NF_B活化及livin_survivin表达上调与胃癌细胞耐药的关系

第２８卷第６期２００８年６月南京医科大学学报（自然科学版）
ＡＣＴＡＵＮＩＶＥＲＳＩＴＡＴＩＳＭＥＤＩＣＩＮＡＬＩＳＮＡＮＪＩＮＧ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅ）
肿瘤细胞耐药性的产生是导致化疗失败的主要原因，也是目前肿瘤临床治疗面临的难题，在众多耐药机制中，凋亡抵抗可能是其重要因素之一。

核因子κＢ（ＮＦ－κＢ）是重要的调节细胞增殖和凋亡的转录因子，可调节凋亡抑制蛋白家族（ＩＡＰｓ）成员ｃＩＡＰ２等表达增加［１］。

近年研究发现化疗可引起ＮＦ－κＢ转录活性增加，这一传导通路的改变可能是诱导肿
瘤细胞产生耐药的途径之一［２］。

ｌｉｖｉｎ、ｓｕｖｉｖｉｎ是近年来发现的ＩＡＰｓ新成员，高表达于多种恶性肿瘤组织，具有较强的凋亡抑制作用，参与肿瘤的发生和发展［３－８］。

ＮＦ－κＢ与ＩＡＰｓ新成员ｌｉｖｉｎ、ｓｕｖｉｖｉｎ是否共同参与了肿瘤细胞的耐药过程，目前尚未见国内外文献报道。

本研究通过体外细胞培养实验，检测了胃癌细胞经化疗药长春新碱诱导后ＮＦ－κＢ活性及
ｌｉｖｉｎ、ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的变化，探讨其在胃癌细胞形成
耐药过程中可能的作用。

ＮＦ－κＢ活化及ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达上调与胃癌细胞耐药的关系
李
薇，吴
昊，王同杉，刘
平＊
（南京医科大学第一附属医院肿瘤科，江苏南京
２１００２９）
［摘要］目的：探讨核转录调节因子ＮＦ－κＢ活性及凋亡抑制蛋白ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达与胃癌细胞耐药的关系。

方法：ＭＴＴ法
检测化疗药物长春新碱（ＶＣＲ）对胃癌细胞ＳＧＣ７９０１及耐药细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ的生长抑制作用；流式细胞仪检测ＶＣＲ作用后细胞的凋亡率；ＥＬＩＳＡ法检测ＮＦ－κＢ核转录活性；Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白表达。

结果：化疗药ＶＣＲ对ＳＧＣ７９０１／
ＶＣＲ细胞的生长抑制作用较ＳＧＣ７９０１细胞显著降低，ＶＣＲ作用ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞的凋亡率减少；ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞中ＮＦ－κ
Ｂ核转录活性增强（Ｐ＜０．０１）；ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ在ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞中表达上调（Ｐ＜０．０５）。

结论：胃癌细胞ＳＧＣ７９０１在化疗药
ＶＣＲ长期诱导后产生的继发耐药可能与ＮＦ－κＢ活化及ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达上调有关；ＮＦ－κＢ活化是ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达上调可能
的调控因素。

