阿萨伊油中β—谷甾醇及总甾醇含量测定和抗氧化活性研究

阿萨伊油中β—谷甾醇及总甾醇含量测定和抗氧化活性研究
建立阿萨伊油中甾醇类成分的含量测定方法，并对阿萨伊油的抗氧化活性进行评价。

采用高效液相色谱法建立了阿萨伊油中β-谷甾醇、总甾醇（β-谷甾醇、豆甾醇之和，以β-谷甾醇计）的含量测定方法。

采用Purosper STAR LP C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）色谱柱，以乙腈-异丙醇（30∶70）为流动相，流速1 mL·min-1，柱温为室温，蒸发光散射检测器漂移管温度70 ℃，雾化器流速2.0 L·min-1。

结果表明β-谷甾醇在0.766～6.38 μg线性关系良好，回归方程为Y=1.639X+0.702 7（r=0.999 2），平均加样回收率为95.7%（RSD 2.8%）。

阿萨伊油中β-谷甾醇的质量分数为1.85 mg·g-1，总甾醇的质量分数为1.93 mg·g-1。

同时采用总氧自由基清除能力（TOSC）法对阿萨伊油的抗氧化活性进行评价，结果表明样品具有显著的抗氧化能力，样品浓度和抗氧化能力具有较好的剂量-效应关系。

标签：阿萨伊; 高效液相色谱法; β-谷甾醇; 抗氧化剂; 总氧自由基清除能力
评价成分体外抗氧化能力的方法很多[6-7]，但大都不能反映机体总体抗氧化能力。

总氧自由基清除能力（total oxyradical scavenging capacity，TOSC）法是以顶空气相色谱法（headspace gas chromatography，HS-GC）为手段的以评价组分中任何可与氧自由基结合物质的抗氧化能力的指标，本文采用了TOSC法对阿萨伊油整体抗氧化活性进行了研究。

1 材料
Agilent 1100高效液相色谱仪（二极管阵列检测器，Alltech 2000蒸发光散射检测器），Agilent 6890N气相色谱仪（7694E Headspace Sampler顶空进样器，氢火焰离子化检测器），顶空进样瓶（安捷伦公司，10 mL）;SHZ-88台式水浴恒温振荡器（江苏太仓实验设备厂）。

甲醇（色谱纯，Fisher Scientific）;乙腈（色谱纯，Fisher Scientific）;异丙醇（色谱纯，Fisher Scientific）;4-甲硫基-2-氧丁酸钠（KMBA，Sigma）;2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐（ABAP，Sigma）;还原型谷胱甘肽（GSH，Sigma）;乙烯标准气体（纯度>99.9%，北京氧利来公司）;磷酸二氢钾，磷酸氢二钾，氢氧化钠，无水乙醇，三氯甲烷，浓硫酸（分析纯，国药试剂公司）;β-谷甾醇（纯度>98%），豆甾醇（纯度>95%）购自上海诗丹德生物技术有限公司。

阿萨伊冻干粉产于巴西帕拉州的阿萨伊，果实经过挑选、清洗、软化后，加水旋转搅拌磨碎，去除果核，过0.5 mm筛网后制成果浆，包装，冷冻储存。

阿萨伊果浆再经冷冻干燥，制成冻干粉。

阿萨伊果浆购自生产商巴西百利公司（Bela lacá Polpas de Frutas Indústria e Comércio Ltda）。

阿萨伊冻干粉由美国蒙纳维公司（MonaVie Inc）提供。

阿萨伊油（Petroleum ether extract，PEE）的制备：称取阿萨伊冻干粉，加石
油醚索氏提取，旋转蒸发回收溶剂至无石油醚味。

得深绿色油状液体，冷藏。

平行制备3批，平均收率为45.5%。

2 方法与结果
2.1 β-谷甾醇、总甾醇的含量测定
2.1.1 色谱条件和系统适用性试验Purosper STAR LP C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）;流动相乙腈（A）-异丙醇（B）梯度洗脱，0～25 min，30% B;25～26 min，30%～90% B;26～40 min，90% B。

