HPV原位杂交检测步骤

原理：人乳头状瘤病毒（Human papillomavirus, HPV）是一种嗜上皮性病毒，在人和动物中分布广泛，有高度的特异性。

HPV感染除了性行为是主要传播途径外，还可以通过间接接触感染。

目前已经确定的HPV型别大约有100种，依据不同型别HPV与肿瘤发生的危险性高低分为低危型和高危型HPV，低危型包括HPV6、11、42、43、44等型别，常引起外生殖器湿疣等良性病变包括宫颈上皮内瘤变（CIN Ⅰ），高危型包括HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、56、58、59、68等型别，与宫颈癌及宫颈上皮瘤变（CIN Ⅱ/Ⅲ）的发生相关，尤其HPV16和18型。

本试剂盒采用碱性磷酸酶系统，显色剂为BCIP/NBT，具有以下特点：DNA探针，敏感性强；胃酶消化，稳定可靠。

HPV16/18原位杂交检测步骤
所有的孵育步骤均应在密闭的湿盒内进行，避免试剂蒸发。

一旦杂交程序开始，玻片不能干燥。

1.样品的收集和预处理
石蜡切片：
常规福尔马林缓冲液固定，时间不宜超过12小时。

石蜡包埋的温度不宜超过65℃。

4～6µm石蜡切片，56～60℃烤片2～16小时。

处理好的切片可以立即使用，也可以置于室温条件下保存（至少可以保存3个月）。

在做杂交之前
2.酶处理
3.变性杂交程序
冲洗：
1.将切片浸入PBS缓冲液中，直到盖玻片自然脱落，用PBS 缓冲液冲洗切片10分钟。

在每张切片上加入1滴杂交后洗液（试剂3）37℃孵育15分钟。

PBS缓冲液冲洗2分钟×3次。

4. 检测和显色程序
4.1在切片上加入适量抗地高辛抗体（试剂4）37℃孵育30分钟，PBS冲洗2分钟
×3次。

4.2在切片上加入适量BCIP/NBT工作液，显微镜下观察显色情况，显色充分后用
自来水终止。

5. 复染程序
可选择核固红复染，染色10～20秒。

用蒸馏水或去离子水短时间冲洗，水溶性封
固剂或香味封片剂封片。

常见问题处理对策
脱片
可能的原因对策
标本制作固定剂是否选用福尔马林缓冲液，切片是否确实干片
组织切片过薄切片合适的厚度4～6µm
玻片使用不当必须使用有机硅包被的载玻片
胃酶浓度过高确实是否按照组织类型使用合适的胃酶浓度
消化时间过长减少消化时间或消化温度改为室温
预想的阳性切片，实验结果弱阳性或阴性
可能的原因对策
组织固定固定液只能选用福尔马林缓冲液
脱蜡选用新鲜脱蜡液
消化确定胃酶使用的浓度是否正确？温度是否为37℃
变性与杂交程序确定探针使用前是否混匀，变性温度、时间是否正确
检测程序确定温度是否为37℃
靶DNA含量过低可以选用杂交过夜
阴性对照片阳性染色
可能的原因对策
干片应在湿盒内进行杂交
阳性对照探针/特异性探
确定为新使用的探针
针污染
非特异性背景染色
可能的原因对策
干片在湿盒的环境中进行杂交
内源性碱性磷酸酶在底物溶液中加入4mg levamisol
实验步骤指南
石蜡切片预处理
1.4～6µm切片，用防脱片处理的载玻片捞片
2.烤片56～60℃2～16小时
3.新鲜二甲苯脱蜡2×10分钟
4.100%乙醇后空气干燥2×5分钟
酶处理
1.滴加适量胃酶工作液37℃30分钟
2.弃胃酶工作液，逐级乙醇脱水、空气干燥3×1分钟
变性杂交程序
1.加10-20µl探针于切片/张，加盖盖玻片
2.变性95℃5～7分钟
3.杂交37℃2小时或过夜
4.切片插入PBS缓冲液中以便去掉盖玻片约5～10分钟
5.每张切片加入2-3滴杂交后洗液37℃15分钟
6.PBS缓冲液洗3×2分钟
检测和染色程序
1.每张切片加入适量AP标记抗地高辛抗体37℃30分钟
2.PBS缓冲液洗3×2分钟
3.每张切片加入适量BCIP/NBT工作液，
弃显色液，蒸馏水或自来水冲洗5～10分钟
4.选择：每张切片加入1滴复染剂5～10分钟
5.蒸馏水或自来水冲洗，封片、镜检。