［关键词］
胃癌；耐药；ＮＦ－κＢ；ｌｉｖｉｎ；ｓｕｒｖｉｖｉｎ
［中图分类号］
Ｒ７３５．２［文献标识码］Ａ［文章编号］１００７－４３６８（２００８）０６－０７３７－０５
ＲｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦ－κＢ，ｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｉｖｉｎａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎａｎｄｄｒｕｇｒｅｓｉｓ－ｔａｎｃｅｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ
ＬＩＷｅｉ，ＷＵＨａｏ，ＷＡＮＧＴｏｎｇ－ｓｈａｎ，ＬＩＵＰｉｎｇ＊
（ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＯｎｃｏｌｏｇｙ，ｔｈｅＦｉｒｓｔＡｆｆｉｌｉａｔｅｄＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＮＪＭＵ，Ｎａｎｊｉｎｇ２１００２９，Ｃｈｉｎａ）
［Ａｂｓｔｒａｃｔ］
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ：ＴｏｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｔｈｅｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｂｅｔｗｅｅｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦ－κＢ，ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｖｉｎａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎ，ｔｗｏｍｅｍｂｅｒｓｏｆ
ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎ（ＩＡＰ）ｆａｍｉｌｙ，ａｎｄｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ．Ｍｅｔｈｏｄｓ：ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎａｎｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌＳＧＣ７９０１ａｎｄＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｗｅｒｅｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＭＴＴａｎｄＦｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｙ．ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎｏｆＮＦ－κ
ＢｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙＥＬＩＳＡ．ＰｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｌｉｖｉｎａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎｗｅｒｅａｓｓｅｓｓｅｄｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｎａｌｙｓｉｓ．Ｒｅｓｕｌｔｓ：Ｔｈｅｉｎｈｉｂｉ－ｔｉｏｎｏｆｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｗｅｒｅｒｅｄｕｃｅｄｉｎＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌｓａｆｔｅｒｂｅｅｎｅｘｐｏｓｅｄｔｏＶＣＲ，ａｎｄｔｈｅｒａｔｉｏｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｗａｓａｌｓｏｄｅｃｒｅａｓｅｄ．ＷｅｆｏｕｎｄｔｈａｔＮＦ－κＢａｃｔｉｖｉｔｙｗａｓｅｎｈａｎｃｅｄ，ａｎｄｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎｗｅｒｅｏｖｅｒｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌｓｂｙＥＬＩＳＡａｎｄＷｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔａｓｓａｙ．Ｃｏｎｃｌｕｓｉｏｎ：ＴｈｅａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦ－κＢａｎｄｕｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｉｖｉｎａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎｍａｙｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｐｒｏｃｅｓｓｏｆｄｒｕｇｒｅｓｉｓ－ｔａｎｃｅｉｎＳＧＣ７９０１／ＶＣＲｃｅｌｌｓ．ＵｐｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｌｉｖｉｎａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎｍｉｇｈｔｒｅｌａｔｅｔｏａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦ－κＢ．
［Ｋｅｙｗｏｒｄｓ］
ｇａｓｔｒｉｃｃａｒｃｉｎｏｍａ；ｄｒｕｇｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ；ＮＦ－κＢ；ｌｉｖｉｎ；ｓｕｒｖｉｖｉｎ
［ＡｃｔａＵｎｉｖＭｅｄＮａｎｊｉｎｇ，２００８，２８（０６）：７３７－７４１］
［基金项目］
江苏省医学重点人才１３５工程资助（５２－２００１）
＊
通讯作者，Ｅ－ｍａｉｌ：ｌｉｕ－ｐｉｎｇ＠ｃｓｃｏ．ｏｒｇ．ｃｎ
７３７・・
第２８卷第６期
２００８年６月南京医科大学学报
１材料和方法
１．１材料
胃腺癌细胞ＳＧＣ７９０１为本课题组保存；ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞为第四军医大学消化病研究所惠赠；长春新碱（ＶＣＲ，深圳万乐药业）；ＭＴＴ（Ｓｉｇｍａ公司，美国）；核蛋白转录因子检测试剂盒（Ｃａｙｍａｎ公司，德国）；鼠抗人ＮＦ－κＢｐ６５一抗（ＢＤ公司，美国）；鼠抗人ｌｉｖｉｎ一抗（Ａｌｅｘｉｓ公司，美国）；鼠抗人ｓｕｒｖｉｖｉｎ一抗（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ公司，美国）；鼠抗人ｔｕｂｕｌｉｎ一抗（Ｓａｎｔａ公司，美国）；羊抗鼠二抗（北京，中杉公司）；Ｅｃｌ试剂盒（ＣｅｌｌＳｉｇｎａｌｉｎｇ公司，美国）；ＡｎｎｅｘｉｎⅤ－ＦＩＴＣ凋亡检测试剂盒（凯基公司，南京）ＣＯ２培养箱（ＫｅｎｄｒｏＨｅｒａｃｅｌｌ公司，德国）；酶联免疫检测仪（ＡＳＹＳＣｌｉｎｉｂｉｏ公司，澳大利亚），蛋白电泳转印仪（ＢｉｏＲａｄ公司，美国）；流式细胞仪（ＢＤ公司，美国）
１．２方法
１．２．１细胞培养
胃癌细胞ＳＧＣ７９０１用含１０％灭活小牛血清和青、链霉素（１００Ｕ／ｍｌ）的ＲＰＭＩ１６４０培养基，在３７℃、５％ＣＯ２及饱和湿度培养箱中常规培养，每１～２天更换培养液１次；ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞的培养基同上，并在培养液中加入ＶＣＲ至终浓度１μｇ／ｍｌ常规诱导培养，以维持其耐药特性，每１～２天更换培养液１次。

１．２．２ＭＴＴ法测定化疗药ＶＣＲ对细胞的生长抑制作用
参照文献［９－１０］设计不同浓度ＶＣＲ实验组，２．５、１０．０、４０．０、１６０．０、６４０．０#ｍｏｌ／Ｌ同时设正常对照组（不加ＶＣＲ），空白对照组（只加培养基），每组４孔重复。