流速1 mL·min-1;柱温室温;蒸发光散射检测器漂移管温度70 ℃、雾化器流速2.0 L·min-1;进样量10 μL。

在上述色谱条件下，各成分峰之间分离度良好，理论板数按β-谷甾醇计算应不低于5 000。

空白溶剂无干扰。

色谱图见图1。

1.β-谷甾醇;
2. 豆甾醇。

图1 阿萨伊油（A）和对照品（B）的HPLC-ELSD图
Fig.1 HPLC-ELSD chromatograms of sample solution（A）and standard solution （B）
2.1.2 对照品溶液的制备分别取对照品适量，精密称定，加流动相溶解并稀释制成每1 mL含β-谷甾醇、豆甾醇均约为0.25 mg的混合对照品溶液。

2.1.3 供试品溶液的制备精密称定阿萨伊油1 g，置于100 mL具塞锥形瓶中，加入1%硫酸乙醇溶液30 mL，摇匀，85 ℃水浴回流3 h。

放冷至室温，加入2 mol·L-1氢氧化钠乙醇溶液30 mL，摇匀，85 ℃水浴回流2 h。

放冷至室温，加入饱和氯化钠水溶液30 mL，摇匀，转移至分液漏斗中，石油醚萃取3次，每次40 mL。

合并石油醚层，水洗至中性。

石油醚层减压回收溶剂至干，加流动相溶解并定容至5 mL量瓶。

经0.45 μm微孔滤膜过滤，取续滤液即得。

2.1.4 线性关系的考察分别精密吸取对照品溶液3，4，5，6，8，10，15，20，25 μL注入液相色谱仪，以ln（进样量）为横坐标，ln（峰面积）为纵坐标，绘制标准曲线。

回归方程为Y=1.639X+0.702 7（r=0.999 2）。

结果表明β-谷甾醇在0.766～6.38 μg线性关系良好。

2.1.5 检测限、定量限分别精密吸取对照品溶液一定体积进样分析，确定β-谷甾醇检测限为0.26 μg（S/N=3），定量限为0.51 μg（S/N=10）。

2.1.6 精密度试验精密吸取同一供试品溶液10 μL，连续进样6次，记录色谱峰的峰面积，结果β-谷甾醇、总甾醇峰面积的RSD分别为2.8%，2.9%，表明仪器精密度良好。

2.1.7 稳定性试验取同一样品溶液，分别在0，1，2，3，4，5，6，8，10，12，24 h分别进样依法测定其峰面积。

β-谷甾醇、总甾醇峰面积的RSD分别为
2.3%，2.4%，表明供试品溶液稳定性良好。

2.1.8 重复性试验取同一批（批次1）阿萨伊油样品6份，按供试品方法制备，分别依法测定。

β-谷甾醇、总甾醇含量的RSD分别为2.8%，2.9%，表明本方法重复性良好。

2.1.9 加样回收试验精密称取已知含量的样品（批次1）约0.5 g共6份，分别加入同一浓度的对照品溶液（0.97 g·L-1）1 mL，按供试品溶液制备方法制备，依法测定，加样回收率符合要求，见表1。

2.1.10 样品的测定取3批阿萨伊冻干粉制备阿萨伊油，按供试品方法制备，分别依法测定。

阿萨伊油中β-谷甾醇的质量分数为1.85 mg·g-1（0.185%），总甾醇质量分数为1.93 mg·g-1（0.193%）。

阿萨伊冻干粉中β-谷甾醇平均质量分数为0.83 mg·g-1（0.083%），总甾醇质量分数（以β-谷甾醇计）为0.88 mg·g-1（0.088%）。

2.2 总氧自由基清除能力法（TOSC）测定阿萨伊油的抗氧化活性
2.2.1 TOSC测定待测样品TOSC 的计算公式为TOSC=100-（∫AS / ∫AC）×100。

式中∫AS ，∫AC分别为样品（有外加抗氧化剂）和对照（无外加抗氧化剂）反应系统中产生的乙烯量（以峰面积表示）。

当样品无抗氧化能力时，样品和对照中乙烯的峰面积相同，∫AS/∫AC =1，TOSC=0;相反，当样品抗氧化表1 β-谷甾醇加样回收率试验
Table 1 Recovery results of β-sitosterol
测定成分取样量/g样品中含量/mg加入量/mg测得量/μg回收率/%平均回收率/%RSD/%
β-谷甾醇0.498 70.913 0.971.82193.65 95.70 2.8
0.491 20.899 0.971.85298.26
0.489 80.896 0.971.80593.68
0.500 20.915 0.971.85897.18
0.475 60.870 0.971.77092.75
0.502 10.919 0.971.87698.68
总甾醇0.498 70.967 0.971.935 99.74 101.6 2.0
0.491 20.953 0.971.960 103.82
0.489 80.950 0.971.921 100.08
0.500 20.970 0.971.968 102.85
0.475 60.923 0.971.889 99.62
0.502 10.974 0.971.978 103.50
能力很强时，∫AS趋于0，此时TOSC接近100。

