽,而且有些已经进行了人体和动物的试验,
其前景是可观的,随着人类基因组计划研究的不断深入,会发现有更多医疗价值
的蛋白质,因此利用转基因植物将会成为最具潜力的生产系统来生产这些药物,
为人类健康做出巨大的贡献[5]。

参考文献
[1] 庞俊峰; 黄东光; 吴燕民;植物生物反应器研究进展生物技术通报, Biotechnology Bulletin, 编辑部邮箱 2011年 01期
[2]严萍,赵树进. 转基因技术在植物抗体上的应用[J]. 生命的化学, 2006,(01) .
[3] 刘德虎. 利用转基因植物生产药用蛋白[J]. 生物技术通报, 1999,(04) .
[4] 杜小春; 何正权; 陈磊; 杨晔; 姚伟; 植物生物反应器表达药用蛋白研究新进展中国生物工程杂志, China Biotechnology, 编辑部邮箱 2008年 09期
[5] 杨晶; 李天航; 熊丽东; 庞实峰; 李校堃; 植物生物反应器的研究进展生物工程学报, Chinese Journal of Biotechnology, 编辑部邮箱 2009年 05期。