将对数生长期ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞以４×１０４／孔细胞数接种于９６孔培养板，每孔２００μｌ，培养２４ｈ细胞贴壁生长后，加入用ＲＰＭＩ１６４０配制的含不同浓度的ＶＣＲ在３７℃、５％ＣＯ２及饱和湿度培养箱中继续培养２４ｈ。

检测时每孔加入ＭＴＴ（５ｍｇ／ｍｌ）２０μｌ，孵育４ｈ弃上清，加ＤＭＳＯ１５０μｌ，震荡数分钟使形成的甲瓒晶体完全溶解，酶联免疫检测仪测定４９２ｎｍ处的吸光度值Ａ４９２ｎｍ，并计算该浓度下的抑制率。

实验重复３次。

存活率＝试验组Ａ４９２ｎｍ／对照组Ａ４９２ｎｍ×１００％
１．２．３流式细胞仪检测细胞凋亡率
取对数生长期ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞分别加入配制的含ＶＣＲ药物浓度分别为０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌ的ＲＰＭＩ１６４０培养基作用２４ｈ后，常规消化细胞，ＰＢＳ洗２次，再用４００μｌ结合缓冲液重悬，每管加入５μｌＡｎｎｅｘｉｎⅤ－ＦＩＴＣ，５μｌＰＩ双染。

避光室温孵育１５ｍｉｎ后流式细胞仪检测。

１．２．４蛋白质提取
取对数生长期ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞约１×１０７，用细胞刮匙收集细胞后，按照蛋白提取试剂盒说明书操作，分别提取细胞总蛋白及胞核蛋白，并将提取的蛋白样品应用Ｂｒａｄｆｏｒｄ法测定各组蛋白浓度，余分装后立即置于－８０℃保存。

１．２．５ＥＬＩＳＡ法测定ＮＦ－κＢ核ＤＮＡ结合转录活性应用ＮＦ－κＢｐ６５转录因子检测试剂盒测定ＮＦ－κＢ核ＤＮＡ结合活性。

该方法是将具有与ＮＦ－κＢｐ６５亚基特异性结合的双链ＤＮＡ包被在９６孔板上，以检测细胞核内ＮＦ－κＢｐ６５的ＤＮＡ结合活性。

按试剂盒说明书取等量ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞核蛋白提取液分别加入孔内，每组４个复孔，４℃结合过夜后依次加入ＮＦ－κＢ一抗（１∶１００），二抗（１∶１００）及显色液，酶标仪波长４５０ｎｍ处检测吸光度值。

１．２．６Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋白表达取ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞总蛋白６０μｇ上样到１５％的ＳＤＳ聚丙烯酰胺凝胶进行电泳，再印迹到ＰＶＤＦ膜上，５％的脱脂牛奶（溶于ＴＢＳＴ中）室温封闭１ｈ，分别用抗ＮＦ－κＢ一抗（１∶１０００）、抗ｌｉｖｉｎ一抗（１∶２５０）、抗ｓｕｒｖｉｖｉｎ一抗（１∶１０００）和抗ｔｕｂｕｌｉｎ一抗（１∶１０００）４℃孵育过夜，ＴＢＳＴ洗膜１０ｍｉｎ×３次，再用辣根过氧化物酶标记的二抗室温孵育１ｈ，ＴＢＳＴ洗膜１０ｍｉｎ×３次，配置新鲜发光液发光成像。

ＱｕａｎｔｉｔｙＯｎｅ软件进行灰度分析。

１．３统计学方法
数据资料用ｘ±ｓ表示，ｓｔａｔａ７．０软件进行统计学处理，两组间均数比较用ｔ检验，Ｐ＜０．０５表示统计学差异显著性。

２结果
２．１ＶＣＲ对ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞的生长抑制作用
ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ系由亲本细胞长期接受低剂量ＶＣＲ而获得的耐ＶＣＲ的人胃癌细胞株，２株细胞对ＶＣＲ的敏感性不同。

在ＶＣＲ作用２４ｈ时，ＳＧＣ７９０１的ＩＣ５０值为１２．９６μｍｏｌ／Ｌ，而ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ的ＩＣ５０值为５１７．２６μｍｏｌ／Ｌ，ＶＣＲ对耐药细胞的抑制作用明显减弱（图１）。

７３８・・
ＳＧＣ７９０１
细胞存活率
ＶＣＲ浓度（!ｍｏｌ／Ｌ）１．０
０．８０．６０．４０．２０
０２．５１０．０４０．０１６０．０６４０．０
细胞存活率
ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ
ＶＣＲ浓度（!ｍｏｌ／Ｌ）
１．００．８０．６０．４０．２０
０２．５１０．０４０．０１６０．０６４０．０
图１ＶＣＲ对ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ２４ｈ生长抑制作用
Ｆｉｇ１ＴｈｅｉｎｈｉｂｉｔｉｏｎｏｆＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｂｙＶＣＲ
ＮＦ－"Ｂ核Ｐ６５
ＳＧＣ７９０１
ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ
０．５０．４０．３０．２０．１０
ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞中ＮＦ－κＢ核转录活性增加，Ｐ＜０．０１。