2.2.2 气相色谱条件HP-1毛细管色谱柱（0.32 mm×30 m×0.25 μm），载气氮气;进样口温度160 ℃，分流比2∶1;顶空条件：平衡温度50 ℃，定量环温度60 ℃，传输线温度70 ℃，平衡时间0 min，进样体积1 mL，进样时间1 min;柱流速1.0 mL·min-1;检测器FID，检测器温度220 ℃
2.2.3 对照溶液的制备取还原型谷胱甘肽适量，精密称定，加PBS溶解制成每1 mL含GSH 20 g·L-1对照溶液。

取对照溶液，加PBS，逐级稀释制成0.1，0.5，1，2，4，6，8，10 g·L-1系列浓度对照溶液。

2.2.4 供试品溶液的制备取阿萨伊油适量，精密称定，先用少量的乙醇溶解，再用PBS超声分散，制成每1 mL含PEE 20 g·L-1供试品溶液。

取供试品溶液，加PBS逐级稀释制成0.1，0.5，1，2，4，6，8，10 g·L-1系列浓度供试品溶液。

2.2.5 TOSC测定步骤在10 mL顶空瓶内分别先后加入0.25 mmol·L-1的KMBA 0.8 mL（0.1 mol·L-1磷酸钾缓冲液配制，pH 7.4），供试品溶液0.1 mL（对照中加入0.1 mL 磷酸钾缓冲液），0.2 mol·L-1的ABAP 0.1 mL，最终顶空瓶内的反应系统体积为1 mL，加盖密封后摇匀。

置于35 ℃水浴中恒温振荡1 h，立即放入顶空进样器中，进样体积1 mL进样分析。

经乙烯标准气进样分析，指认乙烯色谱峰位置。

结果见图2，3。

3 讨论
3.1 植物甾醇类成分的含量测定
3.1.1 样品前处理方法的选择植物甾醇常以游离态和结合态存在，结合态的甾醇主要以糖苷和羧
1.乙烯。

图2 对照色谱图（A）、样品（B）及乙烯标准气（C）的色谱图
Fig.2 GC chromatograms of sample solution（A，B）and standard gas（C）
图3 不同质量浓度GSH，PEE的TOSC
Fig.3 The TOSC of different concentrations of GSH，PEE
酸酯的形式存在。

因此，进样分析前应先进行酸水解，使以糖苷形式存在的甾醇游离;然后再经皂化使以羧酸酯形式存在的甾醇游离;由于植物甾醇常与油脂共存，经皂化使油脂生成可溶于水的钠皂或钾皂，而与不溶于水的甾醇分离[9];石油醚萃取甾醇的过程中，皂化液中加入饱和氯化钠溶液可盐析出大量白色皂化物，有利于石油醚萃取液澄清。

本研究先后对水解液酸浓度（0.5%，1%，2%硫酸乙醇），酸水解时间（1，2，3，4 h），皂化液碱浓度（1，2，3 mol·L-1），皂化时间（1，2，3 h），盐析用饱和氯化钠溶液的用量，萃取溶剂用量和次数进行了考察。

3.1.2 色谱条件的建立与甾醇色谱峰的指认本实验采用HPLC-DAD-ELSD 串联分析，以样品的DAD与ELSD色谱图结合全波长扫描信息，排除非甾醇色谱峰（无紫外吸收）的干扰，确定流动相组成比例;同时以β-谷甾醇、豆甾醇为对照，指认出经酸水解、皂化后，全部游离态甾醇色谱峰集中于色谱图上一定的范围（仅有β-谷甾醇、豆甾醇，未发现其他明显的峰）。