图３ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞内ＮＦ－κＢ核转录活性Ｆｉｇ３
ＡｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮＦ－κＢｉｎＳＧＣ７９０１ａｎｄＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ
Ａ（１－３）、Ｂ（１－３）分别为ＶＣＲ０、１００、２００μｍｏｌ／Ｌ作用ＳＧＣ７９０１、ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞２４ｈ的凋亡情况；ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞凋亡率较ＳＧＣ７９０１明显减少。

图２ＶＣＲ对ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞凋亡的影响
Ｆｉｇ２ＴｈｅａｐｏｔｏｓｉｓｏｆＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲａｆｔｅｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｂｙＶＣＲ
１０２１０３１０４１０５
ＰＩＰＥ－Ｈ
１０２
１０３１０４１０５
ＰＩＰＥ－Ｈ１０２
１０３１０４１０５
ＰＩＰＥ－Ｈ１０２
１０３１０４１０５ＡＮＮＥＸＩＮＶＦＩＴＣ－Ｈ
１０２
１０３１０４１０５ＡＮＮＥＸＩＮＶＦＩＴＣ－Ｈ
１０２
１０３１０４１０５ＡＮＮＥＸＩＮＶＦＩＴＣ－Ｈ
１０２１０３１０４１０５
ＰＩＰＥ－Ｈ１０２１０３１０４１０５
ＰＩＰＥ－Ｈ１０２１０３１０４１０５
ＰＩＰＥ－Ｈ１０２
１０３１０４１０５ＡＮＮＥＸＩＮＶＦＩＴＣ－Ｈ
１０２
１０３１０４１０５ＡＮＮＥＸＩＮＶＦＩＴＣ－Ｈ
１０２
１０３１０４１０５ＡＮＮＥＸＩＮＶＦＩＴＣ－Ｈ
Ｑ１Ｑ２Ｑ３
Ｑ４
Ｑ１Ｑ２Ｑ３
Ｑ４
Ｑ１Ｑ２Ｑ３Ｑ４
Ｑ１Ｑ２Ｑ３
Ｑ４
Ｑ１Ｑ２Ｑ３
Ｑ４
Ｑ１Ｑ２Ｑ３
Ｑ４
Ａ
Ｂ
１
２３１
２
３
２．２ＶＣＲ作用ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ后的细胞
凋亡情况
流式细胞仪检测结果表明，不同浓度ＶＣＲ作用
于ＳＧＣ７９０１，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞２４ｈ后，ＳＧＣ７９０１／
ＶＣＲ细胞的凋亡率明显低于ＳＧＣ７９０１（图２）。

ＶＣＲ
作用于ＳＧＣ７９０１及ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞２４ｈ后，其凋亡率正常对照组分别为７．５％和９．１％；１００μｍｏｌ／Ｌ组分别为２６．６％，和１１．５％；２００μｍｏｌ／Ｌ组分别为
６３．５％和１５．５％。

２．３ＳＧＣ７９０１细胞经ＶＣＲ诱导后ＮＦ－κＢ核转录活
性的变化
ＮＦ－κＢ核ＤＮＡ结合活性检测结果显示，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞核内ＮＦ－κＢｐ６５蛋白表达
（０．４０４±０．０２５）较ＳＧＣ７９０１细胞核内含量（０．３０１±
０．０１６）显著增多（Ｐ＜０．０１），表明ＮＦ－κＢｐ６５从胞浆进入胞核内的转录活性增加（图３）。

２．４ＳＧＣ７９０１细胞经ＶＣＲ诱导后ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ蛋
白表达的变化
经化疗药ＶＣＲ诱导后，ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞内
ｌｉｖｉｎ和ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达较ＳＧＣ７９０１均发生了上调
（Ｐ＜０．０５，图４），表明可能由ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ调控的
凋亡抑制作用得到加强。

３讨论
化疗后继发耐药的产生是造成肿瘤化疗失败的重要原因。

肿瘤耐药的机制是多方面的，对凋亡
李薇等：ＮＦ－κＢ活化及ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达上调与胃癌细胞耐药的关系
第２８卷第６期２００８年６月
７３９・・
第２８卷第６期２００８年６月
南京医科大学学报
诱导产生抵抗可能是其重要因素。

ＮＦ－κＢ是重要的调控细胞增殖与凋亡的核转录调节因子，在静息状态下ＮＦ－κＢ与其抑制性蛋白ＩκＢ结合存在于细胞胞浆中。

在化疗药物、射线等多种因素作用下，ＩκＢ发生磷酸化、泛素化继而被蛋白酶水解，ＮＦ－κＢ得以活化并转位入核，调节靶基因的转录。

已有学者提出ＮＦ－κＢ及其信号通路是肿瘤治疗的一个策略［１１－１３］。

本实验发现，胃癌细胞ＳＧＣ７９０１经化疗药ＶＣＲ长期诱导后，对再予ＶＣＲ作用的药物敏感性降低，细胞凋亡率减少，产生继发耐药。

同时本研究发现
ＮＦ－κＢ在ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞核内的转录活性增
强（Ｐ＜０．０１），这可能是维持癌细胞处于凋亡耐受，产生继发耐药的原因之一，与罗和生等［１０］研究结果较为一致。

ＩＡＰｓ是重要的抗凋亡蛋白因子，ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ
是近几年研究发现的ＩＡＰｓ的新成员，两者均含有高度保守的约７０ａａ的ＢＩＲ（ｂａｃｕｌｏｖｉｒａｌＩＡＰｒｅｐｅａｔ）结
构域（结合和抑制Ｃａｓｐａｓｅ蛋白酶的关键部位），具有重要的凋亡抑制作用。

ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ在多种恶性肿瘤组织中高表达，本课题组前期研究发现ｌｉｖｉｎ和
ｓｕｒｖｉｖｉｎ在胃癌组织中阳性表达率分别为４７．５％和６０．０％，在癌旁和正常组织中不表达［１４］；沉默ｌｉｖｉｎ基因表达可促进胃癌ＳＧＣ７９０１细胞的凋亡［１５］。

本研究
进一步观察了化疗药物诱导后ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞中ｌｉｖｉｎ和ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达情况，结果显示ｌｉｖｉｎ和
ｓｕｒｖｉｖｉｎ在ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞中的表达上调（Ｐ＜０．０５），表明胃癌细胞对凋亡的抵抗及继发耐药可能
是部分通过ｌｉｖｉｎ和ｓｕｒｖｉｖｉｎ对凋亡的抑制作用来实现的，这也可能是胃癌产生继发耐药的机制之一。

在凋亡信号通路中研究发现ＩＡＰｓ成员ｃＩＡＰ，
ｓｕｒｖｉｖｉｎ等表达与ＮＦ－κＢ的表达呈正相关［１６］。

胃癌
细胞中ｌｉｖｉｎ和ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达是否也受ＮＦ－κＢ的调控尚未见研究报道。

本课题组前期研究发现ＮＦ－κＢ抑制剂ＰＤＴＣ作用于胃癌细胞后ｌｉｖｉｎ的表达呈时间、剂量依赖性下调趋势［１７］。

Ｓｅｔｈｉ等［１８］研究发现小鼠成纤维细胞去除ＭＫＫ４基因后能促进细胞凋亡，在ＮＦ－κＢ的活性受到抑制的同时，ＩＡＰｓ中ｓｕｒｖｉｖｉｎ，
ＩＡＰ１，ＸＩＡＰ等表达也发生了下调。

Ｓａｔｏ等［１９］研究发现在肾癌细胞中使用ＮＦ－κＢ抑制剂ＤＨＭＥＱ后细
胞增殖受到抑制，同时ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达也发生了下调。

在本研究中发现ＮＦ－κＢ在ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ细胞内的转录活性增强（Ｐ＜０．０１），同时ｌｉｖｉｎ和ｓｕｒｖｉｖｉｎ的表达增加（Ｐ＜０．０５），综合文献报道和本研究结果，作者认为在胃癌细胞化疗药物诱导耐药的过程
中，ＮＦ－κＢ转录活性增强，并可能上调了ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒ－
ｖｉｖｉｎ的表达，引起凋亡信号通路的抑制，导致胃癌
细胞产生凋亡抵抗而继发耐药。

因此，寻找并使用高效低毒的靶向ＮＦ－κＢ或ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ抑制剂，减弱肿瘤细胞的凋亡抑制，增加其对化疗的敏感性，将可能是克服耐药和提高肿瘤治疗效果的一个有效途径。