由于豆甾醇对照品的纯度低，不能作为含量测定用，且样品中豆甾醇含量较低，故阿萨伊油中总甾醇的含量计算采用各甾醇色谱峰峰面积加和，以β-谷甾醇计。

本研究先后对色谱柱种类（ODS C18，C8柱），流动相的组成（甲醇-水95∶5，90∶10，80∶20;乙腈-异丙醇60∶40，70∶30，80∶20），蒸发光散射检测器漂移管温度雾化器流速等参数进行优化，灵敏度、重复性好，各色谱峰分离良好，分析时间适中，满足连续进样的要求。

本研究测定了3批阿萨伊冻干粉中提取的阿萨伊油中植物甾醇的含量，阿萨伊中的植物甾醇以β-谷甾醇为主，还有少量豆甾醇。

已有研究采用气相色谱法测定阿萨伊中植物甾醇的含量[2]，本研究建立了高效液相色谱法检测阿萨伊油中植物甾醇的含量，检测结果与上述气相色谱法测定结果基本一致。

本研究所建立的供试品前处理方法以及检测方法为植物甾醇类成分含量测定提供了参考。

3.2 抗氧化活性的测定
本研究采用总氧自由基清除能力（TOSC）的方法对阿萨伊油的抗氧化活性进行评价，测定原理及定量方法根据Winston 等建立的方法[6-7]，ABAP 在35 ℃时可热解产生氧自由基，KMBA 在氧自由基的作用下会氧化产生乙烯，而抗氧化剂存在时可与KMBA 竞争与氧自由基结合而使乙烯的产生减少，从抗氧化剂存在或缺乏时乙烯产生的差别可计算所测定样品中存在的抗氧化剂的总量。

TOSC方法最大的优越性是其所测定的抗氧化能力包含了任何可与氧自由基结合的物质所发挥的作用，因而反映的是机体所具有的总抗氧化能力，这是单项抗氧化剂指标所无法比拟的。

结果显示供试品的TOSC与其浓度呈正相关，样品浓度和抗氧化能力具有较好的剂量-效应关系。

以抗氧化剂还原性谷胱甘肽做对照，当质量浓度为0.1 g·L-1时，阿萨伊油的TOSC值（抗氧化能力）相当于还原型谷胱甘肽的20%;当质量浓度大于6 g·L-1时，阿萨伊油的TOSC值（抗氧化能力）相当于还原型谷胱甘
肽的80%以上，表明在相对高浓度时阿萨伊油具有显著的抗氧化能力。

本研究以南美草药阿萨伊为研究对象，对阿萨伊油中植物甾醇及阿萨伊油的抗氧化活性进行了测定和评价，为建立全面的阿萨伊质量评价方法奠定了基础。

阿萨伊及其油中其他类成分及其抗氧化活性有待进一步研究。

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Determination of β-sitosterol and total sterols content and antioxidant
activity of oil in acai （Euterpe oleracea）
HE Cheng，LI Wei，ZHANG Jian-jun，QU Sheng-sheng，LI Jia-jing，WANG Lin-yuan*
（Beijing University of Chinese Medicine，Beijing 100029，China）
[Abstract] In order to establish a method for the determination of the sterols of the oil in the freeze-dried acai （Euterpe oleracea Mart.）and to evaluate its antioxidant activities，a saponification/extraction procedure and high performance liquid chromatography （HPLC）analysis method were developed and validated for the analysis of phytosterols in PEE（Petroleum ether extract）. Separation was achieved on a Purosper STAR LP C18 column with a binary，gradient solvent system of acetonitrile and isopropanol. Evaporative light scattering detection （ELSD）was used to quantify β-sitosterol and the total sterols. Peak identification was verified by retention times and spikes with external standards. Standard curves were constructed （r=0.999 2）to allow for sample quantification. Recovery of the saponification and extraction was demonstrated via analysis of spiked samples. The highest content of total sterols is β-sitosterol. The antioxidant activities of the extracts were evaluated using the total oxyradical scavenging capacity assay（TOSC assay）.The result showed that the PEE exhibited significant antioxidant properties，sample concentration and the antioxidant capacity had a certain relevance.
[Key words] Euterpe oleracea; acai; HPLC; β-sitosterol; antioxidant; TOSC assay
doi：10.4268/cjcmm20142327。