致谢：感谢南京医科大学现代病原生物学重点实验室王勇教授在本研究中给予的大力支持！感谢第四军医大学消化病研究所惠赠胃癌细胞ＳＧＣ７９０１／ＶＣＲ！［参考文献］［１］
ＳｃｈｏｅｍａｋｅｒＭＨ，ＲｏｓＪＥ，ＨｏｍａｎＭ，ｅｔａｌ．Ｃｙｔｏｋｉｎｅｒｅｇｕ－ｌａｔｉｏｎｏｆｐｒｏ－ａｎｄａｎｔｉ－ａｐｏｐｔｏｔｉｃｇｅｎｅｓｉｎｒａｔｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ：ＮＦ－ｋａｐｐａＢ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎ２
（ｃＩＡＰ２）ｐｒｅｖｅｎｔｓａｐｏｐｔｏｓｉｓ［Ｊ］．Ｈｅｐａｔｏｌ，２００２，３６（６）：
７４２－７５０
［２］
ＭｏｎｔａｇｕｔＣ，ＴｕｓｑｕｅｔｓＩ，ＦｅｒｒｅｒＢ，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｎｕ－ｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－ｋａｐｐａＢｉｓｌｉｎｋｅｄｔｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｎｅｏａｄｊｕ－ｖａｎｔｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．ＥｎｄｏｃｒＲｅｌａｔＣａｎｃｅｒ，２００６，１３（２）：６０７－６１６
［３］ＶｕｃｉｃＤ，ＳｔｅｎｎｉｃｋｅＨＲ，ＰｉｓａｂａｒｒｏＭＴ，ｅｔａｌ．ＭＬ－ＩＡＰ，ａｎｏｖｅｌｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈａｔｉｓｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｅｘ－ｐｒｅｓｓｅｄｉｎｈｕｍａｎｍｅｌａｎｏｍａｓ［Ｊ］．ＣｕｒｒＢｉｏｌ，２０００，１０
（２１）：１３５９－１３６６
［４］ＹａｇｉｈａｓｈｉＡ，ＯｈｍｕｒａＴ，ＡｓａｎｕｍａＫ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｕｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｓｕｒｖｉｖｉｎａｎｄｌｉｖｉｎｉｎｓｅｒａｆｒｏｍ
ｐａｔｉｅｎｔｓ
７４０・・
ＣｅｌｌＰｈｙｓｉｏｌ，２００４，２８６：１３８－１４４
［５］
姜苏蓉，刘
莉，陈
晨，等．人胰岛素样生长因子１前
体基因的重组、表达及纯化［Ｊ］．江苏医药，２００６，３２（２）：１３６－１３８［６］
施有为，刘
莉，程蕴琳．人胰岛素样生长因子前体基
因的重组、表达及其蛋白纯化［Ｊ］．南京医科大学学报，
２００６，２６（９）：８２５－８２８
［７］朱立平，陈学清．免疫学常用实验方法［Ｍ］．北京：人民军医出版社，２０００：２８－２９，３５２－３５６［８］
段
宇，赵
红，汪承亚，等．重组人胰岛素样生长因
子－１纯化及其鉴定的研究［Ｊ］．南京医科大学学报，
２００６，２４（６）：５５７－５６０
［９］
王金发，何炎明．细胞生物学试验教程［Ｍ］．北京：科学出版社，２００４：８５－８７
［１０］ＢｅａｔｔｙＪＤ，ＢｅａｔｔｙＧＢ．Ｍｅａｓｕｒｅｍｅｎｔｏｆｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉ－
ｂｏｄｙａｆｆｉｎｉｔｙｂｙｎｏｎ－ｃｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅｅｎｚｙｍｅｉｍｍｕｎｏａｓｓａｙ
［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９８７，１００：１７３－１７９
［１１］ＦｒｉｇｕｅｔＢ，Ｄｊａｖａｄｉ－ＯｈａｎｉａｎｃｅＬ，ＰａｇｅｓＪ，ｅｔａｌ．Ａｃｏｎｖｅ－
ｎｉｅｎｔｅｎｚｙｍｅｌｉｎｋｅｄｉｍｍｕｎｏｓｏｒｂｅｎｔａｓｓａｙｆｏｒｔｅｓｔｉｎｇｗｈｅｔｈｅｒｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｒｅｃｏｇｎｉｚｅｔｈｅｓａｍｅａｎｔｉ－ｇｅｎｉｃｓｉｔｅ．Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｔｏｈｙｂｒｉｄｏｍａｓｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒｔｈｅ２－ｓｕｂｕｎｉｔ，ｏｆＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｔｒｙｐｔｏｐｈａｎｓｙｎｔｈａｓｅ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌＭｅｔｈｏｄｓ，１９８３，６０（３）：３５１－３５８
［１２］ＬｉｋｉｔｍａｓｋｕｌＳ，ＷａｔｃｈａｒａｓｉｎｄｈｕＳ，ＡｎｇｓｕｓｉｎｇｈａＫ，ｅｔａｌ．
ＩＧＦ－Ｉｇｅｎｅｒａｔｉｏｎｔｅｓｔｉｎｎｏｎ－ｇｒｏｗｔｈｈｏｒｎｏｎｅｄｅｆｉｃｉｅｎｔｓｈｏｒｔｃｈｉｌｄｒｅｎ［Ｊ］．ＨｏｒｍＲｅｓ，１９９８，４９（Ｓｕｐｐｌ１）：５２
［１３］ＦｉｓｃｈｅｒＢ，ＳｕｍｎｅｒＬ，ＧｏｏｄｅｎｏｕｇｈＰ，ｅｔａｌ．Ｉｓｏｌａｔｉｏｎ，ｒｅ－
ｎａｔｕｒａｔｉｏｎａｎｄｆｏｒｍａｔｉｏｎｏｆｄｉｓｕｌｆｉｄｅｂｏｎｄｓｏｆｅｕｋａｒｙｏｔｉｃｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉａｓｉｎｃｌｕｓｉｏｎｂｏｄｉｅｓ
［Ｊ］．ＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙａｎｄＢｉｏｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，１９９３，４１（１）：３－１３［１４］黄传书，金伯泉．一种用于制备ＭｃＡｂ杂交瘤的体内和
体外联合诱导法［Ｊ］．单克隆抗体通讯，１９９３，９：５４－５５［１５］冯小黎．重组包涵体蛋白质的折叠复性［Ｊ］．生物化学
与生物物理进展，２００１，２８（４）：４８２－４８５
［收稿日期］
２００７－０９－２９
ｗｉｔｈｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＣｌｉｎＣｈｉｍＡｃｔａ，２００５，３６２（１－２）：１２５－１３０
［５］
ＧａｚｚａｎｉｇａＰ，ＧｒａｄｉｌｏｎｅＡ，ＧｉｕｌｉａｎｉＬ，ｅｔａｌ．ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｒｏｇｎｏｓｔｉｃｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅｏｆＬｉｖｉｎ，Ｓｕｒｖｉｖｉｎａｎｄｏｔｈｅｒａｐｏｐｔｏｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅｓｉｎｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｂｌａｄｄｅｒｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＡｎｎＯｎｃｏｌ，２００３，１４（１）：８５－９０
［６］ＹａｇｉｈａｓｈｉＡ，ＡｓａｎｕｍａＫ，ＫｏｂａｙａｓｈｉＤ，ｅｔａｌ．Ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆａｕｔｏ－ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓｔｏｌｉｖｉｎａｎｄｓｕｒｖｉｖｉｎｉｎｓｅｒａｆｒｏｍｌｕｎｇｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．ＬｕｎｇＣａｎｃｅｒ，２００５，４８（２）：２１７－２２１
［７］ＫｌｅｉｎｂｅｒｇＬ，ＬｉｅＡＫ，Ｆｌd ｒｅｎｅｓＶＡ，ｅｔａｌ．Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｉｎｈｉｂｉｔｏｒｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｐｒｏｔｅｉｎｆａｍｉｌｙｍｅｍｂｅｒｓｉｎｍａｌｉｇ－ｎａｎｔｍｅｓｏｔｈｅｌｉｏｍａ［Ｊ］．ＨｕｍＰａｔｈｏｌ，２００７，３８（７）：９８６－９９４
［８］ＹｕＴ，ＬｅｕｎｇＷＫ，ＥｂｅｒＭＰＡ，ｅｔａｌ．Ｉｎｃｒｅａｓｅｄｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｕｒｖｉｖｉｎｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓａｎｄｉｎｆｉｒｓｔｄｅｇｒｅｅｒｅｌａｔｉｖｅｓ［Ｊ］．ＢｒＪＣａｎｃｅｒ，２００２，８７（１）：９１－９７
［９］蔡学君，张学庸，樊代明，等．胃癌多药耐药细胞株的建立及其生物学特征［Ｊ］．中国肿瘤临床，１９９４，２１：６７－６９
［１０］罗和生，王
维，包鹏辉，等．核因子κＢ活性增强参与
胃癌细胞长春新碱耐药［Ｊ］．中华消化杂志，２００４，２４（８）：４７２－４７５
［１１］ＣａｍｐＥＲ，ＬｉＪ，ＭｉｎｎｉｃｈＤＪ，ｅｔａｌ．Ｉｎｄｕｃｉｂｌｅｎｕｃｌｅａｒｆａｃ－
ｔｏｒ－ｋａｐｐａＢａｃｔｉｖａｔｉｏｎｃｏｎｔｒｉｂｕｔｅｓｔｏｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｒｅｓｉｓ－ｔａｎｃｅｉｎｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ［Ｊ］．ＡｍＣｏｌｌＳｕｒｇ，２００４，１９９（２）：２４９－２５８
［１２］ＬｅｅＣＨ，ＪｅｏｎＹＴ，ＫｉｍＳＨ，ｅｔａｌ．ＮＦ－ｋａｐｐａＢａｓａｐｏｔｅｎ－
ｔｉａｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｔａｒｇｅｔｆｏｒｃａｎｃｅｒｔｈｅｒａｐｙ［Ｊ］．Ｂｉｏｆａｃｔｏｒｓ，２００７，２９（１）：１９－３５
［１３］ＭｏｎｔａｇｕｔＣ，ＴｕｓｑｕｅｔｓＩ，ＦｅｒｒｅｒＢ，ｅｔａｌ．Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆｎｕ－
ｃｌｅａｒｆａｃｔｏｒ－ｋａｐｐａＢｉｓｌｉｎｋｅｄｔｏｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｎｅｏａｄｊｕ－ｖａｎｔｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙｉｎｂｒｅａｓｔｃａｎｃｅｒｐａｔｉｅｎｔｓ［Ｊ］．ＥｎｄｏｃｒＲｅｌａｔＣａｎｃｅｒ，２００６，１３（２）：６０７－６１６
［１４］王同杉，游思洪，葛红梅，等．凋亡抑制蛋白ｌｉｖｉｎ在人
胃癌中的表达以及和ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达的关系［Ｊ］．南京医科大学学报，２００６，２６（１）：３９－４３
［１５］王同杉，游思洪，葛红梅，等．ＳｉＲＮＡ沉默ｌｉｖｉｎ基因表
达促进胃癌细胞凋亡［Ｊ］．世界华人消化杂志，２００７，１５（２２）：２３７７－２３８１
［１６］Ｌｉｕ－ＱｉｎＹａｎｇ，Ｄｉａｎ－ＣｈｕｎＦａｎｇ，Ｒｏｎｇ－ＱｕａｎＷａｎｇ，ｅｔａｌ．
ＥｆｆｅｃｔｏｆＮＦ－ｋＢ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ，Ｂｃｌ－２ａｎｄＣａｓｐａｓｅ３ｏｎａｐｏｐｔｏ－ｓｉｓｏｆｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｔｕｍｏｒｎｅｃｒｏｓｉｓｆａｃ－ｔｏｒｒｅｌａｔｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｉｎｇｌｉｇａｎｄ［Ｊ］．ＷｏｒｌｄＪＧａｓ－ｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ，２００４，１０（１）：２２－２５
［１７］朱华云，刘凌翔，葛红梅，等．ＮＦ－κＢ抑制剂ＰＤＴＣ对人
胃癌ＳＧＣ７９０１细胞凋亡及Ｌｉｖｉｎ和Ｃａｓｐａｓｅ－３表达的影响［Ｊ］．南京医科大学学报，２００７，２７（８）：８１６－８２０［１８］ＳｅｔｈｉＧ，ＡｈｎＫＳ，ＸｉａＤ，ｅｔａｌ．ＴａｒｇｅｔｅｄｄｅｌｅｔｉｏｎｏｆＭＫＫ４
ｇｅｎｅｐｏｔｅｎｔｉａｔｅｓＴＮＦ－ｉｎｄｕｃｅｄａｐｏｐｔｏｓｉｓｔｈｒｏｕｇｈｔｈｅｄｏｗｎ－ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆＮＦ－ｋａｐｐａＢａｃｔｉｖａｔｉｏｎａｎｄＮＦ－ｋａｐ－ｐａＢ－ｒｅｇｕｌａｔｅｄａｎｔｉａｐｏｐｔｏｔｉｃｇｅｎｅｐｒｏｄｕｃｔｓ［Ｊ］．Ｉｍｍｕｎｏｌ，２００７，１７９（３）：１９２６－１９３３
［１９］ＳａｔｏＡ，ＯｙａＭ，ＩｔｏＫ，ｅｔａｌ．Ｓｕｒｖｉｖｉｎａｓｓｏｃｉａｔｅｓｗｉｔｈｃｅｌｌ
ｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｉｎｒｅｎａｌｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ：ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｓｕｒｖｉｖｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｂｙｉｎｓｕｌｉｎ－ｌｉｋｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ－１，ｉｎｔｅｒｆｅｒｏｎ－ｇａｍｍａａｎｄａｎｏｖｅｌＮＦ－ｋａｐｐａＢｉｎｈｉｂｉｔｏｒ［Ｊ］．ＩｎｔＪＯｎｃｏｌ，２００６，２８（４）：８４１－８４６
［收稿日期］
２００７－１２－２８
!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!
（上接第７１６页）
李薇等：ＮＦ－κＢ活化及ｌｉｖｉｎ，ｓｕｒｖｉｖｉｎ表达上调与胃癌细胞耐药的关系
第２８卷第６期２００８年６月
７４１・・。